MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE LEVEDURAS
Não existe um método absoluto para determinação da viabilidade celular de uma população de células de levedura. Para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou na observação microscópica têm sido usados. Entretanto, até o momento não existe um método que forneça resultados totalmente seguros na determinação da viabilidade celular. No controle da viabilidade celular nos processos de produção de levedura (fermento prensado) e fermentação alcoólica, a coloração das células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. Devido às facilidades e a rapidez da análise, nas indústrias de produção de álcool o emprego de eritrosina é o mais indicado. Na determinação da viabilidade através do uso de eritrosina a porcentagem ou o número de células viáveis por mililitro é determinado transferindo-se uma amostra já colorida para a câmara de Neubauer. Nesta são contadas as células incolores e as coloridas de rosa, utilizando-se a objetiva de imersão (100x). Devem ser contadas entre 300 a 500 células por câmara, o que é regulado pela diluição adequada da amostra. Para maior precisão da análise, a diluição da amostra deve ser tal que não se tenha mais que 1250 células por câmara, e, não menos que 100 retículos da câmara (os retículos centrais de cada quadrículo) sejam contados.
1 - Técnica de Coloração com Eritrosina
1.1 - Preparo das Soluções
Solução estoque de Eritrosina - Pesar 0,1 g de eritrosina. - Dissolver em 10,0 mL de água destilada esterilizada. Conservar a solução estoque em frasco âmbar fora do alcance da luz e em refrigerador. Validade: 8 meses desde que armazenada protegida da luz e sob refrigeração.
Solução Tampão de Fosfato - Pesar 17,90 g de Na2HPO4;
- Dissolver em 250,0 mL de água destilada esterilizada (solução A);. - Pesar 6,89 g de NaH2PO4; - Dissolver em 250,0 ml de água destilada esterilizada (solução B); - Misturar as soluções A e B; - Transferir a solução para um frasco plástico e conservar sob refrigeração; Validade: 8 meses desde que armazenada sob refrigeração.
Observação: Para o uso da solução tampão deve-se retirar o frasco do refrigerador e aguardar que o mesmo atinja a temperatura ambiente.
Solução de trabalho - Misturar 0,1 mL da solução estoque de eritrosina para cada 5,0 mL do tampão fosfato; - Preparar um volume da solução de trabalho que seja suficiente para uso durante uma semana. Conservá-la fora do alcance da luz; - Recomenda-se que uma porção dessa solução, suficiente para um dia de trabalho, seja transferida para um tubo de ensaio; - Caso, ao final da jornada, não se utilizar todo o volume preparado, o restante deverá ser descartado para evitar contaminações.
Observação: Soluções descartadas.
que
apresentem
contaminações
devem
ser
imediatamente
1.2 - Procedimento analítico
Após a coleta da amostra de vinho bruto e/ou creme de levedura, proceder da seguinte maneira: - Homogeneizar a amostra - Transferir uma alíquota da amostra (3 - 5 mL) para um tubo de ensaio; - Adicionar papaína a amostra;
- Homogeneizar em agitador para tubos; - Deixar em repouso durante 5 min; - Homogeneizar em agitador para tubos; - Diluir a amostra com água destilada (a diluição é realizada para que o número de células seja adequado para a faixa de maior precisão da metodologia); - Transferir 1 mL da amostra diluída para outro tubo de ensaio; - Transferir 1 ml da solução de trabalho de eritrosina para o tubo de ensaio que contém 1 mL da amostra diluída; - Homogeneizar em agitador para tubos; - Preparar a câmara de Neubauer, cobrindo a superfície espelhada com uma lâmínula 24x24 mm - Transferir um volume suficiente da solução (amostra + corante) para cobrir a área da câmara de Neubauer. - Contar, utilizando a objetiva de imersão (100X), as células presentes nos quatro retículos centrais dos 25 quadrículos;
Observação: A contagem utilizando a objetiva de imersão (100X) permite uma observação mais precisa das células da levedura quanto a sua estrutura celular. Especificações da câmara de NEUBAUER - Profundidade: 0,1 mm - Número de quadrículos: 25 - Número de retículos em cada quadrículo: 16 - Número de retículos em cada câmara: 400 - Área do retículo: 0,0025 mm2 - Volume de líquido em cada retículo: 0,00025 mm3 - Volume total da câmara: 0,1 mm3. Preparo das soluções
1.3 - Cálculos
1) Viabilidade celular
A viabilidade celular indica a porcentagem de células em atividade na população de leveduras da amostra considerada. Total de células viáveis % Cel. viáveis = __________________________ x 100 Total cel. viáveis + não viáveis
2) Contagem de células em brotamento
Indica a percentagem de leveduras em atividade que estão se multiplicando
Total de cel. viáveis em brotamento % Brotamento = ________________________________- x 100 Total de células viáveis
3) População de Leveduras
Total de cel. viáveis x 4000 População leveduras/mL = __________________________ x 1000 x D Total de retículos contados
Onde: D = diluição final
2 - Plaqueamento
Nessa técnica, uma quantidade conhecida de inóculo é colocada numa placa de Petri, seguindo-se a adição de Ágar Padrão para Contagem. Admite-se que cada microrganismo viável cresce e multiplica-se, dando origem a uma massa visível - uma colônia - ou seja, cada organismo dá origem a uma colônia. Dessa forma, através do número de colônias formadas pode-se saber o número de microrganismos viáveis no inóculo.
A amostra original é diluída várias vezes para que o número de colônias presentes na placa fique compreendido entre 30 e 300. Dentro desse limites a contagem pode ser precisa e a possibilidade de interferência do crescimento de um microrganismo com o de outro é mínima. As colônias são contadas contra um fundo escuro ou no contador de colônias. A técnica de contagem em placas é baseada no princípio de que cada organismo viável formará uma colônia e, além disso, admite-se que a suspensão microbiana seja homogênea e que não existam agregados de células. Obviamente, os únicos microrganismos que poderão ser contados serão aqueles que puderem crescer no meio utilizado e sob as condições de incubação adotadas (tempo, temperatura, etc.). Esse fato pode ser muito importante no caso da contagem de uma mistura de microrganismos. A técnica de contagem em placas apresenta como vantagens o fato de ser de fácil realização; além disso, mede populações de qualquer grandeza em virtude das várias diluições realizadas e apresenta sensibilidade para a detecção de populações muito pequenas.
2.1 - Plaqueamento em Profundidade
2.1.1 - Procedimento
- Preparar as diluições necessárias, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5. Transferir 10 mL de cada diluição para tubos de ensaio contendo 90 mL de solução salina peptonada e homogeneizar.
Figura 1 – Esquema das diluições sucessivas
- Distribuir 1,0 mL de cada diluição no centro de placas de Petri estéreis adicionando-se cerca de 15 mL de Ágar Padrão para contagem fundido. Homogeneizar e resfriar a 45 °C. Após solidificação do meio inverter as placas; - Incubar as placas invertidas a 36±1 °C por 48 horas. Observação: Recomenda-se que a contagem padrão em placas seja realizada com, no mínimo, duas placas para cada diluição.
2.1.2 - Resultados
- Serão consideradas significativas apresentarem entre 30 e 300 colônias;
as
contagens
das
diluições
que
- Para calcular o número de unidade formadora de colônia (UFC) por grama do produto, multiplicar o número significativo encontrado pelo fator de diluição correspondente.
- Para contagens em duplicata, na obtenção dos resultados, utilizar a média aritmética das contagens nas placas que apresentarem entre 30 e 300 colônias. - Leituras abaixo de 30 colônias na menor diluição (10 -1), expressar como “Abaixo de 300 UFC/grama”. - Ausência de crescimento em 10-1, expressar como “Abaixo de 10 UFC/grama”. - Leituras acima de 300 colônias na maior diluição expressar como “Maior que 300 x 104 UFC/grama”.
2.2 – Plaqueamento em Superfície Adicionar o meio de cultura a uma placa de Petri ( o suficiente para cobrir todo o fundo da placa) e esperar solidificar. Com uma pipeta previamente esterilizada, inocular sobre o meio de cultura 0,1mL do inóculo e espalhar com o auxilio de uma alça de Drigalski. Incubar as placas a 36±1 °C por 48 horas. Realizar a leitura como descrito no método de plaqueamento em profundidade. O método limita o volume inoculado a 0,1mL da amostra ou suas diluições, mas permite uma melhor visualização das características das colônias na superfície, além de facilitar sua transferência para outros meios de cultura.
Atenção:
Diluições Sucessivas (Diluições em série) Objetivos Obter soluções de amostra com concentrações conhecidas Obter amostra com número de micro-organismos que possa ser detectado pelo método de análise Material Erlenmeyer contendo
Pipetas bacteriológicas de 10 mL com graduação decimal; Tubos de ensaio contendo 90 mL de solução salina peptonada. Procedimento Como apresentado na figura 1
