Universidad Veracruzana Facultad de Química Farmacéutica Biológica Biología Celular
El microscopio de campo oscuro fue diseñado por el Físico Ricgard Zsigmond en 1903 cuando realizaba experimentos en química de coloides. Este es un microscopio óptico estándar de laboratorio en el que ciertas técnicas ópticas son utilizadas para transformar la forma en la que la luz pasa a través de la muestra que se observa. Por lo tanto las partes del microscopio son exactamente las mismas que las de un microscopio de campo claro, cambiando únicamente el condensador. La máxima amplificación útil es entonces de 100x, con una resolución de 200nm. La fuente de iluminación (Iluminador) puede ser una lámpara de Tungsteno o de Halógeno. El microscopio de campo oscuro es una modificación al sistema de campo claro, que consiste en bloquear los rayos centrales que alcanzan al condensador, por medio de un disco o algún otro tipo de dispositivo, de manera tal que el cono iluminador es un cono hueco de luz, con mayor apertura numérica que la del objetivo. Esta forma de iluminación permite que solo aquellos rayos que han sido desviados por la muestra observada, sean captados por el objetivo. Es decir, la imagen microscópica está formada en este caso sólo por rayos difractados y constituye un sistema cuyo funcionamiento se basa en el fenómeno de Tyndall. La técnica de campo oscuro es muy útil para observar materiales en suspensión, permitiendo detectar con gran facilidad partículas sólidas con índices de refracción muy cercanos al del medio en que se encuentran, por esta razón, es un sistema de gran utilidad para realizar conteo de número de partículas en una muestra. De igual forma, resulta una herramienta útil para visualizar estructuras muy delgadas que rebasan los límites conspícuos de la célula u organismo observado. Existen varias posibilidades para lograr la iluminación de campo oscuro, que dependen del tipo del condensador. Existen dos tipos de condensadores: de Refracción y condensadores de Reflexión. Los condensadores por Refracción tienen un disco central que obstruye el paso de la luz, formando así un cono cono hueco de luz. Son relativamente económicos económicos y dentro de su campo, muy versátiles en el uso para objetivos de poco aumento, hasta 40x. Asimismo, este tipo de condensadores pueden improvisarse añadiendo simplemente un disco de cartón negro sobre la lente frontal del condensador. Para usar objetivos 100x en campo oscuro, estos deben de tener incorporado incorporado un diafragma variable tipo Iris que permita permita reducir la apertura numérica del objetivo. 1
Microscopía de Campo Oscuro
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Los condensadores por Reflexión son principalmente de dos tipos: paraboloides y cardioides. En la parte central tienen una superficie reflejante con una curvatura de parábola que refleja lateral y periféricamente los rayos hacia otro espejo que circunda el área central, esta superficie tiene una inclinación suficiente para producir un cono luminoso que es el que proporciona y envía la luz hacia la muestra a observar. La ventaja principal de estos condensadores es la alta densidad luminosa de la que proveen a la muestra y la posibilidad de usar aumentos del objetivo superiores a 40x. El condensador paraboloide, consiste en un bloque de cristal en forma de parábola interiormente espejado. Un sistema previo produce luz paralela que después va estigmáticamente al foco del paraboloide, donde se encuentra la preparación. El condensador cardioide tiene dos superficies espejadas en vez de una, pero es prácticamente el mismo resultado aunque el condensador cardioide tiene mayor amplificación para Treponemas y además proporciona corrección cromática. Una variante de estos condensadores para campo oscuro por reflexiones, la presentan los condensadores tóricos o toroides. Estos condensadores tienen una lente tórica añadida a un condensador cardioide. Dicha lente concentra el 100% de la luz que llega al condensador y la envía al espejo cardioide de forma tal que el objeto sea iluminado con el 100% de la luz que llega del condensador. Se puede decir que este tipo de condensador es el mejor, cuando las condiciones de trabajo involucran aumentos superiores a 40x en los objetivos. VENTAJAS
Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo. Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas. Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear. Visualiza los bordes destacados delas muestras. Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema Pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 µm.
| DESVENTAJAS Presenta imágenes con poca resolución debido a la difracción. Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. No deja visualizar estructuras celulares específicas, solo bordes de células o partículas.
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APLICACIONES Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin matar o teñir la muestra. Las preparaciones que se utilizan deben ser frescas pues se requieren organismos activos para observar su movimiento. En el laboratorio Clínico se utiliza para el examen de organismos como Treponema Pallydum, Bornelia y Leptospira (agentes de cuadros sistemáticos) estas bacterias tienen un grosor de menos de 0.15 µm por lo que no se ven en campo claro. Esta técnica es útil para observar autoradiografias y cristales en la orina. La técnica de campo oscuro puede combinarse con otras como la microscopia en fluorescencia y la polarización, sumándose las ventajas de estas técnicas de campo oscuro. BIBLIOGRAFÍA
Anton Roca, Joan. Corominas, Nuria Tomas. Óptica instrumental. (1996). 1ª Edición. Editorial UPC. Barcelona, España. Pág. 191-193. Martínez M. Alejandro. El Microscopio de Campo Oscuro. (1988).Revista de Difusión CIENCIAS.UNAM. http://www.ejournal.unam.mx/cns/no12/CNS01210.pdf
Karp Gerard. Biología Celular y Molecular. (1991). 2ª Edición. McGraw Hill. México.
ULTRAMICROSCOPIO
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