Prezentul document este doar un model, textulse va adapta după fiecare test în parte !!!!!
RAPORT DE VALIDARE A METODEI DE DETERMINARE A xxxxx PRIN HPLC
NUME STUDENT................................................., AN............, GRUPA.................. DATA......................................................................
CUPRINS
1.Introducere....................................................................................................................3 2.Metoda .......................................................................................................................... 3 3.Procedeu experimental şi rezultate...............................................................................4 3.1.Liniaritatea ................................................................................................................4 3.1.1. Procedeu ........................................................................................................................... 4 3.1.2. Soluţii măsurate................................................................................................................ 4 3.2. Limita de detec ţie şi limita de cuantificare ......................................................................... 7 3.3. Precizia şi exactitatea ......................................................................................................... 7
3.3.1. Precizia sistemului ............................................................................................................ 7 3.3.2. Precizia metodei ............................................................................................................... 8 3.3.3. Exactitatea metodei .......................................................................................................... 9 4. Concluzii generale ................................................................................................................ 9
2
1. INTRODUCERE
Prezentul raport descrie dezvoltarea şi validarea metodei analitice de determinarea a *** prin HPLC.. 2. METODA 2.1. Aparatură
-
cromatograf de lichide echipat cu detector spectrofotometru UV - VIS;
-
coloană cromatografică Stable BondSB C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm).
2.2. Condiţii cromatografice
-
faza mobilă este formată din amestecul CH3CN : H2O : CH3COOH în raportul 99 : 99 : 1 cu un debit de 0,7 mL/minut;
-
detecţia se realizează în fluorescenţă cu lungimea de undă de excitaţie (λex) de 228 nm şi lungimea de und ă de emisie (λem) de 423 nm ;
-
volumul de probă analizat este de 20 µL.
2.3. Soluţii
1) Metanol HPLC; 2) Acetonitril HPLC; 3) Acid acetic glacial; 4) Apă dublu distilată; 5) Soluţii etalon Soluţie etalon stoc (Soluţie A): o cantitate de 5 mg *** dizolvat ă în 10 mL metanol HPLC (1 mg/mL). Soluţie etalon: 1 mL soluţie etalon stoc în 20 mL (cu metanol).
3
Din soluţia etalon au fost preparate prin dilu ţie cu metanol HPLC soluţii de lucru cu concentraţii cuprinse în domeniul 10 ng/mL – 1,25 µg/mL. Soluţiile astfel rezultate au fost filtrate prin filtru de celuloză cu mărimea porilor de 0,2 µm. Limită: Testul nu este valid dacă deviaţia standard a unui număr de trei analize replicate din soluţie etalon este mai mare de 10%.
3. PROCEDEU EXPERIMENTAL ŞI REZULTATE
3.1. Linearitatea
3.1.1. Procedeu
Se prepară şi analizează soluţii etalon de *** cu valorile concentra ţiilor cuprinse între 9,765625 ng/mL şi 1,250 µg/mL. Pentru fiecare valoare a concentra ţiei au fost analizate un număr de 6 soluţii. Valorile medii ale ariilor picurilor obţinute se reprezintă grafic în funcţie de concentraţie. Valorile experimentale obţinute sunt redate în tabelul nr. 1 iar curba de calibrare în figura nr.1. 3.1.2. Soluţii măsurate
Soluţiile măsurate sunt preparate din Soluţia etalon prin diluare cu metanol HPLC. 1)
0,1 mL soluţie etalon / 2,0 mL =>
2,500 µg/mL
2)
1,0 mL soluţie (1) / 2,0 mL
=>
1,250 µg/mL
3)
1,0 mL soluţie (2) / 2,0 mL
=>
0,625 µg/mL
4)
1,0 mL soluţie (3) / 2,0 mL
=>
0,3125 µg/mL
5)
1,0 mL soluţie (4) / 2,0 mL
=>
0,15625 µg/mL
6)
1,0 mL soluţie (5) / 2,0 mL
=>
0,078125 µg/mL
7)
1,0 mL soluţie (6) / 2,0 mL
=>
0,0390625 µg/mL
8)
1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL
=>
0,01953125 µg/mL 4
9)
1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL
=>
0,009765625 µg/mL
Tabelul nr.1. Valorile ariilor picurilor corespunzătoare *** pentru un număr de 6 determin ări în funcţie de concentraţia analizată. Ochratoxina A
Arie pic
Arie
I
II
III
IV
V
VI
medie
0,009765625
20
17,1
15,9
13,8
18,1
17,8
17,1
0,01953125
33,8
26,7
30,9
25,4
26,2
33,3
29,4
0,0390625
56,1
53,4
45,1
47,9
42,6
48,7
49,0
0,078125
95,0
86,7
93,3
89,3
85,8
80,6
88,5
0,15625
177,3
172,8
165,8
165,7
164,5
158,3
167,4
0,3125
337,8
328,5
331,9
302,5
306,8
321,5
321,5
0,625
628,4
614,5
619,7
602,1
559,9
611,5
606,0
1,25
1232,1 1194,8 1166,5 1192,6 1041,4 1202,2
1171,6
(µg/mL)
1400 1200 e 1000 i d e 800 M e 600 i r A
400 200
0 0
0.5
1
1.5
Concentratie (ug/mL)
Figura nr.1. Linearitatea metodei de determinare cantitativ ă a *** prin HPLC Coeficient de corelaţie (R) = 0,99979 5
Interceptul (a) = 16,80341 Panta (b) = 930,0621 Arie pic = a + b x Concentra ţia Arie pic = 930,0621 x Concentra ţia + 16,80341 Date statistice
În urma prelucrării statistice a valorilor ariilor picurilor corespunzătoare ***, s-au obţinut următoarele rezultate: A) Coeficienţi statistici Regresie Coeficient de corelaţie (R)
0,99979
Coeficient de regresie R
0,999581
Eroare Standard (ES)
8,89368
Intercept
16,80341
Panta
930,0621
Conform acestor valori se ob ţin: a) ecuaţia dreptei de calibrare: Arie pic = 930,0621 x Concentra ţia + 16,80341 b) coeficientul de corelaţie (R) = 0,99979 c) eroarea standard a dreptei de regresie: ES = 8,89368 Concluzie: Metoda de analiză a *** prin metoda descrisă este linară pe domeniul de concentraţie cuprins în intervalul 9,765625 ng/mL - 1,250 µg/mL, coeficientul de regresie (R) având valoarea de 0,99979 (limita pentru coeficientul de regresie este: R > 0,997.
6
3.2. Limita de detecţie şi limita de cuantificare
Pentru determinarea limitei de detec ţie şi a limitei de cuantificare se utilizeaz ă următoarele formule: LD se calculează utilizând formula: LD = (ES x 3,3) / a LC se se calculeaz ă utilizând formula: LC = (ES x 10) / a unde “ES” reprezintă deviaţia standard a pantei dreptei de regresie iar “a” reprezint ă panta dreptei de regresie. Având în vedere faptul că valoarea concentraţiei de interes este foarte sc ăzută, s-a calculat ecuaţia dreptei de regresie doar pentru valori mici ale concentra ţiei, cuprinse în intervalul 9,765625 ng/mL - 0,0390625 µg/mL. În acest interval, devia ţia standard a dreptei de regresie are valoarea 1,534983 iar panta dreptei de regresie are valoarea 1045,961. Utilizând aceste valori se obţine că LD = 4,403 ng/mL, iar LC = 0,014675 µg/mL.
3.3. Precizia şi exactitatea
3.3.1. Precizia sistemului
Pentru a examina precizia sistemului, aceea şi soluţie conţinând *** în concentraţia de interes (19,5 ng/mL) a fost analizat ă de 5 ori şi s-au înregistrat ariile picurilor obţinute. Pentru aceste valori s-a calculat valoarea medie, devia ţia standard şi deviaţia standard relativă.
Nr. crt.
Arie pic
1
26,7
2
30,4
3
30,7
4
26,2
5
31,8
7
Arie medie
29,16
SD
2,5344
RSD (%)
8,6912
Concluzie: având în vedere valoarea devia ţ iei standard relative ob ţ inute (RSD = 8.69127%), se poate afirma că la determinarea prin spectrofotometrie în vizibil a nimesulidului, sistemul este precis.
Valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este mai mic ă de 10% (valoare ce reprezint ă limita pentru precizia sistemului pentru determinarea *** în condiţiile de lucru).
3.3.2. Precizia metodei
Pentru determinarea preciziei metodei de determinare a *** s-a ales varianta de lucru cu un minim de 9 determinări acoperind domeniul specific de concentra ţie: 3 determinări la 3 valori ale concentraţiei Prepararea soluţiei test: se prepară
soluţii de *** în aceea şi manieră ca şi în cazul curbei
de calibrare obţinându-se în final soluţii cu următoarele concentraţii: 1,0 mL soluţie (6) / 2,0 mL
=>
0,0390625 µg/mL (50%)
1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL
=>
0,01953125 µg/mL (100%)
1,0 mL soluţie (7) / 2,0 mL
=>
0,009765625 µg/mL (200%)
Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor picurilor corespunzătoare nimesulidului se calculează concentraţia (în µg/mL) pentru fiecare prob ă în parte. Se determin ă concentraţia calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice. Valorile ob ţinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea medie, devia ţia standard, deviaţia standard relativă şi intervalul de încredere pentru fiecare valoare individual ă ca şi pentru valoarea medie. Deviaţia standard relativă trebuie să aibă o valoare cât mai mic ă. Ecuaţia dreptei de calibrare este: C =
Arie − 7,3228333333 3333
1075,20731428571
Soluţiile test: 8
Nr.
Concentraţie
crt.
teoretică (µg/mL)
Arie pic
Concentraţie
Regăsirea
calculată (µg/mL)
(%)
20,0
0,011790439
120,7
18,1
0,010023338
102,6
3
17,8
0,009744322
99,8
4
33,8
0,024625174
126,1
26,2
0,017556769
89,9
6
33,3
0,024160147
123,7
7
56,1
0,045365360
116,1
42,6
0,032809642
84,0
48,7
0,038482966
98,5
1 2
5
8
0,009765625
0,01953125
0,0390625
9 Date statistice
Media
106,8
Deviaţia standard (SD)
15,3
Deviaţia standard relativă =
14,3%.
3.3.3. Exactitatea metodei
Acurateţea (exactitatea) este o caracteristic ă ce reflectă apropierea rezultatelor analitice de valoarea adevărată. Exactitatea este deci o măsură a deviaţiei valorii medii găsită prin analiză, faţă de valoarea adev ărată. Pentru fiecare nivel de concentra ţie se prepară şi se analizează un număr de trei probe, măsurându-se experimental aria picului.
9
Soluţiile test: Nr.
Concentraţie
crt.
teoretică (µg/mL)
Concentraţie
Regăsirea
calculată (µg/mL)
(%)
17,1
0,009093285
93,1
13,8
0,006024110
61,7
3
15,9
0,007977221
81,7
4
26,7
0,018021796
92,3
25,4
0,016812727
86,1
6
30,9
0,021928019
112,3
7
53,4
0,042854216
109,7
47,9
0,037738924
96,6
45,1
0,035134775
89,9
1 2
5
8
0,009765625
0,01953125
0,0390625
9
Arie pic
Regăsirea medie = 91,5% (valoare minim ă = 61,7%; valoare maximă 112,3%) Concluzie: regăsirea medie în studiul exactit ăţ ii metodei de determinare a nimesulidului prin spectrofotometrie în vizibil are valoarea de 91,5 % pe intervalul 61,7 – 112,3 %.
Concluzii generale
S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picurilor în
funcţie de concentraţia analizată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (0,009 – 1,25 µg/mL). Ecuaţia dreptei de regresie ob ţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici p ătrate (coeficient de corelaţie r = 0,9997): Absorban ţă = 930,06 x Concentra ţ ia ( µ + 16,803 µ µ g/mL)
S-a calculat limita de detecţie (LD = 4,4 ng/ mL) şi limita de cuantificare (LQ = 0,014
µg / mL) folosind estimarea acestor limite pe baza devia ţiei standard şi a pantei dreptei de
regresie. Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
10
repetabilitatea detecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determin ări, valoarea
deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 8,6912%;
repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei solu ţii independente la trei nivele
de concentraţie diferite pentru care valoarea devia ţiei standard relative (RSD) este de 14,3%;
În vederea estimării exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei
nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 91,5% (valoare minimă = 61,7%; valoare maximă 112,3%)
11
