INTRODUCCIÓN El presente trabajo tiene la finalidad de dar detalle acerca del Microscopio electrónico, el cual es un instrumento que se usa actualmente, con un fundamento de Física Moderna, y que tiene bastantes aplicaciones en campos tanto de investigación científica como en la industria. OBJETIVOS
Saber las funciones del microscopio electrónico Averiguar los tipos de microscopios electrónicos que existen Conocer el proceso
¿QUÉ ES EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO? El microscopio electrónico es un instrumento que utiliza electrones, en lugar de fotones, para visualizar imágenes de objetos diminutos. Estos instrumentos tienen la capacidad de alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces más potentes que las imágenes tomadas por los mejores microscopios microscop ios ópticos. En promedio, si un microscopio óptico provoca aumentos de 2000x, el microscopio electrónico puede realizar aumentos de 1000000x. Esto se debe a que la longitud de onda de los electrones (0.5 Angstroms) es más pequeña que la de los fotones visibles (4000 Angstroms). Los microscopios electrónicos pueden alcanzar resoluciones mejores a la de 50 pm. Este instrumento es utilizado para investigar la ultra-estructura (estructura detallada de un espécimen como una célula o un órgano) de una amplia variedad de especímenes biológicos e inorgánicos, como por ejemplo microorganismos, células, moléculas grandes, metales, cristales, biopsias, etc. También tiene aplicaciones industriales orientadas al control de calidad y el análisis de fallas. Los microscopios electrónicos modernos producen micrografías electrónicas, es decir representaciones de objetos que no pueden ser captados ni por los microscopios ópticos. Para lograr esto utilizan cámaras digitales o digitalizadores de videos con objetivo de capturar la imagen. HISTORIA Este instrumento fue inventado en Alemania por el físico Ernst Ruska y el ingeniero elctrónico Max Knoll en 1931. La óptica electrónica fue desarrollada en 1926 por el físico alemán Busch. En 1933, Ruska inventó un microscopio electrónico que excedía la resolución alcanzable de un microscopio óptico. Reinhold Rudenberg, director de Siemens-Schuckertwerke, obtuvo la patente de este invento en Mayo de 1931. Por otra parte, en 1932 Ernst Lubcke de la empresa Siemens & Halske inventó y obtuvo imágenes de un prototipo de un microscopio electrónico, aplicando conceptos descritos en las aplicaciones de la patente de Rudenberg. 5 años después esta firma financió el trabajo
de Ernst Ruska y Bodo von Borries junto a Helmut Ruska desarrollaron aplicaciones para el microscopio, especialmente con especímenes biológicos. En 1937 también, Manfred von Adenne fue pionero del microscopio electrónico de barrido. El primer microscopio electrónico práctico fue desarrollado en 1938 por Eli Franklin Burton en la Universidad de Toronto, y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo el primer microscopio electrónico de transmisión comercial en 1939. A fines del siglo XX el microscopio electrónico tenía una resolución del orden de 1000 veces la del microscopio de luz (0,2 y 200 nanómetros respectivamente). Los microscopios contemporáneos alcanzan ampliaciones de 2 millones y están basados en el prototipo de Ruska. Teoricamente la máxima resolución d que puede ser alcanzada por un microscopio óptico es:
Gracias a la teoría desarrollada por Louis-Victor de Broglie (Dualidad onda-partícula), un haz de electrones también podría comportarse como un rayo de radiación electromagnética. La longitud de onda se puede obtener de la ecuación:
Dónde: h: constante de Planck m0: Es la masa en reposo del electrón E: Energía del electrón acelerado c: velocidad de la luz ¿CÓMO FUNCIONA? Este dispositivo utiliza un haz de electrones, generado por un cañón electrónico, los cuales son acelerados por un alto voltaje y están focalizados por medio de lentes magnéticos. Este haz de electrones se da en un alto vacío debido a que los electrones son absorbidos por el aire. El rayo de electrones atraviesa la muestra, la cual ha debido ser preparada adecuadamente como luego explicaremos, y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticos que forman la imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de electrones y transfiere esta imagen a la pantalla del ordenador. Cabe destacar que estas imágenes producidas por el microscopio electrónico
no dan ninguna información del color (debido a que es una propiedad de la luz), sin embargo es posible darle color a las imágenes posteriormente aplicando retoques digitales a través de un ordenador. La manera de seguir los electrones es que los lentes electroestáticos y electromagnéticos son usados por el microscopio para controlar el rayo de electrones y enfocarlo para formar la imagen. Estos lentes son análogos a los lentes del microscopio electrónico.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Figura #1 Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:SimpleSEMandTEM.jpg Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Es un microscopio que emite un haz de electrones al objeto que se quiere visualizar, una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto, los demás atraviesan el objeto y forman la imagen aumentada. Para utilizarse la muestra se debe cortar en capas finas, no mayores a un par de miles de angstroms. Estos microscopios tienen una capacidad de aumentar la imagen hasta un millón de veces. Este tipo de microscopios tiene principal aplicación en el estudio de metales y minerales y el estudio de las células a nivel molecular, toma un papel importante en la industria de la metalurgia. También se utiliza en la microbiología para observar la estructura de los virus y en la Anatomía patológica, para diagnosticar partiendo de la ultrahipermegaestructura celular.
Cabe destacar que en el TEM la velocidad del electrón tiende a la velocidad de la luz por un proceso llamado emisión termoiónica desde un filamento, usualmente tungsteno. Los electrones son acelerados por la diferencia de potencial y enfocadas por lentes electroestáticos y electromagnéticos. El rayo transmitido posee información de la densidad del electrón, fase, periodo, etc.
Figura #2: Imagen del virus de polio por el TEM (30 nm) Fuente: https://en.wikipedia.org/wiki/File:Polio_EM_PHIL_1875_lores.PNG Microscopio electrónico de barrido (SEM) En este microscopio la muestra esta cubierta por una capa de metal delgada la cual es barrida por un grupo de electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra (esto lo hace capaz de formar figuras en 3 dimensiones) en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo de la calidad del microscopio. Este microscopio permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. Sus aplicaciones se encuentran en el estudio de circuitos integrados, donde a la propiedad de que como el campo electrónico modifica la trayectoria de los electrones, cuando el circuito integrado está en funcionamiento, con el microscopio podemos apreciar el potencial de cada elemento del circuito.
Figura #3: Imagen de una hormiga por el SEM Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ant_SEM.jpg
Microscopio electrónico de reflexión (REM) Al igual que un TEM, un haz de electrones incide en la superficie, pero en vez de usar la transmisión de la TEM o los electrones secundarios (SEM), el rayo reflejado de electrones dispersados elásticamente es el que se detecta. Esta técnica es generalmente usada junto a difracción de reflexión de electrones de alta energía (RHEED) y espectroscopía de la reflexión de pérdidas de alta energía (RHELS). Microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) Es un microscopio que sirve para muestras que han sido adelgazadas con la finalidad de facilitar la detección de los electrones dispersados en el espécimen. Es similar al TEM, pero en STEM se puede obtener altas resoluciones. Antes de que los electrones toquen el espécimen, STEM usa un rayo de barrido como el del SEM que simplifica el anular imágenes oscuras y otras técnicas de análisis. Las imágenes se adquieren en serie y no en paralelo. A menudo TEM puede ser equipado con la opción de barrido y funcionar como TEM y STEM. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Los materias que quieren ser analizados por un microscopio electrónico deben ser preparados antes de comenzar el proceso con la finalidad de obtener una imagen adecuada, la técnica varía dependiendo del espécimen y el análisis.
Fijación química. Para especímenes biológicos se pretende estabilizar la estructura móvil macromolecular del espécimen uniendo las proteínas con aldehídos como por ejemplo los formaldehidos, glutaraldehidos, lípidos y tetróxido de osmio. Tinción negativa. Las suspensiones que contengan nanopartículas o material biológico fino (bacterias, virus) son mezclados brevemente con una solución diluida de una solución electro opaca como molibdato de amonio, acetato de uranilo (o de formiato), o ácido fosfotúngstico. Esta mezcla se aplica a una rejilla EM recubierta adecuadamente, se transfiere y se deja secar. La supervisión de esta mezcla en una TEM debe ser llevada sin ningún retraso para mejores resultados. Este método es importante en microbiología para una rápida pero cruda identificación morfológica, pero también puede ser usado como base para reconstrucciones 3D de alta resolución usando la metodología de tomografía EM cuando se utilizan capas de carbono para apoyo. La tinción negativa también es usada para observar nanopartículas. Criofijación. Consiste en congelar un espécimen tan rápidamente (a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido) tal que el agua forme hielo vítreo (no cristalino). Esto conserva el especímen en una muestra de su estado de solución. Mediante el desarrollo del CEMOVIS (Microscopio crioelectrónico de secciones vítreas) es posible observar muestras de prácticamente cualquier espécimen biológico cercanos a su estado natural. Deshidratación. Secado por congelación, reemplazar el agua con solventes orgánicos como etanol o acetona, seguido de un secado por punto crítico o infiltración con resinas que se incrustan. Incorporación de especímenes biológicos. Después de la deshidratación, los tejidos que se quieren observar en el TEM son incrustados con la finalidad de que este parcialmente listo para la visualización. Para hacer esto el tejido se pasa por una transición disolvente como el óxido de propileno, y luego es infiltrado con una resina epoxi (polímero termoestable) como por ejemplo Araldite o Durcupan. Los tejidos también pueden ser incrustados directamente en una resina acrílica miscible en agua. Luego de que la resina ha sido polarizada (endurecida) la muestra es seccionada (secciones ultra-delgadas) y teñida, donde está listo para visualizarse. Incorporación de materiales. Luego de incorporar en resinas, la muestra debe ser pulida a un acabado de espejo usando abrasivos ultra-finos. El proceso de pulido debe realizarse cuidadosamente para minimizar los arañazos y otros artefactos de pulido que pueden reducir la calidad de la imagen. Seccionamiento. Se producen rebanadas delgadas del espécimen, semitransparentes a los electrones. Estos pueden ser cortados a un ultramicrotomo usando una cuchilla de diamante para producir cortes ultra-finos de 60-90 nm de espesor. También se usan cuchillas de vidrio desechables ya que pueden ser hechas en el laboratorio y no son tan costosas. Fractura por congelación o grabado de congelación. Es un método de preparación que sirve particularmente para examinar membranas lipídicas y sus
proteínas incorporadas “a la vista”. El tejido fresco o la suspensión de células se congelan rápidamente (crofijación), luego se fracturan por una separación simple o mediante el uso de un micrótomo mientras son mantenidas a una temperatura de nitrógeno líquido. La superficie fracturada (a veces en relieve mediante un aumento de temperatura a -100°C para varios minutos para permitir que algo de hielo se sublime) es luego sombreada con platino u oro en vapor con un ángulo en promedio de 45° en un evaporador de alto vacío. Una segunda capa de carbono, evaporada perpendicularmente al plano de la superficie media también puede ser realizada para mejorar la estabilidad de la capa de réplica. Luego el espécimen regresa a su temperatura y presión ambiente y luego la extremadamente frágil réplica de metal “pre -sombreada” de la superficie de la fractura es liberada del material biológico subyacente mediante una digestión química cuidadosa con ácidos, soluciones de hipoclorito o detergente SDS. La réplica aún flotante se lava completamente con tal de que esté libre de residuos químicos, luego es secada cuidadosamente y llevada al TEM. Molienda con rayos iónicos. Estos rayos adelgazan las muestras hasta que sean transparentes a los electrones, esto es provocado por el disparo de iones (generalmente argón) a la superficie desde un ángulo y pulverizando el material de la superficie. También se puede usar una molienda enfocada donde iones de galio son usados para producir una membrana transparente de electrones en una región específica de la muestra por ejemplo un dispositivo de un microprocesador. Este método también es usado para un pulido de la sección transversal antes de un análisis de materiales con el SEM ya que es difícil lograrlo con una pulverización mecánica. Recubrimiento conductor. Un recubrimiento ultra-delgado de material conductor de electricidad, depositada ya sea por una evaporación en alto vacío o por una pulverización catódica en bajo vacío causada por el recubrimiento de la muestra. Esto se hace con la finalidad de prevenir la acumulación de campos estáticos en la muestra por la irradiación de electrones requerida en la visualización. Los materiales con que se cubre el objeto pueden ser oro, oro/paladio, platino, tungsteno, grafito, etc. Conexión a tierra. Para evitar una sobrecarga eléctrica en una muestra cubierta conductora. Generalmente es conectado al soporte de la muestra metálica. Usualmente es usado un conductor de electricidad adhesivo.
DESVENTAJAS
Una de las principales desventajas de estos aparatos es que son muy costosos de construir y mantener, sin embargo hoy en día los precios de los microscopios electrónicos y los ópticos se sobrelapan. Los microscopios destinados a alta resolución deben ser mantenidos en edificios estables (algunas veces subterráneos) con servicios especiales como un anulador de campos magnéticos. Otra desventaja es que las muestras deben ser vistas en vacío ya que el aire dispersa los electrones.
Los SEM operando en su tradicional modo de alto vacío usualmente se usan para especímenes conductivos, por lo que los especímenes no conductivos requieren un encubrimiento (oro/paladio, carbono, etc). El modo de bajo voltaje de los microscopios modernos hace posible la observación de especímenes no-conductivos sin necesidad de encubrimiento. APLICACIONES
Semiconductores y almacenamiento de datos
Analisis de fallos Analisis de defectos Edicion de circuitos
Biología y ciencias de seres vivos
Criobiología Toxicología Tomografía electrónica Virología Farmacéuticos Análisis de partículas
Investigación de materiales
Nanometrología Clasificación de materiales Testing de dispositivos
Industria
Forense Imágenes de alta resolución Minería Industria química Preparación de muestas
FUENTES BIBLIOGRÁFICAS https://es.wikipedia.org/wiki/Ernst_Ruska http://ingeniatic.euitt.upm.es/index.php/tecnologias/item/520-microscopioelectr%C3%B3nico http://sumsaiumu.wordpress.com/trabajo/solicitud-de-trabajo/tecnicas/ https://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscope https://en.wikipedia.org/wiki/Ground_%28electricity%29 https://en.wikipedia.org/wiki/Staining http://www.amemi.org/Docs/simposia_biologia/pre_orales/MICROSCOPIA_ELECTRONIC A.pdf
