VALIDAREA METODELOR ANALITICE
Validarea unei metode analitice se defineste ca fiind:
1) procesul prin prin care laboratorul laboratorul isi stabileste stabileste caracteristi caracteristicile cile de performanta, performanta, limitele limitele metodei metodei si, prin care, se identifica factorii care influenteaza aceste caracteristici precum si gradul de influenta al acestor factori;
2) procesul prin care laboratorul verifica daca metoda este adecvata scopului in care va fi utilizata.
De ce este necesara, cand si cine realizeaza validarea metodei analitice?
De ce? Validarea metodei analitice este o cerinta esentiala in practica analizei chimice.
Cand? -
atunci cand laborat laboratorul orul introdu introduce ce in lucru lucru o metoda metoda pe care care nu a mai mai utilizat utilizat-o -o in trecut; trecut;
-
atunci atunci cand cand trebuie trebuie impleme implementa ntate te imbunat imbunatati atiri ri ale metodei metodei ca urmare urmare a introduce introducerii rii unui unui tip de reactiv imbunatatit de catre producator, schimbarii echipamentului, schimbarii producatorului reactivilor;
-
atunci cand metoda metoda este este extinsa extinsa pentru pentru a fi utili utilizata zata si pentru alt scop scop decat decat cel pana in prezent; prezent;
-
atunci cand rezulta rezultatele tele control controlului ului de de calitate calitate indica indica o modificare modificare a performant performantelor elor metodei metodei;;
-
pent pentru ru a demo demons nstr traa echi echiva vale lent ntaa a doua doua meto metode de util utiliz izat atee in labo labora rato torr (ex. (ex. o meto metoda da noua noua introdusa fata de metoda utilizata pana in prezent, sau fata de o metoda standardizata);
-
pentru pentru a demonstra demonstra echivalenta echivalenta metodei metodei cand cand sunt sunt utilizate utilizate instrumente instrumente diferite; diferite;
-
cand cand se intr introdu oduce ce o met metoda oda vali valida date te..
Cine? Laboratorul care utilizeaza metoda analitica este responsabil pentru a se asigura ca metoda este corect validata. Daca o metoda analitica este dezvoltata cu un domeniu larg de utilizare (ex. procedura standard publicata), atunci se realizeaza studii in care sunt implicate mai multe laboratoare. Nu este cazul pentru laboratoare industriale. Validarea intr-un singur laborator impune sa aleaga, in functie de cerintele clientului, caracteristicile potrivite: selectivitate, exactitate, precizie, domeniu de lucru, limita de cuantificare, robustete etc.
Conditiile tehnice in care se realizeaza metoda
Validarea metodei trebuie sa se realizeze in urmatoarele conditii: -
respons responsabi abilul lul de de valida validare re trebui trebuiee sa fie fie o pers persoana oana comp compete etenta; nta;
-
condit conditiil iilee de mediu mediu cerute de specifii specifiicati catile le metodei metodei (ex. specif specifica icatii tiile le date de producato producatorul rul echipamentului, reactivilor) trebuie sa fie satisfacute;
-
echipa echipamen mentul tul de masura masurare re trebui trebuiee sa fie in buna stare stare de functi functionar onare, e, trebuie trebuie sa fie fie etalona etalonate te inainte de validare (daca este cazul) si calibrat corespunzator;
-
reacti reactivii vii sunt sunt adecvat adecvatii lucrulu lucruluii cu echipame echipamentu ntull care urmeaz urmeazaa a fi valida validatt si sunt in in termen termen de valabilitate;
-
mate materi rial alel elee de referi referint ntaa si reacti reactivi viii etal etalon on trebu trebuie ie sa fie fie adec adecvat vatii meto metodei dei care care urme urmeaz azaa a fi validate si trebuie sa fie in termen de valabilitate.
Parametri de performanta
1. Selectivitate si specificitate
Atat selectivitatea cat si specificitatea sunt parametri de performanta ai unei metode analitice care ofera o idée la soliditatea metodei analitice.
selectivitatea = abilitatea metodei analitice de a masura si diferentia analitii in prezenta componentilor care sunt asteptati a fi prezenti (ex. diferite substante interferente);
specifitatea = abili abilitat tatea ea metodei metodei analiti analitice ce de evalua evalua analit analitul ul in prezen prezenta ta compone componenti ntilor lor care care sunt sunt asteptati a fi prezenti (ex. diferite substante interferente).
Selectivitatea este cercetata prin studierea capacitatii metodei de a masura analitul de interes din probe in care interferentele specifice au fost introduse in mod intentionat (!!! interferentii introdusi sunt acei care pot exista in probele reale). Interferentele pot aduce modificari asupra concentratiei analitului (cresteri sau scaderi a concentratiei) sau pot modifica panta curbei de etalonare.
Exemplu: O metoda analitica este selectiva atunci cand se pot determina, in proba de analizat, in prezenta diferitelor substante interferente introduse in mod intentionat, compusi fenolici (fluor-fenol, nitro-fenol etc).
O metoda analitica este specifica atunci cand se poate determina, in proba de analizat, in prezenta diferitelor substante interferente introduse in mod intentionat, un singur compus din clasa fenolilor (fluor-fenol).
Specificitatea este superioara selectivitatii.
Rezultatele obtinute se pot trece intr-un tabel de forma:
Nr. crt.
Proba + compus interferent
Absorbanta
1 2 3 4
proba standard proba standard + compus interferent proba standard + compus interferent proba standard + compus interferent
0,129 0,504 0,017 0,003
Concentrati e analit in proba [mg/L] 0,200 0,200 0,200 0,200
Concentratie analit in proba dupa adaugarea compusului interferent [mg/L]
0,200 0,788 0,104 0,084
2. Domeniul concentratiilor de lucru. Liniaritate
domeniul domeniul concentratii concentratiilor lor de lucru = interv intervalul alul dintre dintre concent concentrat ratia ia inferi inferioar oaraa si cea superi superioar oaraa a analitului din proba de analizat pentru care s-a demonstrat ca procedura are un nivel potrivit de precizie, exactitate si liniaritate.
liniaritate = abilit abilitate ateaa unei metode metode analit analitice ice de a obtine obtine rezult rezultate ate propor proportio tional nalee cu concent concentrat ratia ia analitului din proba.
In domeniul de concentratii de lucru raspunsul analitic poate fi liniar si, pentru a demonstra acest lucru este necesara o etalonare in mai multe puncte (minim 6 concentratii diferite; de preferabil 10-11).
Functia liniara de etalonare este data de ecuatia:
y = a + bx
unde: a – intersectia cu ordonata in origine, b – panta dreptei de etalonare.
In figura urmatoare se evidentiaza liniaritatea curbei de etalonare si domeniul concentratiilor de lucru:
0.700
1.000, 0.637
y = 0,6356x+0,0016 R2 = 0,9995
0.600
0.800, 0.511
] 0.500 m n [ a 0.400 t n a b r 0.300 o s b a 0.200
0.600, 0.373 0.400, 0.258
0.200, 0.125
0.100
0.100, 0.069 0.000
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
concentratie analit [m g/L]
3. Precizie
precizia = potrivirea intre o serie de masurari obtinute de la mai multe probe. Probele provin de la aceeasi proba (proba-mama).
Precizia are urmatoarele nivele:
Repetabilitate Este obtinuta cand determinar determinarile ile sunt facute facute de acelasi acelasi operator, operator, in acelasi acelasi laborator, laborator, folosind acelasi instrument, aceeasi metoda intr-un interval scurt de timp. Este o masura a gradului de imprastiere intr-un interval de incredere a rezultatelor obtinute in urma masurarii executate de acealasi analist, in aceleasi con ditii de lucru.
Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:
Concentratie analit in proba [mg/L] 1 0,206 2 0,200 3 0,196 4 0,208 5 0,196 Parametri statistici Deviatie standard, s standard, s (mg/L) Deviatia standard medie, s medie, s x (mg/L) Deviatia standard relativa procentuala, RSD procentuala, RSD (%): Intervalul de incredere pentru valoarea medie, (mg/L) Nr. crt.
Absorbanta
0,130 0,127 0,123 0,132 0,123 Valoare calculata 0,0056 0,0025 2.78 0.0053 x
Precizie intermediara Sunt analizate probe identice prin aceeasi metoda, in acelasi laborator, cu 2 sau mai multe instrumente, de catre operatori diferiti, intr-un interval mai lung de timp. Prin Prin precizi preciziee interm intermedia ediara ra se verific verificaa daca, daca, in cadrul cadrul aceluasi aceluasi laborat laborator or utiliz utilizand and aceeasi aceeasi metoda, metoda, rezultatele sunt precise.
Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:
Concentratie analit in proba [mg/L] 1 0,420 2 0,384 3 0,408 4 0,372 5 0,384 6 0,396 7 0,400 8 0,408 9 0,396 Statistical parameter Standard deviation, s deviation, s (mg/L) Standard deviation of mean value, s value, s x (mg/L) Nr. crt.
Absorbanta
0,269 0,248 0,262 0,240 0,246 0,253 0,259 0,263 0,257 Calculated value 0,015 0,0049
Relative standard deviation, RSD deviation, RSD (%): Confidence interval for mean value (mg/L)
x
3.72 ±0.010
Reproductibilitatea Sunt analizate probe identice prin aceeasi metoda dar in laboratoare diferite si, deci, in conditii diferite. Se verifica daca rezultatele aceleasi metode realizate in laboratoare diferite sunt precise
Se determina, prin calcule, urmatorii parametri:
- abaterea standard
- n – numar de masurari. - abaterea standard relativa procentuala
n
∑ ( x − x )
2
i
s
=
i =1
RSD
s =
100
⋅
x
n −1
unde: unde:
- s – abaterea standard;
- xi – concentratia de analit;
-
-
x
x
– valoarea medie a concentratiei.
– valoarea medie a concentratiei;
- n – numar de masurari. - interval de incredere (intervalul in care se
gasesc valorile obtinute in urma masurarii) - abaterea standard medie x ±t ⋅ s x s x
s =
n
unde: - s x – abaterea standard;
unde:
- t – t – factor Student (pentru n-1 grade de
- s – abaterea standard;
libertate si nivel de incredere 95%).
4. Exactitatea (acuratetea)
exactitatea = apropierea dintre valoarea reala si valoarea gasita in proba de analizat.
Exactitatea unei metode analitice se poate determina prin metoda imbogatirii probelor. Relatia de calcul este: R %
CF =
−
CU
CA
⋅
100
,
unde: CF – CF – concentratia/ cantitatea analitului masurata in proba imbogatita; CU – CU – concentratia/ cantitatea analitului masurata in proba neimbogatita; CA – concentratia/ cantitatea analitului adaugata.
Rezultatele obtinute in urma recuperarii trebuie sa fie cuprinse in domeniul 85% ≤ R ≤ R ≤ 105%.
Rezultatele obtinute se pot trece intr-un tabel de forma:
Concentratie analit in proba neimbogatita CU
Concentratia analitului adaugata CA
0.05
0.05
0.05
0.01 0.01 0.01 0.03 0.03 0.03 0.05 0.05 0.05 Valoarea medie a recuperarii
Concentratie analit in proba imbogatita CF 0.060 0.060 0.059 0.083 0.081 0.079 0.100 0.102 0.099
Recuperare (%)
100 100 90 110 103.3 96.67 100 104 98 100.22
5. Limita de detectie (LOD) si Limita de cuantificare (LOQ)
limita de detectie = cea mai mica cantitate sau concentratie care poate fi detectata fata de blanc si care poate fi distinsa de zero. limita de cuantificare = cea mai mica cantitate sau concentratie care poate fi determinate cu un nivel acceptabil al repetabilitatii si exactitatii. exa ctitatii.
Limita de detectie se determina astfel: se masoara 10 probe blanc, fiecare o singura data, fata de blanc. Din seria de 10 masurari se determina media
x blanc
si abaterea standard experimentala s experimentala s::
x LOD
= x blanc
+3 ⋅ s blanc
Limita de cuantificare se determina determina astfel: se masoara 10 probe blanc, fiecare fiecare o singura singura data, fata de blanc. Din seria de 10 masurari se determina media x blanc si abaterea standard experimentala s experimentala s::
x LOQ
= x blanc
+10 ⋅ s blanc
3, respectiv, 10 reprezinta reprezinta parametri de incredere incredere (k (k , 2-3 pentru LOD, respectiv, m, 5-10 pentru LOQ). k este mai mare, cu atat intervalul de incredere este mai larg. Cu cat k este
Valoarea limitei de cuantificare trebuie sa fie mai mica decat cea mai mica valoare din domeniul concentratiilor de lucru.
6. Robustetea
robustetea = o masura a capacitatii unei metode analitice de a ramane neafectata de variatii mici, introduse in mod intentionat, a parametrilor metodei.
Pentru evaluarea robustetii pot fi variati: -
parame parametri tri inter interni: ni: tempe temperat rature ure,, pH, concent concentrat ratia ia reacti reactivil vilor or etc.; etc.;
-
parame parametri tricc externi externi:: analist analisti, i, echip echipame amente nte,, laborat laboratoar oaree etc.
Daca metoda se dovedeste a fi robusta fata de variatia unui paramtru se poate determina ecuatia dreptei de regresie, abatarea standard si coeficientul de determinare determinare R R2. Se verifica astfel liniaritatea metodei.
Rezultatele obtinute se pot trece in tabel:
Nr.
Volum reactiv [mL]
Absorbanta
Concentratie analit
[mg/L]
crt. 1 2 3 4 5 6
0 2 4 6 8 10
-0.034 0.262 0.252 0.200 0.139 0.081
Nr. crt..
Volum reactiv [mL]
pH
1 2 3 4 5 6
0 2 4 6 10 20
10 10 10,5 11 11 11
Concentratie analit [mg/L] 0,200 0,220 0,216 0,176 0,180 0,200
0 0.102 0.097 0.078 0.055 0.034
Absorbanta
0,125 0,140 0,137 0,112 0,114 0,126
Structurarea raportului de validare
Raportul de validare trebuie sa cuprinda:
1. prezentarea prezentarea conditii conditiilor lor in care a fost fost facuta facuta validarea validarea (metoda, (metoda, responsabil responsabil,, conditii conditii de mediu, echipamente, reactivi etc.); 2. prezentarea prezentarea parametril parametrilor or de performanta performanta a metodei metodei (1-6); (1-6); 3. anexe care care sa cuprinda cuprinda document documentee doveditoare doveditoare (curba (curba de calibrare calibrare etc); etc); 4. concluzii concluzii cu privire privire la satisf satisfacerea acerea cerintelor cerintelor;; 5. declar declarati atiee de vali validit ditate ate a metode metodei. i.
