I.
JUDUL II. III. IV.
: Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret HARI/TANGGAL : Kamis, 23 Oktober 2014 TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara biuret DASAR TEORI : Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk mengetahui tentang protein dan hal-hal yang berkaitan dengannya. Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi, yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun irreversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion zat terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Kelarutan protein di dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya. Telur puyuh memiliki ciri khas unik yang berbeda dengan jenis telur lainnya yaitu berbentuk oval, mungil, berwarna putih keabuan dengan corak hitam kecoklatan dan memiliki berat antara 10 hingga 12 gram perbutirnya. Telur yang memiliki genus Conturnix ini memang mudah di dapat dengan harga yang relative murah. Dalam 100 gram telur puyuh mengandung 13,05 gram protein, sedikit lebih tinggi dari telur ayam dan telur bebek. Dari kandungan protein yang tinggi ini menyimpan satu keunggulan, yaitu memiliki daya cerna yang sangat tinggi, artinya setiap gram protein yang masuk akan dicerna di dalam tubuh secara sempurna. Oleh karena itu, telur puyuh merupakan sumber protein terbaik. Telur puyuh mempunyai beberapa manfaat yaitu: 1. Sebagai nutrisi otak dari kandungan 263,4 mg kolin dalam 100 gramnya. Manfaat ini sangat membantu untuk memperkuat daya
ingat bagi anak- anak, menghindari kepikunan bagi orang tua lanjut usia, mengurangi resiko kematian pada janin bagi ibu hamil, mendukung perkembangan otak bayi secara optimal bagi ibu menyusui, juga mempertahankan fungsi otak agar tetap bugar dan memperbaiki memori otak yang rusak bagi mereka dalam usia produktif, 2. Untuk melindungi mata dari kandungan senyawa lutein dan zeaksatin. Dari kedua senyawa inilah yang memberikan pigmen berwarna kuning, sehingga dapat membantu melindungi mata dari kerusakan dengan cara memfilter sinar biru yang berasal dari pancaran sinar matahari, layar televisi, ataupun komputer bagi bayi dan anak- anak. 3. Untuk mereduksi resiko penyakit kanker dan tumor dari kandungan leutin dan zeaksatin Untuk mendapat manfaat tersebut, hendaknya makan secukupnya atau dengan kata lain berada dalam batas yang normal dan tidak sering dikonsumsi untuk menghindari terjadinya hal- hal yang tidak diinginkan. Apabila konsumsi telur puyuh secara berlebihan dan berulang- ulang, kemungkinan dapat terjadi alergi pada semua usia yang ditandai dengan gatal- gatal, merah, mual, muntah, pusing dan bentuk alergi lainnya. Selain itu juga dapat menimbulkan jerawat pada usia remaja hingga kolesterol yang bisa menyerang dari usia anak- anak hingga dewasa. Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu, secara kualitatif terdiri atas: reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV. Metode Biuret Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif
yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. Reaksinya yang terbentuk adalah sebagai berikut:
Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Dalam hal ini, hukum Lambert-Beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Di bawah ini adalah persamaan Lambert-Beer: A = - log T = εb c Dengan A = absorban ; T = transmitan; ε = absortivitas molar (Lcm-1.mol1
) ; b = panjang sel (cm) ; dan c = konsentrasi zat (mol/L).
Spektrum absorpsi yang diperoleh dari hasil analisis dapat memberikan informasi panjang gelombang dengan absorbansi maksimum dari senyawa atau unsur. Panjang gelombang dan absorbansi yang dihasilkan selama proses analisis digunakan untuk membuat kurva standar. Konsentrasi suatu senyawa atau unsur dapat dihitung dari kurva standar yang diukur pada panjang gelombang dengan absorbansi maksimum. Dari kurva standar kalibrasi, diperoleh persamaan garis: y = ax + b Dimana y merupakan serapan dan x adalah konsentrasi unsur atau senyawa. Dengan persamaan garis tersebut dapat ditentukan konsentrasi sampel. Pada spektrofotometer UV-Vis, warna yang diserap oleh suatu senyawa atau unsur adalah warna komplementer dari warna yang teramati. Hal tersebut dapat diketahui dari larutan berwarna yang memiliki serapan maksimum pada warna komplementernya. Namun, apabila larutan berwarna dilewati radiasi atau cahaya putih, maka radiasi tersebut pada panjang gelombang tertentu akan diserap secara selektif sedangkan radiasi yang tidak diserap akan diteruskan. V.
ALAT DAN BAHAN 1. Alat: a. b. c. d. e. 2. Bahan a. b. c. d.
Tabung reaksi 9 buah Pipet gondok 1 buah Gelas kimia 7 buah Gelas ukur 1 buah Spatula 1 buah : Larutan standar protein Larutan sampel protein Reagen biuret Aquades
VI.
ALUR KERJA Pembuatan Larutan standar
ml larutan standar protein dengan kadar 1mg, 2mg,3mg, 4mg, 5mg per ml protein
Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 39oC selama 10 menit Dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan semp Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
Absorbansi
Penetapan absorbansi larutan blanko 1 ml aquades
Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 39oC selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-V Absorbansi
Penetapan absorbansi larutan sampel
0.4 gram putih telur puyuh Dilarutkan pada 100 mL air Absorbansi
1 ml putih larutan sampel Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 39oC selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
Absorbansi
VII.
HASIL PENGAMATAN Prosedur Percobaan Pembuatan larutan standar
Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Larutan Standar: tidak Kandungan senyawa/zat
berwarna an standar protein dengan kadar 1 mg, 2 mg,3 mg, 4 mg, 5 mg per ml proteinreagen biuret : → CuSO4 H O: tidak berwarna
Kesimpulan pada Dari spektrosfotometri UV-Vis
didapatkan
memberikan persamaan :
2
Reagen biuret : larutan kompleks berwarna → NaOH memberikan h 4 ml reagen biuret biru jernih suasana basa (mengubah Cu2+ si pada suhu 39oC selama 10 menit Volume pengenceran n pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil dan sempurna → Cu+) bertahap 5mg/l hingga 1
bsorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
Y=0.04649x
dengan
R2= 0,98296 Dari microsoft excel didapatkan
2+ membentuk persamaan: mg/l pada labu ukur 10 Larutan ion Cu kompleks dengan ikatan peptida Y=0.0476x -0.004 mL: R2= 0.9825 suatu protein sehingga a. V1 = 5 ml menghsilkan warna ungu dengan b. V2 = 8 ml
Absorbansi
c. V3 = 7.5ml
absorbansi
d. V4 = 6.67 ml
gelombang ( λ ) maksimal 540
e. V5 = 5 ml
dari
panjang
nm Reaksi : CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq)
Sebelum :
Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O(l)
Larutan standar berbagai Dalam suasana basa konsentrasi
:
2+ tidak Cu(OH)2(aq) ↔ Cu (aq) + 2OH (aq)
berwarna Sesudah : Larutan
standar
+
Reagen Biuret : larutan biru jernih Larutan standar + r. Biuret + diinkubasi : larutan biru-ungu Kepekatan larutan dari pekat sampai tidak pekat (ungu-biru
tua
keunguan) 5mg> 4mg> 3mg> 2mg> 1mg
C (mg/ml) 1 2 3 4 5
A 0.043 0.091 0.132 0.203 0.225
Dari sepktrosfotometri UVVis didapatkan persamaan : y = 0,0395x + 0,02942 R2 = 0,99618
2.
Penetapan absorbansi larutan blanko
Sebelum : Aquades
Larutan :
tidak
berwarna Reagen biuret : biru
blangko
aquades adalah 0
1 ml aquades
jernih Sesudah :
bah 4 ml reagen biuret Aquades + reagen biuret ok : biru jernih (+) basi pada suhu 39oC selama 10 menit absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
Absorbansi
Penetapan absorbansi larutan sampel
Sebelum : Sampel : tidak berwarna % kadar protein telur puyuh Sesuai
perhitungan
dan encer 0.4 gram putih telur puyuh Dilarutkan pada 100 mL air
literatur 13, 6%
Reagen biuret : biru
Ditambah 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 39oC selama 10 menit Diukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis
Sampel + reagen biuret :
Absorbansi
Sampel + reagen biuret + diinkubasi : biru (+) Sampel Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3
didapatkan sebesar 3.05%
biru jernih 1 ml sampel
grafik
protein
jernih Sesudah :
Absorbansi
dari
Absorbansi 0.095 0.039 0.029
excel kadar rata-rata
VIII. ANALISIS DATA DAN PEMBAHASAN Pembuatan Larutan Standar Pada percobaan ini terlebih dahulu membuat lima larutan standar dengan kadar yang berbeda- beda, yaitu 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, dan 5 mg dari larutan induk yang sama. Kemudian masing- masing larutan standar protein dari kadar yang berbeda- beda tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL. Lalu masing- masing tabung reaksi ditambahkan 4 mL reagen
biuret
dan
dikocok.
Reagen
biuret
dapat
dibuat
dengan
mencampurkan larutan NaOH dengan CuSO4 yang sesuai dengan persamaan reaksi sebagai berikut: CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq) Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O(l) Penambahan biuret mengakibatkan larutan yang awalnya tidak berwarna menjadi biru, jernih. Hal ini dikarenakan ion Cu2+ dalam pereaksi biuret dapat membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada larutan induk protein, yang sesuai dengan reaksi di bawah ini:
Kemudian diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit yang bertujuan menstabilkan senyawa kompleks yang terbentuk dari reaksi antara ion Cu 2+ dengan larutan induk protein. Setelah itu diukur absorbansi larutan standar ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Hasil absorbansinya adalah sebagai berikut:
Konsentrasi (mg/ml) 1 2 3 4 5
Absorbansi 0,043 0,091 0,132 0,203 0,225
Dari data konsentrasi dan absorbansi pada larutan standar tersebut, didapatkan kurva seperti berikut ini:
Kurva Standar 0.25 f(x) = 0.05x - 0 R² = 0.98
0.2 0.15 Absorbansi
0.1 0.05 0 0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
konsentrasi (mg/mL)
Dari kurva larutan standar protein didapatkan persamaan y = 0,0476x + 0,004 denga regresi linear (R2) sebesar 0,9825. Persamaan garis tersebut akan digunakan untuk menghitung kadar protein dalam larutan blanko dan larutan sampel.
Penetapan Absorbansi Larutan Blanko Larutan blanko ini terbuat dari 1 mL aquades yang merupakan larutan tidak berwarna ditambah 4 mL reagen biuret, sehingga menghasilkan larutan berwarna biru jernih. Warna biru jernih ini menandakan tidak terbentuknya senyawa kompleks karena aquades tidak mengandung protein. Setelah itu larutan blanko diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit agar mendapat kepekatan larutan secara maksimal. Kemudian diukur absorbansi larutan blanko ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UVVis. Dari pengukuran tersebut didapatkan nilai absorbansi sebesar 0. Penentuan Absorbansi Larutan Sampel Pada penentuan absirbansi larutan sampel mula- mula sampel yang berupa putih telur puyuh ditimbang seberat 0,4 gr, kemudian diencerkan dengan 100 mL aqudes. Setelah itu sampel yang telah diencerkan diambil 1 mL dan dimasukkan masing- masing ke dalam 3 tabung reaksi. Pada masingmasing tabung reaksi tersebut ditambahkan 4 mL reagen biuret kemudian dikocok sehingga menghasilkan larutan berwarna ungu jernih. Warna ungu ini menandakan ion Cu2+ dalam pereaksi biuret dapat membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada larutan sampel protein. Setelah itu diinkubasi pada suhu 39°C selama 10 menit untuk menstabilkan senyawa kompleks yang terbentuk dari reaksi antara ion Cu2+ dengan larutan sampel protein. Kemudian diukur absorbansi larutan sampel ini pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Dari pengukuran tersebut didapatkan nilai absorbansi sebagai berikut. Absorb
C
a
(m
n
g/
s
m
i
L) 2,044 0,837 0,617
0,095 0,039 0,029
Nilai absorbansi ini akan digunakan untuk mencari kadar protein dalam larutan sampel dengan menggunakan persamaan kurva larutan standar. y = 0,0476x + 0,004 dimana: y = Absorbansi larutan sampel x = Kadar protein dalam larutan sampel sehingga diperoleh: Sampel 1 y
=
0.0476x
-
0.004
0.095 = 0.0476x – 0.004 x= 2.0798 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2 y = 0.0476x
-
0.004
0.039 = 0.0476x – 0.004 x= 0.9034 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 3 y = 0.0476x
-
0.004
0.029 = 0.0478x – 0.004 x= 0.6933 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Kadar protein =
x masa protein
x 100 %
Sampel 1 2.0798 40
x 100% = 5.19 %
Sampel 2 0.9034 40
x 100% = 2.25 %
Sampel 3 0.6933 40
x 100% = 1.73 %
Rata- rata =
5.19+2.25+ 1.73 3
= 3.05 %
IX.
DISKUSI Pada percobaan penentuan kadar protein dengan metode biuret ini di dapatkan sampel putih telur puyuh mengandung protein sebesar 3.05%. Hal ini tidak sesuai teori, dimana kadar protein pada putih telur puyuh sebesar 13%. Ketidaksesuaian ini disebabkan adanya pengotor (kromofor) pada sampel sehingga pada saat di uji dengan uv vis tidak dapat terdetekdi dengan baik, serta belum homogennya sampel dengan aquades sehingga sampel belum terlarut dengan baik.
X.
KESIMPULAN Berdasarkan percobaan tersebut dapat disimpulkan bahwa kadar protein yang terkandung dalam sampel dapat ditentukan dengan metode Biuret dan pada percobaan ini didapatkan kadar protein di dalam sampel putih telur puyuh adalah 3.05%.
XI.
JAWABAN PERTANYAAN 1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standar tersebut tentukan kadar protein sampel. Jawab:
Kurva Standar 0.25 f(x) = 0.05x - 0 R² = 0.98
0.2 0.15 Absorbansi
0.1 0.05 0 0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
konsentrasi (mg/mL)
y = 0,0476x + 0,004 dimana: y = Absorbansi larutan sampel x = Kadar protein dalam larutan sampel sehingga diperoleh: Sampel 1 y
=
0.0476x
-
0.004
0.095 = 0.0476x – 0.004 x= 2.0798 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 2 y = 0.0476x
-
0.004
0.039 = 0.0476x – 0.004 x= 0.9034 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Sampel 3 y = 0.0476x
-
0.004
0.029 = 0.0478x – 0.004 x= 0.6933 mg/mL ( x adalah konsentrasi sampel) Kadar protein =
x masa protein
Sampel 1 2.0798 40 Sampel 2
x 100% = 5.19 %
x 100 %
0.9034 40
x 100% = 2.25 %
Sampel 3 0.6933 40
x 100% = 1.73 %
Rata- rata =
5.19+2.25+ 1.73 3
= 3.05 %
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret? Jika benar demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida ? Jawab: Iya, yaitu dengan cara mengukur absorbansi campuran larutan sampel yang mengandung protein dengan biuret dalam suasana basa yang menghasilkan larutan berwarna ungu, sehingga dapat terbaca pada daerah visibel, yaitu dengan panjang gelombang 520 nm, yang kemudian dapat kita buat grafik antara absorbansi dengan konsentrasi. Dari grafik yang kita buat tersebut, kita bisa mendapatkan persamaan garisnya, sehingga konsentrasi protein yang terkandung dalam sampel dapat kita ketahui melalui grafik tersebut. Sesuai dengan hukum Lambert-Beer nilai absorbansi ini berbanding lurus dengan harga konsentrasi protein yang terkandung di dalam sampel. Contohnya seperti pada grafik di atas.
XII.
DAFTAR PUSTAKA Achmad, Nurdin. 2011. Reaksi Analisa Protein.(http://skp.unair.ac.id) (diakses tanggal 18 Oktober 2014). Anonim.2012.Analisa Protein dengan Metode Biuret. http://www.wikipedia.org/analisa-protein-dengan-metode-biuret (diakses tanggal 18 Oktober 2014). Anonim.2012.Manfaat dan Bahaya Telur Puyuh.
http://www.beritaterkinionline.com/2012/07/manfaat-dan-bahayatelur-puyuh.html (diakses tanggal 22 Oktober 2014) L. Lehninger, Albert. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jilid 1. (Penerjemah: Maggy Thenawidjaja). Jakarta: Erlangga. Tim. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa UniPress.
LAMPIRAN
Sampel ditimbang seberat 0,4 gr
Larutan standart protein, larutan blanko dan sampel
Sampel yang telah diencerkan
Larutan standart protein, larutan blanko dan sampel yang telah di inkubasi
