4. CÁLCULO Y RESULTADOS
4.1 PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACION
.. 1.1=2.2 0, 0 0 ∗ ∗ 10 = 1,00 0, 2 0 ∗ ∗ 10 = 1,00 0, 4 0 ∗ ∗ 10 = 1,00 0, 6 0 ∗ ∗ 10 = 1,00 0, 8 0 ∗ ∗ 10 = 1,00 1,00 ∗ ∗ 10 = 1,00
Siguiendo la formula se calcularon calcularon las concentraciones de cada uno de de los tubos para lectura en el espectrofotómetro espectrofotómetro de la siguiente manera TUBO 1
=
TUBO2
=
TUBO 3
TUBO4
=
=
TUBO5
=
TUBO6
=
=0,00 =2,00 =4,00 =6,00 =8,00 =10,00
La absorbancia leída y corregida por mínimos cuadrados junto con el porcentaje de transmitancia para cada tubo son son los valores valores de la tabla 1. tubo 1 2 3 4 5 6 Tabla1.
absorbancia promedio
0,000 0,096 0,182 0,268 0,354 0,440 Lectura fotométrica de la SOLUCION SOLUCION BSA en la curva de calibración del espectrofotómetro.
La representación gráfica (grafico1.) de la función lineal que hay entre la concentración y la absorbancia es la lo que se reconoce como la ley de Lambert Beer.
Grafico 1. Curva de calibración patrón de BSA 10 mg/ml 0,500 0,450 0,400 A 0,350 I C N0,300 A B 0,250 R O0,200 S B A 0,150 0,100 0,050 0,000
y = 0,0431x + 0,0096 R² = 1
0
2
4
6
8
10
12
CONCENTRACION DE PATRON BSA MG/ML
Además para dar valor a la lectura y garantizar el cumplimiento de la ley de Lambert Beer se realizó la representación gráfica denominada curva de RIngboom (grafico2.) De la función de variable abscisa logaritmo de la concentración (log C) y de variable ordenada porcentaje de transmitancia (%T).
La curva de Ringboom se interpreta trazando una línea que toque a la mayor cantidad de puntos en la función graficada, en este caso la mayor cantidad de puntos que toca la línea dibujada es desde el punto que es igual al logaritmo de 0,600 hasta el punto con valor de logaritmo de 1 y este segmento de recta en la función se representa el valor mínimo y máximo de concentración en la muestra para que exista la ley de Lambert Beer (tabla2.)
optimas concentraciones Log C %T mg/ml 0,000 100,000 0,301 80,210 0,602 65,777 4 mínimo 0,778 53,942 6 0,903 44,236 8 1,000 36,276 10 máximo Tabla 2. Relación logarítmica para verificar la ley de Lambert Beer con la curva de Ringboom 4.3. DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS TOTALES DE LA MUESTRA Ahora bien las concentraciones que serán apropiadas para interpretarse en la lectura fotométrica con luz visible, y cumplen la ley de Lambert Beer deben encontrarse en el rango permitido por la curva de Ringboom son de mínimo 4 mg/ml de proteína hasta 10 mg/ml de proteína y/o del complejo cúprico formado por el nitrógeno presente en la muestra.
Con la digestión de la muestra de salchichón tipo cervecero de la marca Zenú se prepararon tres diluciones que formaron complejo cúprico coloreado por efecto del reactivo de Biuret. Donde se dispusieron tres tubos con las referencias: A1 para el tubo con 0,2 ml de muestra aforado a 1 ml con agua. A2 para el tubo con 0,4 ml de muestra aforado a 1 ml con agua. A3 para el tubo con 0,6 ml de muestra aforado a 1 ml con agua. Las muestras pasaron a lectura de absorbancia en el equipo de trabajo experimental, procedimiento que se efectuó tres veces y cuyos valores resultados se expresan en la tabla 3. A1 A2 A3 0,166 0,307 0,428 0,165 0,306 0,425 0,164 0,307 0,426 0,307 0,426 PROMEDIO 0,165 Tabla3. Absorbancia leída de la muestra diluida del salchichón tipo cervecero marca Zenú Continuando, el proceso de cálculos lleva a revisar la ecuación de la recta que ofrece la curva de calibración Grafico1. De la forma y=mx+b Ec. De la recta de calibración
=(0,0431∗( ))+0,0096
Desde aquí se efectúa un despeje sencillo, remplazando la palabra absorbancia por cada dato formulado por el equipo y de esta manera la concentración puede calcularse ofreciendo como resultado
0 096) = (−0, 0,0431 (0,165−0, = 0,04310096) (0,307−0, 0 096) = 0,0431 (0,426−0, 0 096) = 0,0431
CA1= 3,6 mg/ml
CA2= 6,9 mg/ml
CA3= 9,7 mg/ml
Tanto CA1, CA2 y CA3 fueron las concentraciones obtenidas después de leer las absorbancias de las diluciones del complejo coloreado de cobre, este complejo se logró después de aislar por centrifugado la fase acuosa, y dicha fase tuvo como volumen 16 ml proveniente de la disociación por reacción de solubilidad de las grasas presentes en la muestra cárnica con éter de petróleo, esta fase acuosa es la proteína del embutido cárnico en medio básico. La masa de salchichón cervecero tomada por balanza analítica fue de 1,1169 g. Además en consecuencia con lo reportado por la ley de Lambert Beer se debe discriminar las diluciones proteicas que tengan concentraciones menores a 4 mg/ml como es el caso de la dilución A1 que tiene 3,6 mg/ml y esta concentración no es proporcional a la absorbancia registrada por lo que su cálculo ya presenta error fotométrico. En esos términos, la concentración de proteínas en la fase acuosa [CPfa] en la muestra resulta de:
[CPfa] = voluCAn∗1ml men tomado
De esta forma queda así resuelto:
6, 9 / [CPfa] = voluCA2∗1ml = men tomado 0,4 =17,240 / 9, 7 / [CPfa] = voluCA3∗1ml = men tomado 0,6 =16,123 / ´
´´
En promedio la cantidad de proteína es 16,681 mg por cada ml de solución, y como hubo aparición de 16 ml de fase acuosa con esta concentración la cantidad promedio después de operar
=16,681 ∗ =0,667
Anteriormente se mencionó que la masa de la muestra homogenizada del producto cárnico en cuestión fue de 1,1169 g el porcentaje peso a peso se describe a continuación:
% ⁄ = 0,6671,1∗100% 169 =24 %
Ahora bien teniendo el porcentaje de proteína identificado por el Biuret de 24% p/p la desviación estándar del después de efectuar los cálculos:
̅ ∑ ( − ) √ = −1 ∑ (25%−24%) +(23%−24%) √ = =0,011 2−1 Es bastante pequeña y además el error la operación para calcular el porcentaje de coeficiente de varianza es:
%= ̅ ∗100% %= 0,24%011 ∗100%=4,733%
Si S ››tiende a 0 los valores resultan ser
un método muy satisfactorio y es confirmado por la aceptación que traduce él %CV < 5%, ahora lamentablemente el reporte de error relativo resulta muy desalentador puesto que después de realizar la fórmula:
− %= ∗100% %= 24%−12% 12% ∗100%=99 %
Resultan los datos tomados nada confiables e imprecisos.
Tabla 4. Determinación de Proteínas del Salchichón por el Método de Biuret peso de la muestra mg 1116,9
volumen fase acuosa ml 16 promedio
concentración de proteína en la muestra mg/ml
porcentaje de proteína en el salchichón
17,240 16,123
25% 23%
16,681
24%
desviación estándar 0,011
% coeficiente de varia. 4,733%
error relativo 99,139%
