Universitatea Valahia Tărgoviste Facultatea: Ingineria mediului si biotehnologii Specializarea Master: Controlul si expertiza alimentelor
Analiza chimică a alimentelor prin RMN
Masterand:
2009 – 2010 Sem.I
1. Definitie ........................................................................................... 3 2. Principiul metodei .......................................................................... 5 3. Avantajele metodei ......................................................................... 7 4. Dezavantajele metodei .................................................................... 7 5. Aparatura utilizată ......................................................................... 8 6. Etapa preparativă de pregătire probelor..................................... 9 7. Descrierea metodei de lucru specifice ........................................... 14 8. Rezultatele furnizate........................................................................ 9. Interpretarea rezultatelor obtinute ............................................... 10. Aplicatii în identificarea componentelor aleimentare ................ 16 11. Bibliografie………………………………………………………..17
2
1. Definitie RMN Rezonanta magnetică nucleară, RMN, este o tehnică spectroscopică foarte des folosită în chimie, chimie-fizică, medicină, biofizică si inginerie nucleară pentru determinarea structurii diversilor compusi chimici, în biochimie pentru determinarea structurii proteinelor fiind singura tehnică destinată determinării structurii proteinelor în solutie. Dintre toate metodele fizice, rezonanţa magnetică nucleară (RMN) este aceea care oferă cea mai bogată şi completă informaţie structurală asupra compuşilor organici. Spre deosebire de spectroscopia IR, în RMN practic toate semnalele sunt interpretabile relativ uşor, iar spre deosebire de spectroscopia electronică metoda RMN oferă mult mai multe informaţii. În timp ce spectroscopia IR sau cele de masă sunt prea bogate în informaţii, deci greu interpretabile, iar cele UVVIZ prea sărace, spectrele RMN, atât cele 1H cât şi cele 13C, conţin exact informaţia necesară, care poate fi pusă în legătură directă cu formula structurară a substanţei. Dezvoltată prin analogie cu rezonanţa electronică de spin, rezonanţa magnetică nucleară de înaltă rezoluţie, aplicată iniţial pentru studiul protonilor şi extinsă ulterior pentru o serie de alţi nuclizi: 13C, 19F, 31P, 17O etc., a devenit în prezent cea mai importantă metodă de studiu a structurii, configuraţiei compuşilor organici. Rezonanţa este fenomenul de oscilaţie cu aceeaşi frecvenţă a doi oscilatori care transferă energie. În acest caz oscilatorii se numesc cuplaţi. Fenomenul rezonanţei magnetice nucleare se bazează pe proprietatea nucleelor de a prezenta moment magnetic. Nu toate nucleele însă posedă moment magnetic. Se pretează la o rezonanţă magnetică acele nuclee care au moment magnetic. Practic se poate obţine rezonanţa magnetică nucleară prin aplicarea unui câmp electromagnetic de frecvenţă variabilă şi observarea frecvenţei la care nucleele magnetice intră în rezonanţă cu câmpul indus. Nucleele magnetice posedă un moment unghiular de spin mω care are o valoare cuantificată după formula: mω =)1I(+I·π2h. unde I este numărul cuantic de spin (numit simplu spin) poate lua valorile I = 0, ½, 1. Valoarea numărului cuantic de spin I dă numărul de orientări (stări) ale momentului magnetic al nucleului faţă de o axă oarecare nI: nI = 2·I + 1 Fiecare orientare a momentului magnetic se numeşte componentă a momentului unghiular.
3
Valorile orientărilor momentului magnetic al nucleului sunt notate cu mI (numite stări de spin sau stări) şi sunt date de relaţia: mI = I, I-1, ..., -I iar valorile componentelor momentului unghiular sunt: ωI = mI·π2h Dintre elementele chimice, elemente cu număr cuantic de spin I = ½ sunt 1H, 13C, 19F, 31P. 14N are I = 1, iar 12C şi 16O au numărul cuantic de spin I = 0. Starea cu mI = ½ se notează cu α sau ↑ în timp ce starea cu mI = - ½ se notează cu β sau ↓. Componenta momentului magnetic pe axa Oz, notată μz este proporţională cu componenta momentului unghiular de spin nuclear pe această axă: μz = γ·mI·π2h unde γ este un coeficient de proporţionalitate numit raport giromagnetic al nucleului. Acesta depinde strict de tipul nucleului considerat şi valorile sale pentru câteva nuclee. De la bun început trebuie specificat faptul că în RMN experimentele se realizează pe nucleii atomilor şi nu pe electronii acestora, deci informaţia furnizată se refera la poziţionarea spaţială a acestor nuclei în compusul chimic studiat. Aceşti nuclei au o proprietate intrinsecă numită spin dar pentru a explica fenomenologia care se ascunde în spatele acestei tehnici trebuie să ţinem cont de următoarele considerente fizice: Orice sarcină electrică în mişcare generează în jurul său un câmp magnetic. Acelaşi lucru se întâmplă şi în cazul nucleilor (sarcini electrice pozitive) când, datorită rotaţiei în jurul propriilor axe, se generează un câmp magnetic caracterizat printr-un moment magnetic μ, proporţional şi de sens opus cu spinul nucleului I. În RMN nucleii de interes sunt acei nuclei care au valoarea I=1/2 (1H, 13C, 15N, 19F, 31P).
Dacă aşezăm un nucleu atomic într-un câmp magnetic extern Bo, atunci vectorul moment magnetic va putea fi paralel (I=+1/2) sau antiparalel (I=1/2) cu direcţia acestui câmp. Trebuie specificat faptul că energia sistemului antiparalel este mai mare decât energia sistemului paralel, iar această diferenţă este direct proporţională cu valoarea câmpului Bo (ΔE=μB/I).
Dacă iradiem nucleul cu un câmp de radiofrecvenţe RF pe o direcţie transversală câmpului constant Bo, acest câmp transportând o energie egală cu ΔE, atunci nucleul (spinul) se va excita trecând din starea de energie +1/2 în starea de energie –1/2 caracterizată prin energie mai mare.
Dar cum în condiţii naturale, orice sistem fizic tinde spre o stare de energie cât mai mică acest nucleu se va relaxa revenind la starea +1/2 şi emiţând un alt camp de radiofrecvenţe din a cărui parametri (frecvenţă) se
4
obţin informaţii despre natura nucleului (poziţia în moleculă, respectiv tipul).
2. Principiul metodei Instalatia experimentală RMN trebuie să realizeze acest acord între câmp si frecventă, permitând în acelaşi timp declararea absorbtiei (extrem de mici) de energie care are loc în momentul “rezonantei”. Realizarea experientelor de RMN se poate face fie în aparate de baleiaj în câmp, lucrând la frecventă fixă, cum se practică de obicei, fie în aparate cu baleiaj de frecventă, la câmp magnetic fix. Schita de principiu, mult simplificată a unui spectrometru RMN cu baleiaj în câmp este prezentată în fig. 1.
Fig. 1. Schita de principiu a unui spectrometru RMN: 1,1’ – polii electromagnetului; 2 – generatorul de radiofrecventă; 3 – tubul de proba; 4 – bobina de radiofrecventă; 5 – detector-amplificator; 6 – înregistrator de semnal; 7 – bobină generatoare a câmpului de bază; 8 – sursă de curent continuu stabilizat; 9 – bobină de variatie a câmpului magnetic; 10 – generator de curent tip “dinte de ferăstrău”. Proba se introduce în fiola 3 plasată în câmpul magnetic omogen dat de electromagnetul 1,1’ (sau de un magnet permanent). În scopul uniformizării pozitiei tuturor protonilor în raport cu câmpul magnetic, proba se roteste în jurul axei verticale cu circa 20-30 rotatii/secundă. Generatorul 2 produce un câmp de radiofrecventă (cu frecvenţa constantă v) din care o parte trece prin bobina 4 iradiind proba iar cealaltă parte se transmite detectorului amplificator 5. Majoritatea aparatelor 1H-RMN lucrează cu frecvente de 60; 80; 90 sau 100 MHz, desi în prezent există aparate de rezolutie mai mare, lucrând la 220 MHz sau la 360 MHz (care însă necesită folosirea supraconductorilor, deci răcire cu 5
heliu lichid). Generatorul 10 produce un curent continuu de intensitate crescătoare liniar în timp (curent tip “dinte de fierăstrău”). Trecând prin bobina 9 acest curent face să crească intensitatea H a câmpului. La atingerea valorii critice, corespunzătoare rezonantei , se produce o inversare a spinilor nucleari, bobina 4 absorbind un surplus de energie. În acest moment la amplificator ajunge o energie micsorată, luând nastere un “semnal “ care după o amplificare corespunzătoare este înregistrat de înregistratorul 6. Dacă în probă se află mai multe probe de nuclizi diferind prin valorile gn si I, conditia de rezonantă va fi satisfăcută pe rând, la diferite câmpuri magnetice, apărând câte un semnal la fiecare specie de nuclizi. Acest tip de experiment RMN nu prezintă nici un interes pentru chimia organică, unde în general se cunoaste de la început tipul de nuclid existent în probă. În functie de structura si de anturajul chimic, unul si acelasi tip de nuclid (de exemplu H) poate prezenta foarte mici diferente în valorile (aparente) ale lui gn. Datorită efectului de ecranare (v. mai departe) diferit al electronilor de legătură si datorită orientării diferite a spinilor nucleelor vecine, câmpul local H la nivelul nuclidului respectiv poate prezenta foarte mici diferente fată de valoarea câmpului exterior. Deci, în realitate , nu gn ci H prezintă mici abateri de la valoarea câmpului exterior. Împingând rezolutia spre o limită extremă, prin realizarea unui câmp magnetic intens, de o perfectă omogenitate în spatiu si constantă în timp, precum si realizarea unei frecvente perfect stabile, se pot sesiza mici diferente (aparente) de valori gn. Astfel se pot obtine pentru acelasi nuclid (de ex. 1H) o serie de semnale apropiate, rezultând un spectru RMN extrem de bogat în informatii asupra structurii compusului investigat.
6
3. Avantajele metodei RMN a fost deja folosit pentru un număr de aplicaţii în domeniul tehnologiilor de prelucrare a alimentelor, inclusiv: caracterizează starea energetica a celulelor de a monitoriza fermentarea iaurturilor (folosind fosfor 31 LR RMN), examen de culturi de celule, la bere (folosind RMN de protoni ), precum şi la gătit, diferite tipuri de orez (RMN proton). Cu toate că RMN este o tehnica relativ insensibil în aceste aplicaţii proces, este examinarea proprietăţi în vrac şi acest lucru nu are importanţă. Tehnică poate fi utilizată pentru a examina procese şi texturi fără a folosi orice compuşi marker sau într-adevăr, orice incursiune fizice, la toate dincolo de un câmp magnetic. RMN de date pot fi folosite pentru a creşte înţelegerea proceselor, cum ar fi reacţii chimice enzimatice şi convenţionale, în timpul unui proces de producţie şi, de asemenea, să completeze şi controlul calităţii în timpul procesului de producţie.
4. Dezavantajele metodei Dejavantajul RMN-ului sunt instrumentele scumpe si complexe. Gama limită de solventi pentru studierea spectrelor de protoni cu exceptia cazului în care sunt deuterizate. Absorbtia de radiatie în radio-frecventă, RF,regiune a spectrului electromagnetic se poate obseva pentru acele nuclee care sunt considerate spin axele lor. Modificările de energie sunt asociate cu orientarea axei nucleare în spatiu, în raport cu un câmp magnetic extern aplicat si sunt de ordinul 0,1 mol J-1, 10-600MHz (50-30 m sau 3×10-4 la 2× 10-2cm-1). Acest lucru este considerat mai mic decât schimbările de energie asociate cu tranzitiile vibrante si electronice. Toate nuclee se atribuie unui număr de spin cuantic I, care poate fi zero, semiintegrală sau integrantă; numai cele cu valoare non-zero poate da nastere unui spectru RMN. Asa cum nucleul are o axă, se roteste în jurul axei sale proprii si produce un monent megnetic sau µ dipol de-a lungul axei. Acest lucru este analog câmpului magnetic asociat cu un curent care curge intr-o bulă de sârmă. Nucleul, de asemenea, posedă momentul cinetic I, precum si pentru fiecare izotop valorile relative µ si determină frecventa la care energia poate fi absorbită. În plus, sensibilitatea tehnică pentru un nucleu special, este determinată de valoarea µ. Trebuie remarcat cu 1H are cea mai mare sensibilitate relativă si că 12C si 16O, având numere cuantice de spin de la zero, sunt inactive. Din aceste motive, rezonanta magnetică protonică, a devenit una din tehnicile cele mai utilizate în identificarea si analizarea structurală a compusilor organi 7
5. Aparatură utilizată
Aparatul RMN cuprinde:
Un elctromagnet puternic si omogen, generator de semnal (radiofrecventă), integrator electronic si tuburi de sticlă pentru proba esantion.
8
6. Etapa preparativa de pregătire a probelor
Chiar în conditiile în care se dispune de un spectrometru RMN multinuclear dotat cu toate accesoriile ce permit executarea experimentelor de rezonantă multiplă si acumularea spectrelor, precum si oricare din artificiile instrumentale descrise mai sus, obtinerea unui spectruRMN utilizabil si în general calitatea informatiei analitite furnizate de spectru depinde intr-o proportie apreciabilă, adesea hotărâtoare, de modul de pregătire a probei. În cele ce urmează se vor trata problemele legate de acest subiect, examinându-se conditiile pe care trebuie să le îndeplinească proba supusă analizei. 5.1 Celula de măsură La totalitatea aparatelor RMN de uz curent, proba supusă analizei este continută intr-un tub cilindric, confectionat dintr-o sticlă de bună calitate, cu rezistentă mecanică. Sticla trebuie să prezinte de asemenea calităti termice satisfăcătoare si mai ales să fie lipsită de impurităti paramagnetice. Această cerintă a îndepărtării impuritătilor paramagnetice din întraga zonă de măsură o vom regăsi amintită în repetate rânduri si importanta ei deosebită poate fi înteleasă dacă se tine seama de faptul că paramagnetismul vreunei componente a sistemului din zona activă a spectrometrului afectează practic toate laturile fenomenului de pezonantă. Tubul ce contine proba de analizat are de obicei dimensiunile standard mentionate cu alte prilejuri, si anume un diametru de 5 mm pentru RMP si de 10 mm pentru RMC. Aceste dimensiuni reflectă ăn primul rând bine cunoscuta diferentă de sensibilitate intrinsecă între experimentele RMP si RMC dar, pe de altă parte se iau în considerare si pretentiile cu mult mai mari în privinta omogenitătii câmpului magnetic ce actionează asupra probei în RMP fată de RMC; la aceasta din urmă domeniul spectral de aproape 40-50 ori mai larg si faptul că semnalele apar ca singleti, deci prezintă mult mai putine pericole de suprapunere prin lărgire, creează posibilitatea tolerării unui grad ceva mai ridicat de neomogenitate a câmpului magnetic ce actionează în diferite puncte ale probei si deci mărirea dimensiunii acesteia. Necesitatea limitării zonei active în RMP constituie si ratiunea indicatiei continute în instructiunile de lucru ale tuturor spectrometrlor, cu privire la situarea nivelului solutiei din tubul de probă între anumite repere prestabilite: cantităti pre mici de solutie înseamnă evident micsorarea numărului de nuclee ce participă efectiv la experiment, iar o cantitate prea mare, pe lângă încărcarea mecanică inutilă a probei mai creează si 9
posibilitatea ca semnalele provenite de la nucleele aflate în afara zonei de omogenitate optumă să apară în spectru, înrăutătind rezolutia acestuia. Tubul de analiză este de regulă, calibrat prin slefuire în interior si exterior, astfel ca otirea să decurgă în conditiile unei stabilităti mecanice cât mai ridicate, iar înregistrarea propriu-zisă, precum si introducerea si scoaterea să se facă fără riscul spargerii fiolei din aparat. 5.2 Substanta de analizat În principiu, substanta supusă analizei trebuie adusă în conditii de puritate care să ofere certitudinea că proprietătile observate se datorează numai unei specii moleculare si pot fi corelate univoc cu structura acesteia. Această cerintă isi păstrează fireste valabilitatea si trebuie îndeplinită cu deosebită scrupulozitate dacă se urmăreste chiar determinarea parametrilor spectrali RMN ca atare, cu scopuri de analiză structurală mai amănuntită. Trebuie însă subliniat că RMN prezintă, ca metodă de analiză, unele particularităti foarte avantajoase, care antenuează severitatea conditiilor de puritate impuse probei, în unele cazuri. Astfel, sensibilitatea relativ redusă a spectrometriei RMN face ca spactrul obtinut de la o probă să reflecte aproape exclusiv, în unele cazuri, substanta care reprezintă 80-90% din speciile moleculare prezente. Este mult mai rational să se utilizeze intensiv spectrometrele RMN din doatarea laboratoarelor si să se supună analizei si probe din amestecuri brute de reactie sau din diferitele etape intermediare ale proceselor izolate a componentilor utili din produsi naturali. Mai ales atunci când substantele sunt solubile în solventi curent accesibili si nu necesită medii deuterate, un spectru făcut la timp poate scuti zile întregi de prelucrare a unor produse de reactie care se soldează uneori cu concluzia că substanta căutată nici nu era prezentă în materialul brut. Spectrometrul RMN este prin excelentă un aparat de analiză structurală si acest gen de probleme, unde dă rezultate aproape neîntrecute, trebuie desigur să aibă priorotate, dar pe lângă acestea se pot executa, cu eficientă economică globală deosebită, si analize de detectare a unor grupe functionale, elemente structurale sau compusi chimici pe parcursul lucrărilor curente, având în vedere rapiditatea, selectivitatea si caracterul reductiv. 5.3 Etaloanele Un alt component esential al probei de analizat în RMN este etalonul, substanta standard al cărei rol este acela de a oferi o verificare rapidă si directă a punctului zero al scării deplasărilor chimice din fiecare înregistrare, fcând posibilă o comparare cu deplin sens fizic ăntre diferitele spectre înregistrate la avelasi aparat. După cum s-a mai arătat, modularea câmpului magnetic cu o audiofrecventă (25000 kHz) permite utilizarea, în conditiile unei bune reproductibilitătii, a hârtiei calibrate pentru înregistrarile de apectre si oferă certitudinea că intervalele între semnale se raportează corect la diviziunile de pe hârtie. În schimb originea axei 10
abciselor poate fi deplasată de la o înregistrare la alta, desigur în limite foarte mici, dar care au semnificatie, atunci când se încearcă identificări ale semnalelor după pozitia exactă si mai ales în studii fizico-chimice, în care variatia deplasării chimice în spectrul de rezonantă magnetică nucleară constituie functia de structură urmărită. Unele spectrometre, de exemplu modelul Tesla 478 de 80 MHz, folosesc semnalul etalonului si pentru ancorajul homonulear. Este usor de înteles că în acest caz toate numărătorile efectuate în aceleasi conditii de solvent, temperatură, concentratie sunt practic identice între ele, si în orice înregistrare este valabilă aceeasi calibrare a spectrului si acelasi punct zero. Din motive tehnice însă semnalul etalonului nu apare pe astfel de spectre si înregistrarea este limitată la zone ce se extind până la 30-50 Hz ale semnalului etalonului, din pricina interferentei dintre unda ci care se mentine rezonanta necesară ancorajului si cea cu care se baleiază spectrul. Aceste două functii potentiale ale etalonului determină în bună parte caracteristicile structurale pe care trebuie să le îndeplinească o asemenea substantă; restul însusirilor cerute sunt în mod evident analoage celor discutate pe larg în cazul solventilor si de aceea nu vom insista asupra lor; etalonul trebuie să fie compus inert din punct de vedere chimic, izotrop din punct de vedere magnetic, lipsit de polaritate si, dacă este posibil,să fie la rândul lui un bun solvent, pentru a nu afecta sensibil solubilitatea compusului supus anlizei deci stabilitatea de fază a probei. Totusi, asa cum in cazul solventului toate insusirile se subordonau în cele din urmă capacitătii de a realiza concentratii acceptabile din compusul studiat, în alegerea etalonului, pe primul plan se găseste capacitatea substantei respective da a da un semnal RMN singlet, intens, îngust si simeric. Spectrometria RMN datorează lui G.V.D. Tiers introducerea ca etalon în 1958 a tetrametilsilanului, pentru care s-a generalizat desemnarea prin prescurtarea TMS. Această substantă s-a impus repede ca etalon aproape universal pentru RMP si a înlocuit relativ curând sulfura de carbon si benzen în RMC devenind astfel substanta de referintă preferată în ambele laturi majore ale RMN. 5.4 Solventii Alegerea solventului reprezintă una din problemele cheie ale spectrmetriei RMN. S-a subliniat în repetate rănduri în cele de până acum că pentru chimia organică, cu rare exceptii, asupra cărora nu ne oprim decât în tracat, sunt interesante numai spectrele RMN de înaltă rezolutie ce se obtin cu conditia ca moleculele să execute nestingherite miscările de translatie si de rotatie ale agitatiei termice, adoptând cele mai variate orientări reciproce si permitând medierea la zero a interactiunilor magnetice dintre ele. Plecând de la ideea minimalizării interferentei solventilor cu manifestarea propietătilor substantei de analizat si tinând seama de natura fizică a experimentului de rezonantă magnetică nucleară, se pot enumera principalele calităti pe care trebuie să le posede un solvent pentru a se dovedi adecvat acestui tip de analiză:
11
a) Mediul ales trebuie să aibă calităti de bun solvent. Cu toate perfectionările tehnice discutate în sectiunile precedente, RMN rămâne totusi o metodă de analiză destul de putin sensibilă. Astfel, la 60 MHz frecventă de lucru din cele mai răspândite la aparatele RMP comerciale, o substantă continând un singur tip de protoni, poate fi analizată in concentratii minime de ordine 5 · 10-3M, conditii în care raportul S/N este de cca 15-20. Aceasta ar corespunde, pentru exemplul dat, unei concentratii de cca 0,04%. In practica curentă însâ, greutătile moleculare sensibil mai mari, precum si numărul mare si mai ales diversitatea tipurilor de protoni din molecula amalizată, fac să fie necesare concentratii minime de 5-10% pentru spectrometrele CW si 1-3% pentru spectrometrele PET. Când se analizează substante solide, nu este întotdeauna usor să se atingă aceste limite de concentratii, astfel că pretentiile impuse eficientei solventului sunt realmente ridicate. Nu rareori experimentatorul este pus în situatia de a sacrifica indeplinirea altor exigente pentru a reusi totusi să obtină solutii de concentratii analizabile. Este important să se retină în legătură cu acest aspect faptul că sensibilitatea spectrometrelor este cu atât mai mare cu cât se lucrează la frecvente mai înalte. b) Solventul trebuie să fie lipsit de absorbtii RMN sau cel putin să aibă numai un număr foarte limitat de semnale proprii, pentru a evita acoperirea semnalelor probei de către semnalele solventului prewent în mare exces. Pentru RMP se cer în primul rând solventi fără protoni în moleculă; deoarece această conditie este foarte greu de adus în compatibilitate cu celelalte cerinte, îndeosebi cu cea discutată în aliniatul precedent, se apelează la utilizarea solventilor deuterati. Între acestia, cloroformul deuterat (CDCl3) ocupă primul loc, atât din pricina calitătilor sale de solvent, cât si datorită pretului relativ redus în raport cu alti soventi din aceeasi categorie. În RMC se pune în mod analog problema limitării numărului si mai ales a tipurilor atomilor de carbon din molecula solventului. De regulă, solventii uti pentru RMP sunt adecvati si pentru RMC, deoarece exigente analoge duc la rezolvări structurale analoage, dată fiind strânsă corelatie dintre „structura protonică” si „structura de carbon” a substantelor organice. Dacă substanta este exceptional de solubilă, se pot folosi si solventi obisnuiti (de exemplu spectrul RMC al benzofrenonei poate fi obtinut cu un singur puls, la 15.08 MHz. dacă se face o solutie saturată în CDCl3 fără ca semnalul solventului să deranjeze înregistrarea spectrului). Nu trebuie scapat din vedere faptul la spectrometrele RMC, care lucrează practic exclusiv în tehnica PFT, nu există posibilitatea de a exclude din spectru semnalul solventului. c) Solventul trebuie să fie inert din punct de vedere chimic, pentru a interactiona cât mai putin cu substanta. Sub acest aspect, solventi ca tetraclorura de carbon si ciclohexanul sunt de preferat, din aceleasi motive ca si la înregistrările spectrelor electronice sau vibrationale. Este însă evident că există o anumită incompatibilitate între cerinta că o substantă să functioneze ca bun solvent, realizând deci cu moleculele sale solvatarea moleculelor variatelor substante de analizat, si totusi, in acelasi timp să interactioneze cât mai putin cu acesta. Această conditie va fi deci, de regulă, limitată la inertia chimică propriu-zisă, nu fără a 12
mentiona faptul că uneori se caută în mod voit efectul invers, de exemplu la protonarea substantelor bazice prin dizolvarea în acid trifloracetic, la generarea în situ a carbonilor.Multă atentie trebuie acordată cazurilor în care recurge la solventi având protoni mobili. Pe lîngă transferul de protoni, formarea de legături de hidrogen, în spectre RMP ale protonilor mobili apar semnale dependente de concentratie, iar integralele acestor semnale nu sunt decât rareori în raporturi sistematice cu formula moleculară. d) O altă cerintă relativ importantă si care se găseste se asemenea în partială contradictie cu cea formulată la primul aliniat, este conditia referitoare la polaritatea cât mai redusă a solventului. Acest aspect este, de asemenea, bine satisfăcut la solventi de tipul tetracloruri de carbon si îsi găseste ratiunea pe de o parte în alterarea distributiilor normale ale sarcinilor electrice din molecula sub influenta dipolilor solventilor, iar pe de altă parte, în perturbarea propagării radioundelor prin probă, datorită faptului că în general, constanta dielectrică creste paralel cu polaritatea moleculelor solventului. În solventi foarte polari, ca H2SO4 si chiar D2O au loc uneori pierderi în dielectric relativ însemnate; avantajele apei grele, în special în RMC compensează, de obicei, cu prisosinta acest mic dezavantaj. e) Solventul trebuie să aibă o văcozitate redusă, viteza miscărilor de agitatie termică ale moleculelor substantei analizate trebuie să fie cât mai mare pentru a avea o bună omogenizare a câmpului magnetic si o eficace mediere la zero a influentelor dipolilor vecini fapte deja mentionate si care se impun cerinta fluiditătii solventului. Acestei împrejurări i se datorează preferinta pentru lucrul în solutie chiar în cazul multor substante lichide, deoarece vâscozitatea relativ ridicată a multor compusi organici lichizi limitează calitatea înregistrărilor de spectre RMN pe lichidul ca atare. Din punct de vedere practic, problema apare mai ales în cazul dimetisulfoxidului. De câte ori este posibil se vor adăuga cel putin câteva picături de CDCl3 la o solutie de dimetilsulfoxid-d6, procedeu care ameliorează sensibil mobilitatea solutiei, se poate proceda si invers, accentuând proprietătile de bun solvent ale CDCl3 cu un mic adaos de dimetilsulfoxid deuterat, conditii în care fluiditatea ansamblului este dictată în continuare de cloroform.
13
7. Descrierea metodei de lucru specifice În spectroscopie RMN influenta diferitilor factori experimentali asupra aspectului spectrului este mai importantă decât în cazul spectroscopiei IR sau UV-VIZ. Dintre acesti factori se amintesc cei mai importanti. Rotirea probei în câmpul magnetic supune toti nucleii situati într-un anumit moment pe un cerc orizontal de sectiune a tubului de probă aceluiasi câmp magnetic mediu. Dacă rotirea probei se face prea lent uniformizarea amintită nu este perfectă si semnalul apare aplatizat. Rotatia probei se manifestă în spectru prin apariţia unor “sateliti de rotatie” (benzi foarte slabe situate simetric, deoparte si de alta a semnalului la diferente de frecventă egale cu frecventa de rotatie a probei). La viteze prea mici de rotatie intensitatea satelitilor de rotatie creste mult, putând îngreuna interpretarea spectrului (fig. 2). Vitezele prea mari de rotatie nu sunt de asemenea recomandate întrucât scad rezolutia datorită formării unor vârtejuri în probă.
Fig. 2. (a) Aspectul unei benzi RMN însotită de sateliti de rotatie (frecventa de rotatie 15 rot/s); (b) aspectul unui semnal RMN la viteză mică de variatie a câmpului (frecventei) 0,1 Hz/s; (c) aspectul aceluiasi semnal la viteza de variatie a câmpului (frecventei) de 1 Hz/s; Viteza de variatie a câmpului magnetic (în cazul baleiajului de câmp) determină forma benzilor de absorbtie. La viteze mari de variaţie (1 Hz/s) sfârsitul semnalului de rezonantă este în sfârsit de “legănări” caracteristice, a căror intensitate descreste rapid (Fig. 2.). Această formă a semnalului RMN al unui compus etalon este un indiciu al omogenitătii câmpului si ea este testată de regulă înainte de începerea înregistrării spectrului. La viteze mici de variatie a câmpului magnetic “legănările” amintite dispar (Fig. 2.). Realizarea unei sensibilităti ridicate în înregistrările RMN este conditionată de o valoare ridicată a raportului semnal/zgomot de font. Pentru obtinerea unor sensibilităti mari se lucrează cu probe relativ concentrate (la zgomot de fond 14
egal intensitatea semnalelor creste prin cresterea numărului de molecule absorbante); se începe înregistrarea după un anumit timp de la introducerea probei în aparat (omogenizarea temperaturii în probă, diminuarea zgomotelor de fond mari initiale) sau se utilizează dispozitive de “acumulare a spectrelor”, prin parcurgerea lor repetată. Probele spectrale RMN se pregătesc de regulă sub formă lichidă sau de solutie. În aceste cazuri se obtin spectre de înaltă rezolutie, căci moleculele se miscă liber schimbându-si orientarea cu frecvente mai ridicate decât frecventa radiatiei radio absorbite. Pentru o probă obisnuită sunt necesare 50 – 100 mg substanţă care se dizolvă în solventi adecvati (v. anexa 1), realizându-se solutii de concentratie de la 10 – 15%. În cazul unor probe foarte mici se poate lucra în microcuve (volum de solutie cca. 15μl) sau se pot utiliza anexele de acumulare ale spectrelor. La substante lichide de mică vâscozitate se poate lucra si fără solvent (adică la concentratii de 100%). Tehnica de lucru H-RMN (protonică) În cazul spectrometriei RMN protonice se utilizează drept solventi compusi ce nu contin protoni, cum ar fi: CCl4; CS2; CDCl3; (D3C)2CO; C6D6; (D3C)2SO; D2O (v. anexa 1). În anumite cazuri se poate folosi H2SO4 sau alti acizi (F3C – COOH) la care semnalul protonilor acizi este pozitionat de obicei departe de semnalele utile ale compusilor organici. În cazuri speciale se pot utiliza si solventi protici, cu conditia de a se interpreta doar regiunile din spectru în care solventul nu dă absorbtii directe sau benzi satelit. Cu majoritatea aparatelor RMN se poate lucra pe un domeniu larg de temperatură (de la -185º până la +250º ) fapt important pentru studiul unor fenomene dinamice (v. mai departe) dar si din punct de vedere al solubilitătii probelor. Tehnica de lucru 13C-RMN Pentru spectroscopia 13C-RMN se folosesc solventi anorganici ca: H2O; D2O; H2SO4 sau solventi organici ce contin doar 1 – 2 tipuri de atomi de carbon diferiti, de obicei tot solventii deuterati ca: CDCl3; CD2Cl2; C6D6; (D3C)2CO; (D3C)2SO; F3C – COOH. Întrucât toate aparatele moderne folosesc pentru “ancorare”1 frecvenţa nucleelor de deuteriu, dacă solventul ales nu este deuterat miscibil. Semnalul de referintă este de obicei cel al tetrametilsilanului, standard “intern” (v. mai jos) utilizat si în spectroscopia 1H-RMN.
1
15
10. Aplicatii în identificarea componentelor aleimentare Aplicatii: In sinteza organica • Elucidarea structurii compusilor organici ca si determinarea stereochimiei si conformatiei acestora In chimia substantelor naturale • Determinarea structurii si stereochimiei diferitilor componenti obtinuti dupa izolarea si purificarea fractiunilor In analiza amestecurilor • Analiza calitativa si cantitativa a amestecurilor de substante organice In studiul polimerilor • Analiza unitatilor de monomer si determinarea structurii Determinarea grăsimi si umidităti din lapte praf. Acesta este un alt test util în industria alimentară. Alte tipuri de analiză de multe ori au nevoie de timp pentru analiză considerabil mai mare si consumă alte materiale chimice decât solventi. În contrast de utilizare a pistei spin RMN este în măsură să determine continutul de grăsime din laptele praf în mai multe minute. Determinarea rapidă a grăsimilor din ciocolata si cacao-Produse Timpul de depozitare a produselor alimentare depinde puternic de continutul de umiditate. Excesul de umiditate duce la activitatea microbiologice si pot face alimentare periculoase pentru consum. Producătorii trebuie să divulge datele exacte de grăsime continute pe eticheta produsului . RMN este metoda cea mai rapidă si precisă pentru a determina aceşti parametri esenţiali cu spectrometru RMN, este adecvat în special pentru analiza periodică a calităţii produselor alimentare. Analiza RMN este aplicată pentru praf de cacao, nuci, pralină, glazură, fondants şi ciocolată pură. Timpul de măsurare este mai mic de 2 minute. Determinarea substantelor nutritive din bere Berea contine un amestec foarte complex de substante nutritive, care, în această lucrare sunt identificate într-o oarecare măsură de câmpul de înaltă rezolutie, rezonanta magnetică nucleară (RMN) prin una sau două metode dimensionale. 1 H RMN spectrul de frecvente radio din bere arată o predominare a vârfurilor puternic suprapus care decurg din mai multe glucide. Componente minore sunt 16
în mod clar observate atât în alifatice cât si în regiunile aromatice ale spectrului de frecventă. Cu ajutorul celor două metode de dimensionare, repartizarea spectrală a fost efectuată, si permite identificarea a 30 de compusi si identificarea aproximativ aceluiasi număr de sisteme de spini.
1. www.regielive.ro 2. www.academicdirect.ro 3. Principles and Practice of Analytical Chemistry F.W. Fifield Kingston University and D. Kealey 4. Ioan Silberg „Spectrometria RMN a compusilor organici” Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1978
17
