TRUNG TÂM Y TẾ KHÁNH VĨNH KHOA XÉT NGHIỆM - CĐHA
NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY PHÂN TÍCH TẾ BÀO MÁU TỰ ĐỘNG
(Lưu hành nội bộ Khoa)
__________ Mở
đầu __________
Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo dòng (flow (flow cytometry) là nguyên nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và một điện trường. Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bào khác nhau nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào. Các máy đếm tế bào hiện nay đang được sử dụng có thể chia làm 2 loại: 1) Máy đếm tế bào nguyên nguyên lý tổng trở: trở: phân biệt biệt từng loại tế bào dựa vào vào kích thước tế bào. 2) Các Các máy thế hệ sau: ứng dụng dụng laser và xung xung điện đa chiều chiều nên có tốc độ cao và phân loại tế bào chính chính xác hơn. - Với Với những những máy máy sản xuất xuất trước trước năm năm 1996, 1996, khả khả năng năng phân phân loại loại chín chínhh xác các các thành phần bạch cầu nói chung không quá 90%. - Các Các máy mod model el gần gần đây, đây, với việc việc áp áp dụng dụng tổng tổng hợp các các cơ chế chế tổng tổng trở, trở, xung xung điện đa chiều, laser nên khả năng nhận diện tế bào được nâng đến 95%. -
Một số serial máy có thể phân biệt được các loại bạch cầu ưa acid, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợp với các phương pháp nhuộm men Peroxydase, nhuộm ARN/AND, nhuộm huỳnh quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT, Se-Advance của hãng Sysmex…)
Bài viết này xin đề cập đến nguyên lý hoạt động của máy Sysmex KX21 và những biện luận xung quanh vấn đề này./.
__________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
2
NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY HUYẾT HỌC SYSMEX KX-21 VÀ BIỆN LUẬN CÁC THÔNG SỐ KẾT QUẢ I. NGUYÊN LÝ ĐẾM TẾ BÀO MÁU TRÊN MÁY SYSMEX KX-21 1. Phương pháp điện trở kháng: -
DC
Mẫu máu được hút và pha loãng trong dung dịch điện phân theo 1 tỷ lệ nhất định. Sau đó được dẫn vào buồng đếm.
C
- Cấu tạo buồng đếm:
R
- 1 khe đếm. - 2 đi điện cự cực (â (âm, dương ng). ).
(+)
(-)
- Dòng Dòng điện điện 1 chi chiều ều đi qu quaa 2 điện điện cực. cực. -
Vì tế bào máu được coi như không dẫn điện nên khi 1
Phương pháp pháp điện trở kháng kháng
tế bào máu đi ngang qua lỗ khe đếm sẽ làm dịch chuyển một lượng dung dịch muối tương ứng với thể tích tế bào; đồng thời làm ngắt quãng dòng điện, dẫn đến thay đổi hiệu điện thế giữa 2 điện cực (tăng điện trở), tạo ra 1 xung điện. -
Các xung điện thay đổi này có thể đếm được, thể hiện số lượng tế bào. Độ lớn của mỗi xung tỷ lệ với thể tích của từng loại tế bào. Trung bình độ lớn của các xung điện chính là thể tích trung bình của tế bào (MCV).
1.2 Phương pháp quang học (đo nồng độ Hemoglobin): -
Hồng cầu được làm ly giải và giải phóng Hb. Sau đó, Hb được chuyển thành Cyanmethemoglobin, mật độ quang của dung dịch này (đo ở bước sóng 555 nm) tỷ lệ thuận với lượng Hb trong máu.
__________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
3
II. SƠ ĐỒ HỆ THỐNG PHÂN TÍCH CỦA MÁY SYSMEX KX-21 (1.960 mL)
Dung dịch pha loãng (1:500)
(1.996 mL) Buồng pha loãng (4 µL)
(1.994 mL)
Dung dịch ly giải
(1.0 mL)
Buồng đếm HC/TC (40 µL) (1:25000) (1:500) Buồng đếm Bạch cầu
Hệ thống hút mẫu (6 µL) Máu toàn phần
Buồng đo Hb
(50 µL)
(1:500)
1. Nguyên tắc chung trong đếm số lượng tế bào: -
Tế bào có kích thước 02 – 0 – 030 fL: Tiểu cầu.
- Tế bào có kích kích thướ thướcc 25 – 250 250 fL: fL: Hồng Hồng cầu. cầu. Tế bào có kích thước 30 – 300 fL: Bạch cầu.
-
+ Tế bào có kích thước 030 – 0 – 080 fL: Lymphocytes. + Tế bào có kích thước 080 – 130 fL: Monocytes, Basophils, Eosinophils.
+ Tế bào bào có kích kích thước thước 130 130 – 300 300 fL: fL: Neutr Neutroph ophils ils.. 2. Phân tích Bạch cầu/Hb: Dung dịch pha loãng
(1.994 mL)
Hệ thống hút mẫu
Dung dịch ly giải (1 mL) Buồng đếm Bạch cầu (1:500)
Máu toàn phần
Buồng đo Hb (1:500)
(6 µL)
2.1 Tại buồng đếm Bạch cầu: __________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
4
-
Máu sau khi được pha loãng sẽ bị ly giải thành phần Hồng cầu.
-
Thành phần còn lại: Bạch cầu, Tiểu cầu, Hồng cầu có nhân, Hồng cầu có KSTSR, Hồng cầu có độ bền cao (trong bệnh Thalassemi). Biện luận: -
Tiểu cầu có thể tích trung bình 10 fL (2 – 30 fL). Nếu 4 Tiểu cầu dính lại với
nhau sẽ có kích thước 40 fL, tương đương với 1 Lymphocyte. - Giả sử SLTC SLTC bình thường thường là 200 G/L, G/L, SLBC SLBC bình thường thường 10 G/L. G/L. + Nếu SLTC ở trên ngưng tập theo nguyên tắc 10 Tiểu cầu = 1 Bạch cầu thì
200.109 Tiểu cầu tương đương với 20.109 Bạch cầu. + Như vậy, vậy, SLBC SLBC tăng giả tạo thành 10 + 20 = 30 G/L. G/L.
Kết luận: - Nếu Tiểu Tiểu cầu cầu giảm giả tạo (do ngưng ngưng tập, kết dính) dính) sẽ làm tăng tăng SLBC. SLBC.
- Thực Thực tế, tế, nếu nếu SLT SLTC C giả giảm, m, SLBC SLBC tăng tăng:: + Cần phải kéo lam đánh giá độ ngưng ngưng tập Tiểu Tiểu cầu. cầu. + Đếm Đếm lại lại SLBC SLBC trên trên buồng buồng đếm. đếm. Áp dụng thực tế: Để tránh sự ngưng tập, kết dính Tiểu cầu do chủ quan, cần phải: - Lượng Lượng chất chất chống chống đông đông tương tương đươ đương ng với với thể thể tích tích máu máu.. - Sau khi lấy lấy máu máu xong xong phải phải cho cho ngay ngay vào vào tube tube chống chống đông và lắc lắc trộn trộn đều kỹ ngay sau đó. 2.2 Tại buồng đo Hb:
Nguyên tắc: -
Hồng Hồng cầu cầu được được làm làm ly giải giải và và giải giải phóng phóng Hb. Hb. Sau Sau đó, đó, Hb được được chuy chuyển ển
thành Cyanmethemoglobin, mật độ quang của dung dịch này (đo ở bước sóng 555 nm) tỷ lệ thuận với lượng Hb trong máu. Biện luận: -
Hb được đo theo nguyên tắc quang học. Do đó, những nguyên nhân nào làm
tăng mật độ quang của huyết tương sẽ làm tăng nồng độ Hb giả tạo. Ngược lại, __________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
5
đối với những trường hợp giảm nồng độ Hb giả tạo có thể do Hồng cầu chưa được ly giải hoàn toàn. -
Những nguyên nguyên nhân làm tăng tăng nồng độ Hb giả giả tạo:
+ Tăng Lipid máu (huyết tương có màu trắng). + Số lượng Bạch cầu tăng cao, trên 50 G/L (huyết tương có màu trắng).
+ Vàng Vàng da da (huyế (huyếtt tương tương có màu màu vàng) vàng).. + Tan Tan máu máu (huyết (huyết tương tương có có màu màu đỏ). đỏ). - Nhữn Nhữngg nguyê nguyênn nhâ nhânn làm làm giảm giảm nồng nồng độ Hb Hb giả giả tạo: tạo: + Dung Dung dịch dịch ly giải giải hỏng hỏng (Hồng (Hồng cầu cầu chưa chưa ly giải giải hoàn hoàn toàn) toàn).. + Hồng cầu bị ngưng kết (chỉ ly giải 1 phần ở ngoài của cụm Hồng cầu).
Áp dụng thực tế: - Tốt nhất nhất nên nên lấy máu lúc bệnh bệnh nhân chưa chưa ăn uống uống gì (trán (tránhh tăng tăng Lipid Lipid máu) máu).. - Tránh Tránh ly giả giảii Hồng Hồng cầu cầu tro trong ng quá quá trìn trìnhh lấy lấy máu. máu. -
Lượng chất chống đông phù hợp với thể tích máu.
- Sau khi lấy lấy máu máu xong xong phải phải cho cho ngay ngay vào vào tube tube chống chống đông và lắc lắc trộn trộn đều kỹ ngay sau đó. 3. Phân tích Hồng cầu/Tiểu cầu: Dung dịch pha loãng loãng
(1.960 mL) (1.996 mL) Hệ thống hút mẫu
(1:500)
Buồng pha loãng
Buồng đếm HC/TC (1:500)
Máu toàn phần
(4 µL)
(40 µL)
Thành phần trong buồng đếm Hồng cầu: Hồng cầu, Tiểu cầu, Bạch cầu. Như vậy,
dựa vào nguyên tắc phân biệt tế bào theo kích thước thì Bạch cầu (có khi Tiểu cầu khổng lồ) sẽ được đếm vào trong Hồng cầu. __________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
6
Biện luận 1: -
Hồng cầu tăng giả tạo do Bạch cầu tăng quá cao ( > 50 – 100 G/L).
-
Tiểu cầu tăng giả tạo: + Do Hồng cầu vỡ thành nhiều mảnh.
+ Do Hồng cầu kích kích thước thước quá nhỏ (MCV (MCV < 65 fL). fL). + Do tron trongg mẫu mẫu máu máu có bụ bụi. i. + Do máy máy tiếp tiếp đất không không tốt tốt gây hiện hiện tượng tượng nhiễu nhiễu nên các các xung xung điện điện nhỏ sẽ được máy ghi nhận là các Tiểu cầu. -
Tiểu cầu giảm giả:
+ Do Tiểu cầu bị ngưng tập: lấy máu quá lâu làm hoạt hóa Tiểu cầu hoặc lấy
máu vào tube thủy tinh là Tiểu cầu kết dính vào thành tube rồi hoạt hóa và kết dính. + Do Tiểu Tiểu cầu cầu tập tập trung trung xung quanh quanh Bạch Bạch cầu. cầu. Biện luận 2: Đánh giá “Ngưng kết Hồng cầu” - Ngưn Ngưngg kết kết Hồng Hồng cầu cầu có có thể thể do do:: + Ngưng Ngưng kết kết nóng: nóng: xảy xảy ra nhau nhau trong trong cơ thể (do Khán Khángg thể). thể). + Ngưng Ngưng kết kết lạnh: lạnh: xảy ra khi khi máu máu ra khỏi khỏi cơ thể. thể. - Khi Khi đo, đo, kết kết qu quảả phâ phânn tíc tíchh trên trên máy máy sẽ sẽ là: là: + Bạch cầu:
Tăng/Bình thường.
+ Hồng cầu:
Giảm nhiều.
+ Tiểu cầu:
Bình thường (không ảnh hưởng).
+ Hb:
Bình thường/Giảm nhẹ.
+ MCV:
Tăng có mức độ (<125 fL).
+ HCT:
Giảm nhiều (do Hồng cầu giảm nhiều).
+ MCH:
Tăng nhiều.
+ MCHC:
Tăng nhiều.
Kết luận: Để đánh giá sự “Ngưng kết Hồng cầu”, ta dựa vào: - MCH và MCHC (tăng nhiều). - SLHC và HCT (giảm nhiều). nhiều). __________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
7
Tóm tắc: Các nguyên nhân gây sai số về số lượng Hồng cầu Hồng cầu bị ngưng kết (tan máu tự miễn): số lượng Hồng cầu giảm, MCV
-
tăng, MCHC cao (trên 380 g/L). Trường hợp này sử dụng được kết quả Hemoglobin, Hemoglobin, còn Hematocrit thì sử dụng phương pháp ly tâm vi thể tích hoặc ủ mẫu máu ở 37 0C trong vòng 30 phút rồi đếm lại. Cần kiểm tra kỹ ống máu khi nhận bệnh phẩm. -
Tăng độ nhớt huyết tương: với thời gian và áp lực hút thông thường của máy
đếm tế bào có thể gây ra giảm 3 dòng ngoại vi giả tạo do máu bị quánh nên máy hút không đủ máu. -
Lắc ống máu không kỹ: nếu hút ở phần trên của ống máu sẽ gây hiện tượng
giảm Hồng cầu rõ rệt và không tương ứng với tình trạng lâm sàng. Nếu hút ở phần đáy ống sẽ gây tăng Hồng cầu giả tạo, đồng thời gây giảm rõ rệt số lượng Tiểu cầu. Cần kiểm tra và đối chiếu số lượng Tiểu cầu trên lam nhuộm Giemsa. -
Do Hồng cầu nhỏ, Tiểu cầu to, cụm Tiểu cầu, mảnh Hồng cầu, tan máu, rối
loạn đông máu, Bạch cầu quá nhiều… -
Máu bị đô đông, Hồng cầu bị bị vỡ ho hoặc lư lượng má máu lấy là làm xét ng nghiệm không
đủ… đều dẫn đến sai kết quả. Chú ý: MCHC (g/L) 320 – 360 < 300 300 – 360 > 360
Ý nghĩa Bình thường Hồng cầu nhược sắc Hồng cầu bình sắc Không khẳng định được Hồng cầu ưu sắc (Vì Hồng cầu đã bão hòa Hb, không dung nạp thêm)
__________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
8
III. CÔNG THỨC TÍNH TOÁN VÀ SUY LUẬN 1. Công thức tính toán các thông số: -
HCT RBC HGB MCH (Mean Corpuscular Hb): MCH RBC
MCV (Mean Corpuscular Volume): MCV
=
=
MCHC (Mean Corpuscular Hb Concentration): Concentration): MCHC
HGB =
HCT
2. Các thông số máy Sysmex KX21 đo được: -
MCV: Trung bình độ lớn của các xung điện đo được.
-
Số lượng Hồng cầu: Tổng số xung điện đo được tại buồng đếm Hồng cầu/Tiểu cầu.
-
Số lượng Bạch cầu: Tổng số xung điện đo được tại buồng đếm Bạch cầu/Hb.
-
Số lượng Tiểu cầu: Tổng số xung điện đo được tại buồng đếm Hồng cầu/Tiểu cầu.
-
Lượng Hemoglobin: Tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch máu sau khi làm ly giải Hồng cầu và đo ở bước sóng 555 nm.
-
Số lượng Neutrophils: Tổng số xung điện đo được tại buồng đếm Bạch cầu/Hb.
-
Số lượng Lymphocytes: Tổng số xung điện đo được tại buồng đếm Bạch cầu/Hb.
3. Suy luận: Áp dụng công thức tính toán và các thông số máy đo được, từ đó suy luận ra các thông số khác như nh ư MCH, MCHC, NEUT%, LYM%...
__________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
9
IV. BẢNG GIÁ TRỊ CÁC THÔNG SỐ HUYẾT HỌC BÌNH THƯỜNG STT
Ký hiệu
Ý nghĩa
1
WBC
White Blood Cells
Số lượng Bạch cầu.
2
RBC
Red Blood Cells
Số lượng Hồng cầu.
3
HGB
Hemoglobin
Hemoglobin.
4
HCT
Hematocrit
Thể tích khối Hồng cầu.
5 6 7 8 9 10 11 12 13
MCV MCH MCHC PLT LYM% LYM# NEUT% NEUT# MXD%
Mean Corpuscular Volume Mean Corpuscular Hb Mean Corpuscular Hb Concentration Platelet LYM% LYM# NE NEUT% NEUT# MID%
14
MXD#
MID#
Thể tích trung bình H.cầu. Lượng Hb trung bình H.cầu. Lượng Hb trung bình 1 H.cầu. Số lượng Tiểu cầu. % Lymphocyte. Số lượng Lymphocyte % Neutrophil Số lượng Neutrophil. % Monocytes, Basophils, Eosinophils. Số lượn ượng Monocy nocyttes, es, Baso asophil philss,
MO% MO# BASO% BASO# EO% EO# RDW PDW MPV P-LCR RDW-
Monocytes% Monocytes# Basophils% Basophils # Eosinophils% Eosinophils# Red Distribution Width Platelet Distribution Width Mean Platelet Volume Large Platelet Ratio
15 16 17 18 19 20
SD RDWCV
Eosinophils. % Monocytes Số lượng Monocytes % Basophils Số lượng Basophils % Eosinophils Số lượng Eosinophils Độ phân bố Hồng cầu. Độ phân bố Tiểu cầu. Thể tích trung bình Tiểu cầu Tỷ lệ tiểu cầu khổng lồ.
Giá trị Bình thường 4.0 – 10.0 G/L Nam: 4.2 – 5.4 T/L Nữ: 4.0 – 4.9 T/L Nam: 130 – 160 g/L Nữ: 120 – 142 g/L Nam: 0.40 – 0.47 L/L Nữ: 0.37 – 0.42 L/L 85 – 95 fL 28 – 32 pg 320 – 360 g/L 150 – 500 G/L 25 – 40 % 1.2 – 4.0 G/L 55 – 70 % 2.8 – 6.5 G/L 5.1 – 13.2 % 0.22 – 1.32 G/L 1–4% 0.05 – 0.40 G/L 0.1 – 1.2 % 0.01 – 0.12 G/L 4–8% 0.16 – 0.8 G/L 11 – 14 % 11 – 15 % 5 – 8 fL Giá trị thực tế đo được
Dải phân bố HC-Độ lệch chuẩn
35 – 46 fL
Dải phân bố HC-Hệ số biến thiên
11 – 14.4 %
__________Nguyên __________Nguyên lý lý hoạt động của máy Huyết Huyết học Sysmex KX21__________ KX21__________
10
