NTC4516_MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOSDE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DELNÚMERO MÁS PROBABLE

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 2009-11-18

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

E:

MICROBIOLOGY MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE DETECTION AND ENUMERATION OF COLIFORMS. MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE

CORRESPONDENCIA:

esta norma es idéntica (IDT) con respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4831-2006.

DESCRIPTORES:

microbiología microbiología de alimentos; alimentos para consumo humano; alimentación animal; método horizontal; detección de coliformes; método de NMP.

I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción

Primera actualización Editada 2009-11-25

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4516 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-11-18. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ALCALDÍA DE BOGOTÁ - ARCHIVO BOGOTÁ AVESCO S.A. -KOKORIKOBASIC FARMA S.A. BIFAR EU CARULLA VIVERO S.A. COMPAÑIA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. ENZIPAN LABORATORIOS S.A. FILTRACIÓN Y ANÁLISIS LTDA.

GAE LTDA. INDALPE LTDA. IVONNE BERNIER LABORATORIO LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIOS SFC LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES - LEMA-

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ACEGRASAS S.A. ACUAGYR S.A. E.S.P. ALGARRA S.A. ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. AQUALAB AREPAS DOÑA ALEJA ASBIOQUIM LTDA. ASEBIOL ASINAL ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTEC ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA

BAVARIA S.A. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CASA LUKER CERVECERÍA LEONA S.A. COLOMBIANA S.A. CONGELAGRO S.A. CONSERVAS COLOMBINA S.A. -LA CONSTANCIACORPOICA -CORPOLABCORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA

MICROS DUPONT QUALICON EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. JOHNSONDIVERSEY KLIK S.A. LA CAMPIÑA LABORATORIO A.B.B.A. LABORATORIO BIOCONTROL LTDA.

LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LESNIAK EU MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA. MULTIDIMENSIONALES S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA QUIK LTDA. ROCHE DIAGNOSTICS SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO LTDA. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN


NTC 4516 (Primera actualización)

CONTENIDO Página INTRODUCCIÓN...........................................................................................................................1 1.

ALCANCE .........................................................................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS .......................................................................................2

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES .........................................................................................2

4.

PRINCIPIO.........................................................................................................................3

4.1

DETECCIÓN DE COLIFORMES......................................................................................3

4.2

ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP.....................................................3

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES..........................................................................3

5.1

GENERALIDADES............................................................................................................3

5.2

DILUYENTES ....................................................................................................................4

5.3

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA ...................................................................................................... 4

5.4

MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE.........................................................................................................4

6.

EQUIPO Y VIDRIERÍA ......................................................................................................5

7.

MUESTREO.......................................................................................................................5

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO ..........................................................6



Página 9.

PROCEDIMIENTO ...........................................................................................................6

9.1

MÉTODO DE DETECCIÓN .............................................................................................6

9.2

MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) ..........................................................................7

10.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ......................................................8

11.

PRECISIÓN .......................................................................................................................8

12.

INFORME DE ENSAYO....................................................................................................8

BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................................13 DOCUMENTO DE REFERENCIA ..............................................................................................14 ANEXOS ANEXO A (Normativo) DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO ............................................................ 9 ANEXO B (Informativo) ...............................................................................................................12



MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

INTRODUCCIÓN Debido a la gran variedad de alimentos y productos de alimentación, este método horizontal puede no ser adecuado en todo detalle para algunos productos. En este caso, se pueden utilizar métodos diferentes específicos para tales productos, si es absolutamente necesario por razones técnicas justificadas. Sin embargo, se debería realizar todo el esfuerzo para aplicar este método horizontal en la medida de lo posible. La técnica descrita en esta norma permite realizar un examen microbiológico en una porción de ensayo más grande permitiendo así la detección de un número más bajo de coliformes por gramo o mililitro de producto. Para los propósitos de un método de ensayo factible, la definición de "coliformes" indicada en la sección 3 y utilizada como base para el procedimiento, no necesariamente es idéntica a las definiciones correspondientes indicadas en otros textos publicados. Una proporción de las cepas de los microorganismos descritos en otros textos publicados como "coliformes" (incluyendo Escherichia coli ) no produce suficiente gas para ser detectable mediante la utilización de un tubo Durham (es decir, las "cepas anaerógenas"). Por lo tanto, el método descrito en esta norma no detecta a todas las cepas de los microorganismos a los que se hace referencia en otras publicaciones como "coliformes (presuntivo)" (por ejemplo, algunas cepas de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella ) (véase referencia [2]).

1.

ALCANCE

Esta norma suministra directrices generales para la detección y la enumeración de coliformes. Se aplica a: -

productos destinados para consumo humano y para alimentación de animales, y

-

muestras ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos.

La enumeración se realiza mediante el cálculo del número más probable después de la incubación en un medio líquido a 30 °C ± 1 °C o 36° ± 1 °C.

1 de 14



NOTA La temperatura está sujeta al tipo de producto. En el caso de la leche y los productos lácteos, la temperatura de incubación es de 30 °C ± 1 °C.

Este método de enumeración se aplica cuando se espera que el número que se busca esté en el rango entre 1 ml y 100 por ml o por gramo de muestra de ensayo. Una limitación en la aplicabilidad de esta norma está impuesta por la susceptibilidad del método a un amplio grado de variabilidad. La información suministrada en el numeral 11 brinda directrices sobre la aplicabilidad del método y sobre la interpretación de los resultados.

2

REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección). NTC 4092, Microbiología de alimentos y productos para alimentación animal. Requisitos generales y directrices para análisis microbiológicos. NTC 4491 (todas las partes), Microbiología de alimentos y alimentos para animales – Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1. reglas Generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. guía para la preparación y producción de medios de cultivo. guía general para el aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo en el laboratorio. GTC 171, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación de medio de cultivo. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de cultivo. ISO FDIS 6887-5:200 9, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Preparation of Test samples, Initial Suspension and Decimal Dilutions for Microbiological Examination - Part 5: Specific Rules for the Preparation of Milk and Milk Products.

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propósitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones.

3.1 Coliformes. Bacterias Gram negativas que, a una temperatura especificada (30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C, según producto), produce fermentación de la lactosa con producción de gas, bajo las condiciones de ensayo que se especifican en esta norma. 3.2 Detección de coliformes. Determinación de la presencia o ausencia de estas bacterias, en una cantidad particular de producto, cuando se realizan ensayos de acuerdo con el método que se especifica en esta norma. 3.3 Enumeración de coliformes. Número más probable de coliformes hallados por mililitro o por gramo de muestra de ensayo, cuando el ensayo se realiza según el método que se especifica en esta norma. 2

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 4.

PRINCIPIO

4.1

DETECCIÓN DE COLIFORMES


4.1.1 Un tubo con caldo de enriquecimiento selectivo se inocula con la porción de ensayo y se incuba a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h o 48 h. 4.1.2 Un tubo con medio de confirmación se inocula con el contenido del tubo obtenido del numeral 4.1.1 cuando se ha observado la formación de turbidez o gas o ambos, y se incuba a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h o 48 h. 4.1.3 La presencia de coliformes se confirma en el caso en que se haya observado la formación de turbidez y gas después del examen del tubo obtenido del numeral 4.1.2. 4.2

ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP

4.2.1 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con doble concentración se inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo, si el producto inicial es líquido, o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros productos. 4.2.2 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con una concentración sencilla se inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo, si el producto inicial es líquido, o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros productos. Después, bajo las mismas condiciones, se inoculan con diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial tubos adicionales que contengan medio con una concentración sencilla. 4.2.3 Los tubos que contienen el medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración se incuban a 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h, y los tubos que contienen el medio con concentración sencilla se incuban durante 24 h o 48 h, después de este periodo estos tubos se examinan para determinar la formación de gas o la turbidez que presume la detección de la formación de gas. 4.2.4 Una serie de tubos con el medio de confirmación se inoculan con los cultivos provenientes de los tubos del medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración y con los cultivos de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla, en los cuales se ha observado la formación de gas o la turbidez que presume la detección de la formación de gas. 4.2.5 Los tubos que se obtienen en el numeral 4.2.4 se incuban a 30 °C ± 1 °C o 36 °C (según acuerdo) durante 24 h o 48 h y se examinan para determinar la formación de gas.

±

1 °C

4.2.6 Se calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra (es decir, el NMP) a partir de la cantidad de tubos en la serie nueva (véase el numeral 4.2.5) que muestran formación de gas. Se utiliza una tabla para determinar el número más probable. 5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

5.1

GENERALIDADES

Véase la NTC 4092 con respecto a la preparación, producción y ensayo de desempeño de los medios de cultivo. 3

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.2


DILUYENTES

Véase la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional específica para el producto que se está examinando.

5.3

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA

5.3.1 Composición a) Medio con doble concentración

b) Medio con concentración sencilla

Producto de la digestión enzimática de la leche y proteínas animales

40 g

20 g

Lactosa (C12H22O11 ·H2O)

10 g

5g

Fosfato hidrógeno de dipotasio (K2HPO4)

5,5 g

2,75 g

Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4)

5,5 g

2,75 g

Cloruro de sodio

10 g

5g

Lauril sulfato de sodio

0,2 g

0,1 g

1 000 ml

1 000 ml

Agua

5.3.2 Preparación Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante calentamiento, si es necesario. Ajuste el pH según la NTC 4092, si es necesario, de manera que después de la esterilización esté en 6,8 ± 0,2 a 20 - 25 °C. Dispense el medio en cantidades de 10 ml en tubos con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.4) que contengan tubos Durham (véase el numeral 6.5) en el caso del medio concentración sencilla, y en tubos con dimensiones aproximadas de 20 mm x 200 mm (véase el numeral 6.4) [que no contengan tubos Durham (véase el numeral 6.5)] en el caso del medio con doble concentración. Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

5.3.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo de desempeño con respecto al caldo lauril sulfato triptosa se encuentra en la GTC 171,

5.4

MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE

5.4.1 Composición Producto de la digestión enzimática de la caseína

10 g

Lactosa (C12H22O11·H20)

10 g

Bilis de buey deshidratado

20 g 4



Verde brillante

0,013 3 g

Agua

1 000 ml

5.4.2 Preparación Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante calentamiento, si es necesario. Ajuste el pH, según la NTC 4092, si es necesario, de manera que después de la esterilización esté en 7,2 ± 0,2 a 20 - 25 °C. Dispense el medio en cantidades de 10 ml en los tubos de ensayo de aproximadamente 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.4) que contienen los tubos Durham (véase el numeral 6.5). Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

5.4.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo de desempeño con respecto al caldo lactosa bilis verde brillante se encuentra en la GTC 171.

6.

EQUIPO Y VIDRIERÍA

Equipo común de laboratorio de microbiología (véase la NTC 4092), en particular, el siguiente.

6.1

Equipo para estilización en seco (horno) o para esterilización en húmedo (autoclave).

Véase la NTC 4092.

6.2

Incubadora, con capacidad de funcionamiento a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C.

6.3 Asas, de platino-iridio o níquel-cromo, con diámetro aproximado de 3 mm, o asas desechables. 6.4

Tubos de ensayo, con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm y 20 mm x 200 mm.

6.5 Tubos Durham, con un tamaño adecuado para su uso en los tubos de ensayo con dimensiones de 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.4). 6.6

Pipetas de descarga total, con capacidad nominal de 1 ml y 10 ml.

6.7

pHmetro, con exactitud de ± 1 unidad de pH a 25 °C.

7.

MUESTREO

El muestreo se debería realizar de acuerdo con la norma internacional específica correspondiente para el producto en cuestión. Si no existe una norma internacional, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema. 5

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 8.


PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión. Si no existe norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.

9.

PROCEDIMIENTO (véase el Anexo A)

9.1

MÉTODO DE DETECCIÓN (véase la Figura A.1)

9.1.1 Porción de ensayo y suspensión inicial Véase la NTC 4491 y el DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión.

9.1.2 Inoculación e incubación 9.1.2.1 Dependiendo del límite de detección que se requiera, se transfieren x ml de la muestra de ensayo si es líquida, o x ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos, a un tubo que contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración [véase el numeral 5.3.1a)] cuando x esté entre 1 ml y 10 ml, o a un tubo que contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla [véase el numera 5.3.1b)] cuando x ≤ 1 ml. 9.1.2.2 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.1.2.1) en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h. 9.1.2.3 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (véase el numeral 9.1.2.1) en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado formación de gas o turbidez que presuma la detección de dicha formación en esta etapa, continúe la incubación por otras 24 h ± 2 h. 9.1.3 Confirmación (véase la Figura A.3) 9.1.3.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa (véase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5.4). Incube a temperatura de 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado formación de gas en esta etapa, durante 48 h ± 2 h. 9.1.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.1.3.1 para los tubos incubados según el numeral 9.1.2.3 que muestren formación de gas o turbidez que presuma la detección de la formación de gas, cuando cualquiera de estas características se observe primero (es decir, después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h). 9.1.4 Interpretación (véase la Figura A.1) Un tubo de los suministrados según los numerales 9.1.3.1 o 9.1.3.2 en el cual se observó la formación de gas después de 24 h ± 2 h o de 48 h ± 2 h se considera un tubo positivo.

6

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 9.2


MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) (véase la Figura A.2)

9.2.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones Véase la NTC 4092 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión. Prepare una cantidad suficiente de diluciones para garantizar que todos los tubos correspondientes a la dilución final produzcan un resultado negativo.

9.2.2 Inoculación e incubación 9.2.2.1 Es común que exista una combinación de tres tubos para cada serie de diluciones. Sin embargo, para algunos productos o cada vez que se requieran resultados de mayor exactitud, exactitud o ambos casos, puede ser necesario inocular series que consten de más de tres tubos (por ejemplo de cinco tubos). En estos casos, para el cálculo del número más probable, consulte las tablas correspondientes que se incluye en la NTC 4092. 9.2.2.2 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración [véase el numeral 5.3.1a)]. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.6) transfiera a cada uno de estos tubos 10 ml de la muestra de ensayo, si es líquida, o 10 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos. 9.2.2.3 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla [véase el numeral 5.3.1b)]. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.6) transfiera a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra de ensayo, si es líquida, o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos. 9.2.2.4 Para cada una de las diluciones adicionales, continúe tal como se describe en el numeral 9.2.2.3. Utilice una pipeta estéril para cada dilución. Mezcle cuidadosamente el inóculo y el medio. 9.2.2.5 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.2.2.2) en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h. 9.2.2.6 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (veánse los numerales 9.2.2.3 y 9.2.2.4) en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado la formación de gas o de turbidez que presuma la detección de dicha formación en esta etapa, continúe la incubación durante 24 h ± 2 h adicionales. 9.2.3 Confirmación (véase la Figura A.3) 9.2.3.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa (véase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5.4). Incube a temperatura 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado formación de gas en esta etapa, durante 48 h ± 2 h. 9.2.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.2.3.1 para los tubos incubados según el numeral 9.2.2.6 que muestren formación de gas o turbidez que presume la detección de la formación de gas, cuando se observe cualquiera de estas características (es decir, después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h). 7



9.2.4 Interpretación (véase la Figura A.2) Para cada dilución, cuente la cantidad total de tubos en los cuales se observó la formación de gas en el paso del numeral 9.2.3 (tubos positivos) después de 24 h ± 2 h y (si se utiliza) 48 h ± 2 h.

10.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

De acuerdo con los resultados de la interpretación (véase el numeral 9.1.4), indique la presencia o ausencia de coliformes en la porción de ensayo de x g o x ml de producto (véase la NTC 4092). Calcule el número más probable a partir del número de tubos positivos en cada dilución (véase la NTC 4092).

11.

PRECISIÓN

Se reconoce que se pueden presentar amplias variaciones en los resultados con la técnica del NMP. Por lo tanto, los resultados obtenidos utilizando este método se deberían utilizar con precaución. Los límites de confianza se suministran en la NTC 4092.

12.

INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar: -

toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra,

-

el método de muestreo utilizado, si se conoce;

-

el método de ensayo utilizado, con referencia a esta norma nacional;

-

el objeto del ensayo y la temperatura de incubación utilizada;

-

todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o se consideran opcionales, junto con los detalles de todo incidente que haya podido tener influencia en los resultados;

-

los resultados obtenidos.

8


NTC 4516 (Primera actualización) ANEXO A (Normativo)

DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO

Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos) D

10 ml

1 ml

1 Tubo con medio de concentración doble (9.1.2.1)

1 Tubo con medio de concentración sencilla (9.1.2.1)

Proceder de la misma forma

Incubación por 24 h +/- 2 horas (9.1.2.2) D + 1

Incubación por 24 h +/- 2h o 48 h +/- 2 h (9.1.2.3)

Inoculación (9.1.3.1)

D + 2


Incubación por 24 h +/- 2h o 48 h +/- 2 h

(+)

1er caso

D + 3

Interpretación (+) (9.1.4)

1er caso

(-)

(-)

2docaso

Incubación por 24 h +/- 2h o 48 h +/- 2 h

2docaso D + 4

(+)

(-)

1er caso

Figura A.1. Método de detección

9

Interpretación (9.1.4)

2docaso

3er caso



Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos) 10 ml

D

1 ml

3 Tubos con medio de concentración doble (9.1.2.2)

3 Tubos con medio de concentración sencilla (9.2.2.3)

Proceder de la misma forma

Incubación por 24 h +/- 2 horas (9.2.2.5) D + 1



D + 2



(+)

1er caso

D + 3

Interpretación (+) (9.2.4)

1er caso

(-)

(-)

2docaso


2docaso D + 4

(+)

1er caso

(-)

2docaso

Figura A.2. Método de enumeración

10

Interpretación (9.2.4)

3er caso


Antes de la incubación


Formación de gas (+)

Después de la incubación Turbidez No formación de gas (-)

Asas (6.3)

Tubo con medio de doble concentración (5.3a)

Tubos con medio de concentración sencilla (5.3b)

Figura A.3. Detalles de la etapa de confirmación

11


NTC 4516 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo)

MEDIOS DE CULTIVO Otro medios de cultivo indicados para la fase de confirmación aparecen relacionados en la GTC 125. Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para bebidas, alimentos y alimentos para animales.

12


NTC 4516 (Primera actualización) BIBLIOGRAFÍA

[1]

ISO 4832, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Coliforms. Colony-Count Technique .

[2]

Edward, P.R. and Ewing, W.H., Identification of Enterobacteriaceae, 3 rd edn., Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, USA, 1972.

13



DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Detection and Enumeration of Coliforms. Most Probable Number Technique. Geneva: ISO, 2006, 12 p (ISO 4831:2006 (E)).

14

NTC4516_MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOSDE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DELNÚMERO MÁS PROBABLE

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