LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PERCOBAAN IV PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN UJI BIURET
OLEH : NAMA
: NURSAN
STAMBUK
: F1C1 13 028
KELOMPOK
: IV
ASISTEN
: WAODE NURFIARNI SAADAH
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI 2015 I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Kebanyakan masyarakat pada umumnya memenuhi kebutuhan gizi dengan cara mengkonsumsi susu. Susu tersebut merupakan produk buatan pabrik yang dapat berupa susu cair atau dalam bentuk susu bubuk. Selain enak, alasam masyarakat sering mengkonsumsi susu adalah karena susu merupakan minuman pelengkap bagi kebutuhan gizi manusia karena mengandung hampir semua zat gizi yang diperlukan tubuh manusia misalkan karbohidrat, protein, lemak/ lipid, vitamin dan mineral. Susu merupakan salah satu makanan paling lengkap. Bermacam-macam jenis susu, baik dari manusia maupun dari hewan mengandung vitamin, mineral, karbohidrat, lemak dan protein (sebagian besarnya kasein). Untuk jenis susu berbeda, kandungan nutrisinya pun juga berbeda. Susu sapi berbeda dengan susu kambing walaupun terdapat beberapa kesamaan dalam hal zat penyusunnya. Komponen utama dari susu sebenarnya adalah air, lemak dan protein. Protein yang terdapat dalam susu terdiri atas kasein dan whey. Protein penting dalam menyusun komponen sel, terutama dalam proses pertumbuhan dan perkembangan. Sekitar 80% dari protein yang terdapat dalam susu adalah kasein yang biasanya berupa garam dari kalsium. Oleh karena itu, sering kali dikatakan bahwa kasein juga adalah protein susu. Kasein yang dikenal sebagai protein padat dalam susu berasal dari bahasa Latin caseus yang berarti keju. Kasein merupakan fosfoprotein paling dominan yang terdapat pada susu dan keju. Kasein merupakan protein yang terkoagulasi dan tidak mempunyai jembatan disulfida. Sebagian
kecil memiliki struktur sekunder dan sisanya merupakan struktur tersier. Karena strukturnya itu, kasein tidak terdenaturasi seperti protein lain pada umumnya . Kasein juga merupakan protein hidrofobik yaitu asam amino yang mengandung rantai samping non-polar. Protein susu/ kasein merupakan senyawa kompleks dengan partikel yang besar dan sering disebut sebagai kasein misel (casein micell). Ukuran partikel tersebut berkisar antara 30 – 300 nm. Kasein berwarna putih seperti salju dalam keadaan normal, selain itu kasein tidak berbau dan tidak mempunyai rasa yang khas. Oleh karena itu kasein dalam susu dapat dikoagulasikan atau digumpalkan oleh asam yang terbentuk di dalam susu sebagai aktivitas dari mikroba. Berdasarkan uraian diatas, maka perlu dilakukan percobaan tentang penentuan kadar protein dalam susu dengan menggunakan metode biuret. B. Rumusan Masalah Permasalahan dalam praktikum ini yaitu bagaimanakah cara menetapkan kadar protein dalam susu secara Biuret? C.
Tujuan Tujuan yang akan dicapai pada praktikum ini adalah untuk menetapkan kadar protein dalam susu secara Biuret.
D.
Manfaat Manfaat yang diperoleh pada praktikum ini adalah menambah pengetahuan mengenai salah satu metode analisis kadar protein yang terkandung dalam susu dengan menggunakan pereaksi Biuret. II. TINJAUAN PUSTAKA
Protein merupakan biomolekul yang sangat penting. Beberapa fungsi protein adalah sebagai katalisator (enzim), pengangkut dan penyimpanan, penyebab gerakan, pendukung sistem kekebalan, pembentuk dan transmisi impuls saraf, pengontrol pertumbuhan dan diferensiasi, pendukung kekakuan structural, dan lain-lain. Monomer pembentuk protein, asam amino, juga mempunyai peranan penting dalam metabolisme sel hidup. Peranan tersebut adalah sebagai substrat untuk sintesis protein, pemasok nitrogen untuk sintesis senyawa yang mengandung nitrogen lain, dan sumber energy bila dikatabolisme (Toha, 2001). Protein tinggi mempunyai kelas bermacam-macam dalam biomolekuler. Mulai dari perbedaan sifat kimia, seperti berat, bentuk, ukuran dan daya larut, sehingga memungkinkan untuk melaksanakan banyak fungsi biologi. Fungsi ini meliputi katalisator enzim, pengaturan metabolik, mengikat dan mengangkut molekul kecil, pengaturan gen, pertahanan imunologi dan struktur sel. Aktivitas selular dan fungsi tersebut melibatkan satu atau lebih protein. Struktur dasar dari protein adalah asam amino. Dimana ada 20 asam amino yang menyusun protein, semuanya mempunyai bentuk struktural tertentu. Bentuk ini adalah gugus asam karboksilat (-COOH) dan gugus dasar amino (-NH2). Oleh karena itu, yang membedakan bentuk satu dengan yang lain adalah rantai penyusun strukturnya. Asam amino dari protein dihubungkan oleh ikatan peptida antara gugus karboksil dan α –aminonya membentuk polimer linier (Enechi dan Nwabueze, 2013). Peran dan aktivitas protein dalam proses biologis antara lain sebagai katalis enzimatik, bahwa hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalis oleh makromolekul yang disebut enzim yang merupakan satu jenis protein. Sebagian
reaksi seperti hidrasi karbondioksida bersifat sederhana, sedangkan reaksi lainnya seperti replikasi kromosom sangat rumit. Enzim mempunyai daya katalitik yang besar, urnumya meningkatkan kecepatan reaksi sampai jutaan kali. Peran lainnya dari protein dalam sistem biologi adalah sebagai transport dan penyimpanan. Contohnya transport oksigen dalam eritrosit oleh hemoglobin dan rnioglobin yakni sejenis protein yang mentransport oksigen dalam otot. Selain itu terdapat beberapa jenis protein lainnya seperti filamen yang berfungsi dalam koordinasi gerak; protein fibrosa yang berfungsi untuk menjaga ketegangan kulit dan tulang; protein kolagen yang merupakan komponen serat utama dalam kulit, tulang, tendon, tulang rawan dan gigi; antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus (Katili, 2009). Spektroskopi UV adalah salah satu ilmu pengetahuan tentang teknik fisika dari spektroskopi optis penggunaan cahaya tampak, UV, dan mendekati jangkauan inframerah. Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk menentukan konsentrasi dari alat penyerap pada suatu larutan. Hal ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana dengan cepat perubahan absorbansi dengan konsentrasi. Spektroskopi UV-tampak digunakan untuk memperoleh absorbansi spectra dari satu senyawa larutan atau suatu zat padat. Hal yang diamati dengan spektroskopi adalah absorbansi dari energi serap cahaya atau penyinaran elektromagnetik, eksitasi elektron dari keadaan dasar yang merupakan keadaan eksitasi tunggal pada suatu senyawa atau materi. Daerah UV- tampak energi untuk spektrum elektromagnetik adalah 1.5 -
6.2 eV yang mana panjang gelombangnya berkisar dari 800 - 200 nm (Gandhimati dkk., 2012). Prinsip dasar spektrofotometri UV-Vis adalah analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laju larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube ( Setiono, 2013).Spektrofotometri UV-Vis adalah metode analisis berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer dengan suatu materi (senyawa). Metode ini berdasarkan penyerapan sinar ultraviolet maupun sinar tampak yang menyebabkan terjadinya transisi elektron (perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi). Apabila dua buah atom saling berikatan dan membentuk molekul maka akan terjadi tumpang tindih dua orbital dari kedua atom yang masing-masing mengandung satu elektron dan kemudian terbentuk orbital molekul (Octaviani dkk., 2014). III. METODOLOGI PRAKTIKUM A. Waktu dan Tempat Percobaan ini dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 8 Oktober 2015 pukul 15:30-17:30 WITA di Laboratorium Kimia Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Halu Oleo, Kendari. B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah pipet tetes, tabung reaksi, rak tabung, stopwatch dan seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis. 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Susu murni, akuades dan reagen Biuret. C. Prosedur Kerja Larutan sampel -
diambil 1 ml ditambahkan 4 ml reagen biuret dikocok didiamkan 30 menit pada suhu kamar dibaca serapannya pada panjang gelombang 540 nm dengan blanko aquades + 4 ml reagen biuret dihitung kadar protein menggunakan kurva standar
Hasil Pengamatan IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Data Pengamatan 1. Tabel Data Pengamatan Tabel Pengamatan No.
Perlakuan
Hasil Pengamatan
1.
1 mL larutan susu sapi + 4 mL reagen biuret, didiamkan 30 menit
Larutan berwarna ungu
2.
1 mL larutan ASI + 4 mL reagen biuret, didiamkan 30 menit
Gambar
Absorbans
1,859
1,805 Larutan berwarna orange
Tabel kurva standar protein Konsentrasi (ppm) 0 1 2 3 4 5 6
Absorbans 0 0,321 0,576 1,342 1,657 2,115 2,876
2. Grafik Hubungan Konsentrasi dengan Absorbans
Hubungan antara Konsentrasi dengan Absorbans 3.5 3 2.5
f(x) = 0.47x - 0.16 R² = 0.98
2
Absorbans (A) 1.5 1 0.5 0
0
1
2
3
4
Konsentrasi (ppm)
3. Analisis Data Sampel larutan susu sapi Absorbansi sampel = 1,859 y = 0,474x – 0,155 0,474x – 0,155 = 1,859 0,474x = 1,859 + 0,155
5
6
7
0,474x = 2,014 x = 4,25 Kadar protein = 4,25 mg/L x faktor pengenceran = 4,25 mg/L x 10 = 42,5 mg/L Sampel larutan ASI Absorbansi sampel = 1,805 y = 0,474x – 0,155 0,474x – 0,155 = 1,805 0,474x = 1,805 + 0,155 0,474x = 1,960 x = 4,14 Kadar protein = 4,14 mg/L x faktor pengenceran = 4,14 mg/L x 10 = 41,4 mg/L 4. Reaksi B. Pembahasan Protein merupakan senyawa polimer yang tersusun atas asam-asam amino. Asam amino yang terikat dengan asam amino yang lain akan membentuk ikatan peptida (COO-NH2). Protein dibedakan satu sama lain berdasarkan tipe, jumlah dan susunan asam aminonya. Perbedaan ini menyebabkan perbedaan struktur molekuler, kandungan nutrisi dan sifat fisikokimia. Percobaan ini dilakukan untuk menetapkan kadar protein secara biuret. Pada penetapan kadar protein tersebut
didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna. Sampel yang digunakan untuk menetapkan kadar protein secara biuret adalah susu cair. Larutan susu tersebut dicampurkan reagen biuret dan didiamkan selama 30 menit. Tujuan larutan tersebut didiamkan agar proses pembentukan senyawa kompleks berwarna dapat berlangsung dengan benar-benar sempurna, dimana semakin lama larutan disimpan maka ion Cu2+ semakin banyak berkoordinasi dengan gugus amino sehingga warna larutan semakin jelas. Setelah larutan didiamkan, larutan yang berisi susu cair menunjukkan hasil positif yaitu berupa warna ungu, sedangkan larutan yang berisi ASI menunjukan hasil negatif yaitu warna orange pudar. Hal ini disebabkan karena ASI yang digunakan sudah terlalu lama disimpan dalam lemari pendingin sehingga susu tersebut sebagian mengendap atau mengalami koagulasi. Proses pembentukan senyawa kompleks tersebut, akan terjadi ikatan kompleks yang berwarna ungu apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam suasana alkali dalam hal ini digunakan NaOH sebagai basa kuat yang memiliki ion OH- yang tinggi dalam larutan sehingga mampu mengikat ion H+ pada larutan tersebut. Ion H+ yang lebih reaktif tersebut dapat diikat dan tak akan bereaksi dengan gugus amino, sehingga ion Cu2+ dapat bereaksi dengan gugus amino dari ikatan peptida dari protein dalam larutan susu (kasein). Senyawa kompleks ini akan terlihat setelah penambahan reagen biuret dengan terbentuknya warna ungu pada larutan. Dimana, senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam Cu2+ (kupri) pada suasana basa maka akan membentuk suatu kompleks warna ungu violet yang absorbansinya dapat dibaca pada panjang
gelombang 540 nm. Reaksi warna bisa terjadi karena ion Cu 2+ merupakan golongan transisi yang orbital d nya tidak penuh. Sehingga terjadi transisi elektron pada senyawa kompleks (ligan-ion logam) dari orbital d yang satu ke orbital d lainnya. Transisi ini terjadi dari ligan yang kaya elektron ke ion Cu 2+ yang miskin elektron. Percobaan tersebut digunakan uji biuret untuk menentukan ikatan peptida pada protein yang berupa cairan. Oleh karena itu, dengan uji biuret dapat diketahui ikatan peptida yang terdapat dalam susu. Dimana uji biuret merupakan jenis pengujian untuk identifikasi protein secara umum. Uji Biuret akan selalu memberikan hasil positif untuk semua jenis protein yang berupa cairan. Reagen biuret terdiri dari CuSO4 dalam aquades, KI dalam aquades, Na-sitrat, Na2CO3 dan NaOH. Dimana, CuSO4 sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Na-sitrat dan Na 2CO3 berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi sebagai penyedia suasana basa. Suasana basa akan membantu membentuk Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Hal ini membantu untuk membentuk kompleks dengan nitrogen dari karbon dari ikatan peptida dalam larutan basa. Perubahan pada warna sampel uji akan memberikan hasil yang positif atau negatif. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N pada gugus amino, dimana unsur N terdapat pada peptide menyumbangkan pasangan elektronnya ke atom pusat Cu menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa. Makin panjang suatu ikatan peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin pekat.
Selanjutnya pengukuran dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm. Percobaan ini digunakan metode spektroskopi karena untuk mengidentifikasi suatu sampel dengan menggunakan larutan berwarna yaitu warna dari protein yang berasal dari susu sapi dan ASI yang direaksikan dengan reagen biuret. Didalam spektrofotometer, larutan protein mengadsorbsi cahaya yang diberikan kepadanya. Hal ini merupakan wujud dari interaksi suatu atom dengan cahaya. Dimana energi elektromagnetiknya ditransfer ke atom atau molekul sehingga partikel dalam protein dipromosikan dari tingkat energi yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi, yaitu tingkat tereksitasi. Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer UV-Vis, didapatlah harga absorbans pada masing-masing sampel. Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan absorbans sampel yang diperoleh adalah larutan susu sapi sebesar 1,859 dan larutan ASI sebesar 1,805. Dari hasil interpolasi harga absorbans ke dalam kurva standar protein, diperoleh persamaan y = 0,474x + 0,155. Jika y ekuivalen dengan nilai absorbans sampel dan x ekuivalen dengan nilai kadar protein maka dengan perhitungan sederhana diperoleh nilai kadar protein pada susu sapi sebesar 42,5 mg/L dan kadar protein pada ASI sebesar 41,4 mg/L.
V. KESIMPULAN Berdasarkan tujuan dan hasil pengamatan dari percobaan ini, maka dapat disimpulkan bahwa penetapan kadar protein secara biuret didasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu violet yang terjadi ketika protein bereaksi denga tembaga dalam lingkungan alkali. Uji Biuret
digunakan untuk menentukan ikatan peptida pada protein yang berupa cairan. Dari hasil yang diperoleh, semakin lama larutan protein didiamkan maka semakin banyak ion Cu2+ berkoordinasi dengan –N pada gugus amino sehingga warna yang dihasilkan semakin jelas warna ungunya. Berdasarkan data yang diperoleh, maka tetapan kadar protein dalam susu sapi adalah sebesar 42,5 mg/L, sedangkan kadar protein dalam ASI adalah sebesar 41,4 mg/L. Kadar protein dalam susu sapi lebih banyak daripada kadar protein dalam ASI.
DAFTAR PUSTAKA Enechi, O.C., dan Nwabueze, C. E. 2013. A New Colorimetric Method for the Determination of Proteins. Advances in Biological Research. Vol. 7 (5): 159-162 Gandhimathi, R., S. Vijayaraj., M.P. Jyothirmaie. 2012. Analytical Process of Drugs By Ultraviolet (UV) Spectroscopy – A Review. International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis. Vol. 2 (2) Katili, A.S. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi Ilmu. Vol. 2 (5) Octaviani, T., Any, G., Hari, S. 2014. Penetapan Kadar β-Karoten pada Beberapa Jenis Cabe (Genus Capsicum) dengan Metode Spektrofotometri Tampak. Jurnal Pharmaciana. Vol. 4 (2) Setiono, Monica H. & Avriliana Dewi A. 2013. Penentuan Jenis Solven dan pH Optimum pada Analisis Senyawa Delphinidin dalam Kelopak Bunga Rosela dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri. Vol. 2. (2)
Toha, A.H.A. 2001. Biokimia : Metabolisme Biomolekulel. Bandung: ALFABETA
