TEMA 3: Métodos para el análisis de proteínas 3.1. Cuantificación de proteínas totales. 3.2. Técnicas de separación de proteínas. Análisis de proteínas específicas. INTRODUCCIÓN A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en el estudio de las proteínas plasmáticas. Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquíd cefalorraquídeo eo (15-45 mg/dL). mg/d L). Si nos centramos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar: Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma. Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras células. • •
Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas, ganglios linfáticos, bazo y médula ósea. En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas totales sirve para el diagnóstico de: Afecciones hepáticas Afecciones de la médula ósea Otras afecciones del metabolismo o nutricionales • • •
3.1. Cuantificaci ón de proteín as totales Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes: •
Método del Biuret
En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina. Proteína + Cu+2
Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor. •
Método de Lowry
Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reacción de Biuret
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2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2 , reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina. •
Turbidimetría
•
Absorción en el ultravioleta
Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromáticos de triptófano y tirosina. •
Métodos de unión a colorantes
NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se utilizan tiras reactivas. 3.2. Técnicas de separación y análisis de las proteínas La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico clínico. Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas son los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Turbidimetría y nefelometría Inmunodifusión Electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis en cohete Inmunofijación Cromatografía
1.- TURBIDI METRÍA Y NEFELOMETRÍA Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea. La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.
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1.1. La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
1.2. La nefelometría : mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones más diluidas.
Aspectos prácticos: Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada ej. lipoproteínas, quilomicrones También puede interferir la suciedad. La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta (? < 300nm) y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. •
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Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas proteínas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetría e inmunonefelometría . Para enteder estas técnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos: •
Antígenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamaño, capaces de estimular el sistema inmunológico de un animal y originar una respuesta dirigida específicamente contra él.
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Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno que reconoce y se une al anticuerpo. Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos B y su progenie (células plasmáticas) que se combinan específicamente con los antígenos.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rápidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y, es precisamente en ésta fase en la que aparece la dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se mide la dispersión de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de látex para aumentar el tamaño de los complejos (inmunoanálisis potenciados). 2.- INMU NODIFUSIÓN La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa). La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac como afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac. La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. negro amido o azul brillante de Coomassie). La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre otras modalidades podemos hablar de: a) Inmunodifusión radial: en este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. Em la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación
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a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony : se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente.
Inconvenientes de la inmunodifusión: 1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. 2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentración de Ag o Ac en el gel. 3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o espeso. 3. ELECTROFORESIS Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico). Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos 5
(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.
NOTA: El pH al que un aa no se comporta ni como ácido ni como base se denomina punto isoeléctrico pI (en él la estructura del aa no posee carga neta). Los pI varían desde 3 a 10, sin que exista un pH al que todos los aa sean neutros. •
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•
a pH superior 2 o + unidades a pI, el aa aparece cargado negativamente a pH inferior 2 o + unidades a pI el aminoácido aparece cargado positivamente pH = pI los aa aparecen como iones dipolares neutros
En soluciones muy ácidas todos los aa aparecen como cationes, mientras que en soluciones muy básicas los aa se encuentran en forma aniónica..
Si una disolución de proteínas se somete a la acción de un campo eléctrico la tasa de migración durante la electroforesis depende de: • • •
La carga neta de la molécula, su forma y tamaño La fuerza del campo eléctrico Características del soporte
La cantidad de carga neta en la molécula es variable y depende del pH del amortiguador. Si el pH del medio es menor que el punto isoeléctrico, las proteínas se comportan como cationes y, si el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones. La carga de la proteína se hace más negativa a medida que el pH del amortiguador se hace más básico. A pH 8,6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen carga global negativa). La albúmina, con pI de 4,7 tendrá una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que la albúmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico. Hay numerosos sistemas de electroforesis de proteínas comercialmente disponibles. En clínica el suero es la muestra de elección. Se puede usar plasma pero, en ese caso se observará una banda adicional de fibrinógeno. También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugación, diálisis u otras técnicas de concentración. Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:
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1. 2. 3.
Separación electroforética mediante un campo eléctrico Fijación de las proteínas sobre el soporte Revelado de las proteínas para identificar su presencia y
separación. Se realiza mediante colorantes ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso de colorante se arrastra con mezclas acético-agua, o metanol-acético, según el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del colorante fijado a las proteínas. 4. C u a n t i f i c a c i ó n de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la representación gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las fracciones proteícas del suero sanguíneo).
Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es de “acetato de celulosa” las principales fracciones proteícas son
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•
•
La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto al punto de aplicación de la muestra (cátodo) Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%), beta (ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas, inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha).
El fibrinógeno aparece entre las ß y ? globulinas cuando la muestra utilizada es plasma no así en el suero (se ha consumido en la coagulación). Cuando el soporte es gel de agarosa las ß-globulinas, se dividen en: ß-1 y ß-2. Es muy importante tener en cuenta que
c a d a f r a c ci ó n e s t á f o r m a d a p o r un conjunto de proteínas con una movilidad electroforética semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y f u n c i ó n . Además, excepto la albúmina, el resto de las fracciones
corresponden a grupos de proteínas, por ello, aunque el resultado de la fracción sea normal, puede existir variación porcentual en sus componentes. Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la inmunoelectroforesis.
4. INMUNOELECTROFORESIS La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica para separar las proteínas de la muestra. Esta técnica se realiza en dos fases: •
•
Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga. Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la dirección del campo eléctrico. El o los anticuerpos
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difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación.
Se utiliza fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones de distintas proteínas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o líquido cefalorraquídeo. 5. IN MUNOELECTROFORESIS EN COHETE La inmunoelectroforesis en cohete es una técnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusión radial pero, a en la que la placa se expone a un campo eléctrico. Al igual que en la inmunodifusión radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el cátodo) que se rellenarán con la muestra o con diluciones patrón. Una vez depositadas éstas se activa el campo eléctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac. La precipitación va produciéndose a medida que el Ag avanza hacia el ánodo de manera que al ir disminuyendo la concentración de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse. Así, se produce una precipitación triangular (en estela de cohete). La concentración de Ag de la muestra es directamente proporcional al área y altura del triángulo. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrón obtendremos un resultado cuantitativo.
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6. INM UNOFIJA CIÓN La inmunofijación consiste en la separación electroforética de las proteínas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de precipitación visulalizadas tras lavar y teñir. Es una técnica muy rápida que se utiliza especialmente en le detección de bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo. Preguntas de revisión 1. Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de suero ¿Qué método emplearía? 2.
Describa el fundamento del método anterior
3.
¿Sabría idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho método?
4.
¿Sería necesario preparar algún blanco? Razone su respuesta
5. Un paciente con un mieloma: a) ¿Tendría hiper o hipoproteinemia? b) Si quisiera identificar la inmunoglobulina que aparece alterada ¿qué técnica podría utilizar? c) ¿Y si quisiera cuantificarla? 6. ¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas? Conteste razonadamente. 7. a) b) c) d) e)
La nefelometría difiere de la turbidimetría en: Mide el índice de refracción Ángulo de medida de la luz dispersa Tiene menor sensibilidad Se pueden medir partículas de bajo peso molecular La solución no necesita ser homogénea
8. a) b) c) d) e)
La La La La La La
nefelometría mide: luz dispersada luz transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la luz dispersada luz reflejada
9. a) b) c) d) e)
La La La La La La
turbidimetría mide luz dispersada luz transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la luz dispersada luz reflejada
10.
Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de las medidas nefelométricas Su principal aplicación es en la medida de reacciones Ag-Ac Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro. Se hacen en ángulos de 15 a 90º respecto a la luz incidente.
a) b) c)
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11. a) b) c) d) e)
La turbidimetría se puede medir: En turbidímetros especiales. En aparatos con un monocromador de turbidez. En aparatos con un detector especial para la luz dispersa. En cualquier espectrofotómetro o analizador de química clínica. En aparatos con cubetas especiales
12. a) b) c) d) e)
El ángulo de medida de la luz dispersa en turbidimetría es: 0o 10o 15 a 90o 90o Cualquiera
13. a) b) c) d) e)
El ángulo de medida de la luz dispersa en nefelometría es: 0º 10º 15 a 90º 90º Cualquiera
14. a) b) c)
La longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa: Debe ser tal que no se absorba luz por los componentes del suero. Debe ser lo menor posible Deber ser lo mayor posible
15. La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa ¿Por qué? 16 ¿Cuál cree que es el principal inconveniente de las técnicas inmunológicas? a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren dentro de la zona de equivalencia b) Son téc nicas poco sensibles c) Son técnicas poco específicas 17. La inmunodifusión doble es una técnica cualitativa o semicuantitativa ¿por qué? 18. En un campo eléctrico, una molécula cargada negativamente migra hacia el: a) Ánodo b) Cátodo c) Polo negativo d) Polo positivo e) ay d 19. ¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo eléctrico) a) pH del tampón b) Fuerza iónica del tampón. a) Tamaño y forma de la partícula. b) Potencial del campo. c) Todos 20. El punto isoeléctrico es: a) El pH al cual una partícula no se mueve b) El pH al cual una partícula migra al ánodo c) El pH al que la carga neta de la partícula es cero. d) ayc
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e)
ayb
21. ¿Cuál es el medio de soporte más empleado en electroforesis? 22. ¿Cuál es el método de elección para la lectura de un espectro electroforético? a) Nefelometría b) Turbidimetría c) Elusión d) Fotodensitometría 23. Hemos sometido una muestra de suero a una separación electroforética, a pH 8,6, sobre acetato de celulosa a) ¿Qué componentes se nos han separado en el proceso? b) ¿A qué cambios en el proceso recurriremos según queramos cuantificar proteínas o lipoproteínas? 24. ¿Sería conveniente llevar a cabo la electroforesis de proteínas a pH 6? ¿Por qué?
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