Monografia-microbiologia Aplicada a La Industria Farmaceutica

TEMA MICROBIOLOGIA APLICADA A LA INDUSTRIA FARMACEUTICA

CURSO

: MICROBIOLOGIA

DOCENTE

: Blgo.Carlos Esqueche

INTEGRANTES

: Alicia Castillo Leon Pascual Tuesta Cotrina Antonio Choroco Condor

AULA

: 303A

CICLO

: VII

TURNO

: NOCHE

Microbiología Microbiología I

I.

Microbiología Aplicada a la Industria Farmacéutica

INTRODUCCION

Es muy diverso el apoyo que realiza la Microbiología a la industria farmacéutica y de Cosméticos. Participa en los diferentes procesos de producción y análisis microbiológicos para garantizar la calidad de productos farmacéuticos y cosméticos, verificar la ausencia de microorganismos contaminantes. Los medicamentos y cosméticos no pueden contener microorganismos patógenos y la cantidad de microorganismos no patógenos no debe sobrepasar determinados límites. Las Bacterias aerobias Mesófilas son todas aquellas capaces de crecer en un medio de cultivo sin mayores exigencias nutricionales. Se investigan por el método de recuento en placa por siembra en profundidad. Prueba de endotoxinas. La prueba de pirógenos, endotoxina, y la prueba de detección de endotoxina es una prueba para detectar la presencia de endotoxina de origen bacteriano en productos farmacéuticos Participa además en esta área, la microbiología en pruebas para el control de desinfección de superficies y equipos, validación de Procesos de Saneamiento, eficacia de preservantes y conservantes en productos farmacéuticos y cosméticos, valoración de áreas y ambientes, control de Filtros HEPA, flujo laminar y cabinas de bioseguridad.

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Microbiología I

II.


Pag.

INDICE

Introducción……………………………………………………... ............................. 2 Desarrollo del tema………………………………………………………………….. 4 1. Crecimiento microbiano………………………………… ............................ 4 1.1.

Visualización del cremiento……………………………………………. 5

1.2.

Medición del crecimiento……………………………………………….. 5

1.3.

Recuento de microorganismos viables ……………………………….. 5

2. Endotoxinas bacterianas…………………………………………………… . 8 2.1.

Sustancias pirogénicas………………………………………………… . 8

2.2.

Endotoxinas Bacterianas: estructura, propiedades biológicas y fisicoquímicas…………………………………………………………… 8

2.3.

Despirogenización ……………………………………………………… 9

3. Biopelículas…………………………………………………………………. 10 3.1.

Formación y desarrollo de biopelículas……………………………… 10

4. Filtros hepa…………………………………………………………………. 12 4.1.

Elementos de los filtros hepa…………………………………………. 13

4.2.

Equipos de flujo laminar ………………………………………………. 15

5. Indicadores biológicos…………………………………………………….. 17 5.1.

Tipos de indicadores………………………………………………… .. 18

5.2.

Esterilización de líquidos……………………………………………… 21

Referencias bibliogr áficas……………………………………………………….… 23

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III.


DESARROLLO DEL TEMA

1. Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como el aumento de los constituyentes celulares. En los microorganismos que se multiplican por fisión binaria o gemación, el crecimiento produce un aumento del número de células. En los microorganismos cenocíticos, el crecimiento produce aumento del tamaño pero no del número de células. En bacterias, la síntesis regulada de todos los constituyentes de una célula bacteriana produce primero un aumento de su masa y luego, cuando ésta ha sido duplicada, la división de la bacteria por el mecanismo de fisión binaria. De esta manera se originan dos bacterias hijas de las que puede decirse que, son iguales entre sí e iguales a la bacteria que les dio origen. A continuación cada una de las bacterias hijas repetirá el ciclo de la bacteria parental y se originarán 4 bacterias, aumentando el número de ellas, es decir de la población bacteriana, en progresión geométrica.

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1.1. Visualización del cremiento

En medios líquidos el aumento del número de bacterias se visualiza como turbidez y/o formación de sedimento o película en los cultivos. En cambio, en medios agarizados

el

aumento

del

número

de

bacterias

produce

colonias

macroscópicamente visibles, algunas de cuyas características (tamaño, forma, color, etc.) pueden contribuir a la identificación del microorganismo. 1.2. Medición del crecimiento

Para medir el crecimiento se pueden emplear técnicas que estimen el número de bacterias, ya sea totales o viables, o la masa celular. De acuerdo a la técnica empleada para el recuento, su resultado expresará el número de microorganismos totales (viables más no viables) o solamente viables presentes en una muestra, siendo éstos últimos los que poseen la capacidad de crecer y multiplicarse. 1.3. Recuento de microorganismos viables A. Recuento en placa

El recuento de microorganismos viables en placa se basa en la formación de una colonia a partir de cada célula viable, utilizando como soporte, medios agarizados en placas de Petri. No puede asegurarse indubitablemente que toda colonia derive de un solo microorganismo, por eso la forma correcta de expresar los resultados es como unidades formadoras de colonias (UFC). El recuento se puede realizar por “plaqueo” en medios agarizados o por retención en una

membrana filtrante. Las técnicas de recuento viables en placas son sensibles, relativamente sencillas y se usan ampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras de alimentos, medicamentos, agua, etc. La forma correcta de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias es la siguiente: realizar diluciones 1/10 de una suspensión bacteriana o de una muestra en ensayo y sembrar volúmenes medidos de varias de ellas, a modo de obtener colonias separadas. Esto se logra cuando el número de colonias por placa Petri es entre 30 y 300, dependiendo del tamaño de las colonias originadas. En general, por encima de ese límite hay superposición de colonias y por debajo de él la significación estadística es muy pobre. Las siembras se pueden hacer:

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Por diseminación: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado,

contenido en la placa, de volúmenes de 0,1 – 0,2 ml de las diluciones correspondientes. En profundidad: incorporando el inóculo en un volumen de medio fundido,

mantenido a temperaturas compatibles con la viabilidad microbiana (aproximadamente 45°C), que luego se vuelca en una placa Petri y se deja gelificar. Los volúmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen del medio. Luego de la incubación en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la concentración de UFCs presentes en una suspensión se calcula multiplicando el número de colonias por placa, promedio de varias placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y dividiendo por el volumen sembrado. Cuando el número de microorganismos viables presentes en una muestra es bajo, se puede recurrir a la filtración de la misma a través de filtros de membrana que retienen bacterias. Luego de filtrar la suspensión que contiene las bacterias a cuantificar, la membrana se coloca sobre la superficie de un medio agarizado o sobre una fina almohadilla de papel absorbente embebido con medio líquido, se incuba en condiciones adecuadas y se cuentan las colonias, que representan el número de UFC presentes en el volumen de muestra filtrado.

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B. Recuento directo

El recuento en cámara por microscopía óptica es un método útil para determinar el número de bacterias totales en una suspensión, cuando su concentración no es demasiado baja. Brinda también información sobre el tamaño y la morfología de los microorganismos.Las suspensiones se colocan en cámaras de recuento de volumen conocido. En el caso del recuento de bacterias estas cámaras poseen un espesor sensiblemente menor que los hemocitómetros, debido al menor tamaño de las bacterias. Las cámaras de recuento de Petroff-Hausser tienen un espesor de 0,02 mm, que las hace particularmente aptas para el recuento de bacterias. La superficie de la cámara es de 1 mm2 y está dividida en 25 cuadrados. Luego, el número de bacterias por mm3 se calcula multiplicando el número de bacterias en un cuadrado por el número de cuadrados (25) y por la inversa del espesor (1 / 0.02= 50). C. Determinación de microorganismos totales

Se emplean métodos que determinan directamente el número de bacterias suspendidas en un medio líquido o el peso correspondiente a la fracción celular. También se pueden utilizar métodos indirectos, entre ellos el más utilizado es la determinación de la absorbancia de las suspensiones celulares, que, dentro de cierta imagen y en condiciones estandarizadas, es proporcional a la masa celular. D. Medición de la masa celular

El aumento del número de microorganismos va acompañado de un aumento continuo de la masa celular en el cultivo que, por supuesto, refleja el total de las células (viables más no viables). La masa celular en un cultivo microbiano puede medirse directamente determinando

el peso

de

la

fracción

celular o

indirectamente midiendo la absorbancia de las suspensiones microbianas. E. Determinación de la absorbancia

Una técnica más rápida, más sensible y de uso corriente se basa en medir espectrofotométricamente la dispersión de la luz producida por las bacterias presentes en una suspensión. A medida que aumenta la concentración de bacterias el cultivo se vuelve más turbio (aumenta la absorbancia) y la luz 7

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transmitida es menor. Debido a que las células de una especie bacteriana tienen tamaños relativamente constantes, la dispersión de la luz puede considerarse proporcional a la concentración de bacterias en la suspensión. La relación lineal entre absorbancia y concentración celular sólo se cumple en un rango determinado de concentraciones y, además, la absorbancia de una suspensión bacteriana no depende sólo de la masa celular sino también de otros factores, como por ejemplo la forma de las bacterias. Por ello es aconsejable realizar una curva de calibración para cada sistema, a modo de establecer la relación entre la densidad óptica (DO) y el parámetro estimado, efectuando distintas diluciones de una suspensión concentrada y midiendo sus respectivas absorbancias. 2. Endotoxinas bacterianas 2.1. Sustancias pirogénicas

Se define como pirógeno a toda sustancia que, cuando es inyectada en sangre o LCR en humanos o en animales de experimentación, produce fiebre, se reconocen como los pirógenos más frecuentes y se originan en bacterias Gram negativas. Éstas, además de la pared celular (mureína o peptidoglicano) que caracteriza a las bacterias en general y que contribuye a su rigidez mecánica poseen una capa adicional externa compuesta por proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos (LPS) de alto peso molecular (PM). Sólo algunas pocas especies de bacterias Gram negativas, como las Sphingomonas, carecen de LPS. Las endotoxinas Bacterianas se liberan continuamente en el medio en que se encuentran las bacterias, en pequeñas cantidades durante su división y en mayoría, durante su lisis. Por esto, un producto estéril no necesariamente será apirogénico. La importancia de las EB radica en su naturaleza, su mayor toxicidad en relació n a otros piretógenos, estabilidad frente a condiciones extremas de tratamiento, su ocurrencia en soluciones de uso parenteral y su tamaño demasiado pequeño para ser retenidas por filtros esterilizantes convencionales. 2.2 .Endotoxinas Bacterianas: estructura, propiedades biológicas y fisicoquímicas.

La estructura básica activa de las EB es la de un LPS con 3 fracciones unidas covalentemente: lípido A- que, además de ser responsable de la mayoría de los efectos biológicos (ej. toxicidad) les confiere estabilidad y resistencia, un polisacárido central y un polisacárido O-específico, que se extiende en el medio en que se 8

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encuentra la bacteria, de estructura altamente variable y que le confiere antigenicidad. La región central y el lípido A se encuentran parcialmente fosforilados, lo que le confiere a la endotoxina una carga neta negativa La estructura anfifílica de las EB (polisacárido hidrofílico y lípido A hidrofóbico), asociada a sus propiedades biológicas tóxicas, también dificulta su remoción durante la elaboración farmacéutica o puede afectar la capacidad de detección durante los controles por adsorberse con facilidad a distintas superficies como el vidrio, plásticos u otras.

2.3 . Despirogenización

La Despirogenización puede realizarse por detoxificación o destrucción del LPS (esterilización por calor seco, tratamiento con ácidos, bases, agentes oxidantes o alquilantes, etc.) o remoción de las EB. Dentro de los métodos esterilizantes convencionales el Calor seco es el método por excelencia para la destrucción del LPS y clásico cuando se trata de sustancias resistentes al calor (ej.: material de vidrio). Los ciclos temperatura-tiempo deben ser validados siendo habituales 180ºC /3 horas o, como refiere USP 250ºC/ 30 minutos. La esterilización por Calor húmedo (121ºC/15- 20 min) es inefectiva para destrucción de EB. Se ha intentado su empleo asociado a soluciones de peróxido de hidrógeno para 9

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despirogenizar preparaciones o recolección de soluciones. En este caso, su eficacia será dependiente de factores tales como concentración, tiempo, temperatura y pH. Se trata de un enfoque que, como ocurre con otros métodos químicos, ofrece las dificultades propias de la validación del sistema de limpieza de residuos. La destilación es el método por excelencia para obtención de agua calidad inyectable, dejando detrás grandes aglomerados de piretógenos durante la etapa de evaporación. Otros métodos de remoción basados en tamaño molecular, si adecuadamente mantenidos, son la Osmosis inversa (OI) y la ultrafiltración (UF). Mientras la OI se acepta como método alternativo para la obtención de Agua para inyectables no puede emplearse para otros productos. La UF es considerada un método de alta eficiencia para purificar productos de uso parenteral distintos de agua, no sólo como parte de un proceso productivo si no también con fines analíticos. Los distintos métodos de filtración esterilizante se realiza empleando membranas de 0,22um utilizados frecuentemente en la fabricación de inyectables, resultan altamente efectivos para prevenir la contaminación con EB. Otros enfoques también han considerado centrifugación en gradientes de sacarosa y separación de fases con Triton X-114 o cromatografía de intercambio aniónico. La Radiación, se utiliza para esterilización de jeringas y dispositivos médicos, aquellos con contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular y algunas materias primas biológicas como enzimas. En cuanto a los métodos químicos, el tratamiento con bases como hidróxido de sodio que produce la destrucción por saponificación de los ácidos grasos en el lípido A mientras que, el tratamiento con ácidos como clorhídrico o acético, se asocia con la ruptura parcial de la unión de la cadena del polisacárido al ácido graso y eliminación del primero por ser hidrosoluble, con la desventaja de que el Lípido A puede permanecer 3. Biopelículas 3.1. Formación y desarrollo de biopelículas.

Una gran variedad de microorganismos están presentes en todos los ambientes acuáticos (o muy hidratados), tanto naturales como industriales. Estos microorganismos 10

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constituyen y viven en comunidades multicelulares y presentan gran tendencia a fijarse y crecer sobre superficies bióticas o abióticas inmersas en el agua y formar las denominadas biopelículas Si bien existen varios modelos y descripciones, el desarrollo de una biopelícula puede generalizarse en las siguientes etapas: a) Acondicionamiento: se produce la instantánea adsorción de productos orgánicos

con los cuales los microorganismos no están relacionados (película condicionante). b) Adhesión de especies bacterianas pioneras: algunas bacterias se adhieren a la

superficie sumergida en cuestión de horas. c) Colonización de otros microorganismos: otras bacterias y hongos comienzan

a asociarse a la superficie luego de la colonización de las pioneras en cuestión de días. d) Acumulación: se produce el agregado de partículas, células muertas y compuestos

de metales. Estos pueden encontrarse como productos de corrosión o como iones en solución.

Figura 1. Etapas de desarrollo de una biopelícula. Extraído de Jenkinson and Lappin-Scott, 2001.

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En el inicio de la formación de la biopelícula las células se adhieren a un sustrato, La falta de comprensión o al interpretar la información de la superficie de la célula, tal como su hidrofobicidad o carga, ha resultado al menos en lo que a las células bacterianas concierne, en una falta de consenso sobre la importancia de factores fisicoquímicos en la adherencia no específica. Una perspectiva sostiene que la distinción entre la adherencia específica (mediada por el receptor) y no específica es artificial. Sin embargo, está claro que en la adherencia no específica una combinación de todos los rasgos conduce a un conjunto célula superficie que establece la afinidad por el sustrato. Si la composición de la superficie de la célula o del sustrato cambia, la afinidad puede cambiar. Organismos modelo, tales como cepas con definidas mutaciones en la pared celular o composición conocida de exopolímero, y sustratos modelo cuyas características físicoquímicas superficiales fueran conocidas podrían usarse para predecir su tendencia a adherirse no específicamente. Las características estructurales, químicas y fisiológicas de una biopelícula dependen tanto de los microorganismos que la constituyen como de las condiciones ambientales locales. Las bacterias en biopelículas no sólo difieren de las planctónicas de su misma especie,

sino

además

en

biopelículas

monoespecíficas

demuestran

vasta

heterogeneidad en términos de metabolismo, expresión de genes y fisiología debido a las diferentes condiciones o microubicaciones. Las biopelículas son dinámicas con respecto a su estructura y composición, pero pocos estudios se han ocupado de las consecuencias del crecimiento de las biopelículas o de las últimas etapas de su desarrollo. Por lo tanto, se sugiere que las biopelículas deberían ser estudiadas desde un punto de vista diferencial espacio/temporal similar al del desarrollo de la biología. Como ya se ha mencionado, un componente muy importante que mantiene la integridad estructural de la biopelícula lo constituye el MPE, también llamado matriz extracelular, esta matriz tiene un aspecto de gel y está constituida por proteínas, iones Ca+2, cadenas de polisacáridos y agua que permiten la cohesión entre las células y las protegen de las condiciones hostiles del medio. 4. Filtros HEPA

HEPA (High Efficiency Particulate Air) es un filtro descartable de medio filtrante seco y extendido dentro de un marco rígido, que tiene una eficiencia mínima de retención del 99,97 %. 12

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4.1. Elementos de los filtros hepa Medio filtrante: Es papel corrugado con pliegues profundos y cercanos entre sí, de modo

tal que permita un caudal de aire suficientemente grande. Puede llegar a usarse una superficie de papel hasta 50 veces mayor que la sección plana de entrada del filtro. Separadores: Son elementos que mantienen los pliegues del papel separados, dando

rigidez mecánica a la superficie filtrante. Marco: Es la caja rígida dentro de la cual se halla el medio fi ltrante y los separadores. Adhesivo: Es el producto que une el papel de filtro al marco Burletes: Revisten la superficie del marco donde éste se une al soporte portante

del filtro, dando estanqueidad al sistema. A. Papel filtro o medio filtrante.

En las primeras tentativas de fabricación de materiales de alta eficiencia se utilizaron fibras relativamente groseras como soporte de fibras de amianto. Posteriormente, fueron hechos papeles de celulosa y amianto, vidrio, amianto y vidrio, fibras plásticas y cerámicas. El papel de celulosa y amianto fue el más barato de los medios filtrante. En él las fibras celulósicas relativamente gruesas servían de soporte a las de amianto que son de diámetros de pocos micrones. Están en desuso por ser el amianto potencialmente cancerígeno. El papel de vidrio es actualmente el más común de los medios filtrantes. Esto se debe a que la mayoría de sus microfibras es inferior al micrón. Con fibras plásticas se han fabricado medios de polietileno, polipropileno y nylon con diámetros de fibras entre 0,5 y 1,5 micrones. Tienen buena compatibilidad química, pero poca resistencia a las altas temperaturas. Las partículas de materiales costosos se pueden recuperar disolviendo el medio filtrante para su separación. Las microfibras cerámicas se utilizan cuando es necesario trabajar con altas temperaturas (hasta 1000 °C).

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B. Separadores.

Para evitar que los pliegues adyacentes se superpongan entre si se usan separadores que pueden ser de los siguientes materiales: Papel Kraft o cartón: son los más baratos, sin embargo tienen poca resistencia a la

humedad y al calor. Aluminio: Resisten hasta 300° C y son aplicados en filtros que deben ser resistentes

a la humedad. Acero inoxidable: Son usados solo en casos especiales Cordones adheridos al medio. Fabricantes europeos han desarrollado filtros donde

el medio filtrante se mantiene separado por medio de cordones adheridos al papel para mantener su conformación lisa, con la ventaja de poder disponer de más medio filtrante por unidad de volumen. Pueden mantenerse así iguales caudales con menores caídas de presión. En la actualidad los separadores más usados son los de un adhesivo que se inyecta en la superficie del papel poco antes de ser corrugado y al secarse en el momento del plegado, aumenta la cantidad de pliegues obteniéndose un filtro de mayor superficie filtrante. C. Marco

Inicialmente los filtros HEPA más comunes eran fabricados con marcos de madera aglomerada o terciada. Su mayor inconveniente era su poca resistencia a la humedad. La madera puede hincharse, desplazándose el burlete, perdiéndose la estanquidad y permitiendo fugas o pérdidas entre el burlete y el marco de sustentación. Se usan cuando es necesario incinerar el filtro una vez saturado. Los marcos metálicos usados en la mayoría de las aplicaciones son de chapa galvanizada o cadmiada. Los marcos plásticos se usan en general en filtros de muy pequeño tamaño. Actualmente, los filtros para equipos de flujo laminar y los módulos tienen como marco perfiles de aluminio.

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D. Adhesivos

Una vez obtenido en la fabricación el medio filtrante corrugado se adhieren los extremos al marco por medio de adhesivos de los siguientes tipos: Adhesivos de tipo goma y siliconados: son los más comunes donde no se requiere

alta resistencia a la temperatura. Adhesivos refractarios: para altas temperaturas. E. Burletes

Los materiales usados para ésta aplicación cumplen la función de evitar las fugas entre los filtros y la estructura portante. Según sus aplicaciones son de los siguientes tipos: Goma: solamente usados para bajas temperaturas. Neopreno: los más usados. Fibras de vidrio y minerales: se aplican donde se deben soportar altas

temperaturas. Es fundamental el buen cierre con los burletes, de lo contrario habrá pérdidas.

4.2. Equipos de flujo laminar. a) Mesadas de flujo laminar horizontal

Cuando se controlan productos alimenticios, veterinarios y farmacéuticos, es común usar las mesas de flujo laminar horizontal llamadas vulgarmente “clean -bench”.

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Constan de un gabinete metálico con un banco de filtros HEPA dispuestos en un plano vertical, prefiltros, un ventilador centrífugo, una mesada plástica o de acero inoxidable y vidrios laterales con un techo de luces fluorescentes. El ventilador impulsa a los filtros HEPA aire ambiente que es aspirado a través de los prefiltros. El aire se desplaza entonces en líneas unidireccionales paralelas, perpendiculares a los filtros HEPA, barriendo cualquier contaminante generado sobre una mesada como si un pistón de aire estéril se moviera dentro del cilindro formado por un techo iluminado, la mesada y los vidrios o acrílicos laterales. Estos equipos sirven para evitar que al controlar la calidad microbiológica, el producto se contamine con bacterias, hongos o levaduras dispersas en el ambiente. Estos equipos se usan en industrias tan variadas como aguas minerales, gaseosas, vinos, cervezas, alimentos, productos farmacéuticos, etc Las áreas limpias y los gabinetes de flujo laminar cumplen 2 funciones, la primera es proveer aire libre del contaminante exterior y la segunda es barrer con el contaminante generado por los individuos en el interior del gabinete. b) Campanas o cabinas de flujo laminar.

Las cabinas de flujo laminar se ubican sobre las zonas de envasado de productos que deben mantenerse libres de contaminación. En ellas el aire ambiente es aspirado por ventiladores centrífugos a través de los prefiltros, y se inyecta a través de un plano horizontal de filtros HEPA. El aire se desplaza entonces en una corriente vertical de líneas paralelas unidireccionales a una velocidad de 0,5 m/ seg, siendo las cortinas laterales las guías de flujo de aire. Toda llenadora de ampollas inyectables para uso humano debe ser provista de un flujo de aire clase 100 (ISO 5), es decir, de una campana de flujo laminar. El aire ultrafiltrado se desplaza como un pistón dentro de un cilindro, barriendo por su régimen laminar cualquier partícula generada en el interior del equipo. Todas las superficies son lisas, siendo la sección de salida de aire idéntica a la sección de filtros HEPA de entrada. La función del prefiltro es aumentar la vida útil del filtro final. Se lo ubica en la sección de entrada de aire al ventilador y es fundamental cambiarlo cuando se acerca su punto de saturación. 16

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5. Indicadores biológicos

Los métodos de control de esterilización universalmente aceptados pueden dividirse en dos, los indicadores químicos (IQ) y los indicadores biológicos (IB). Cada uno de ellos cumple un rol específico y tiene sus propias ventajas y limitaciones. El conocimiento minucioso de las características propias de cada sistema, resulta fundamental a fin de efectuar un uso adecuado de los mismos. A. indicadores químicos

Estos indicadores están diseñados para responder a las variables físicas y químicas que deben alcanzarse dentro del equipo durante el proceso de esterilización. Algunos indicadores únicamente proveen información logística, Otros, brindan información sobre la calidad del proceso de esterilización al que fue sometido el instrumento. Ciertos IQs son capaces de monitorear una única variable, mientras que otros responden a dos, tres o más variables proporcionando un método de control más eficaz que aquellos que responden a una única variable. Cada clase de IQ varía en su comportamiento y sus condiciones de uso, por lo cual resulta de suma importancia que el personal encargado de utilizarlos conozca qué tipo de información brinda el indicador en cuestión, su correcto modo de utilización y las limitaciones que el mismo posee. La principal ventaja de los indicadores químicos es que los resultados se obtienen al finalizar el ciclo de esterilización, permitiendo detectar inmediatamente fallas en el proceso y tomar las precauciones apropiadas.

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B. Indicadores biológicos.

Son considerados el control de excelencia para monitoreo de procesos de esterilización. Los IBs, consisten en preparados de esporas de microorganismos no patógenos, las cuales se exponen al agente esterilizante y a continuación se evalúa la supervivencia de los mismos. La eliminación de dichos microorganismos evidencia la eficacia del procedimiento de esterilización. Los microorganismos utilizados en la elaboración de IBs son esporas bacterianas cuya resistencia a los agentes esterilizantes es elevada en comparación a la resistencia de los microorganismos potencialmente presentes en los objetos a esterilizar. Por este motivo, si un proceso de esterilización es suficientemente efectivo como para matar una población de esporas resistentes, también es capaz de eliminar microorganismos menos resistentes de los objetos de interés. Como un control adicional, los IBs se fabrican con una cantidad de esporas notablemente superior a la cantidad de organismos que normalmente pueden hallarse en los objetos a esterilizar.La norma EN ISO 11138 establece requerimientos de fabricación, comportamiento y comercialización de los indicadores biológicos a fin de garantizar el adecuado desempeño de los mismos. Para los métodos de esterilización más comunes, se han seleccionado como organismos de referencia esporas bacterianas provenientes de Geobacillus stearothermophilus para procesos de esterilización por vapor, formaldehído y peróxido de hidrógeno y Bacillus atrophaeus para calor seco y óxido de etileno. La normativa estipula que el fabricante debe ensayar la resistencia de cada lote de indicadores biológicos y declarar los parámetros 5.1. Tipos de indicadores A. Indicadores de tiras de esporas

Contienen una cantidad conocida de esporas inoculadas en un material portador, generalmente de naturaleza celulósica y que luego de ser sometidas al proceso de esterilización se transfieren a un medio de cultivo adecuado mediante la técnica aséptica. El medio de cultivo inoculado, se incuba a la temperatura de crecimiento del microorganismo presente en la tira de esporas durante un período de tiempo determinado. El medio de cultivo contiene un indicador de pH, el cual cambia de color ante la presencia de bacterias metabólicamente activas. Un cambio de color del medio señala una falla en el proceso de esterilización; sin embargo, si el proceso de esterilización fue efectivo, el medio indicador permanecerá del color original. Este tipo de 18

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indicador, tiene algunos inconvenientes asociados; por un lado, los resultados del ensayo están disponibles 24 o 48 horas según el caso, además requiere que el personal encargado de esta tarea posea conocimientos básicos de técnicas microbiológicas. Por otro lado existe una elevada probabilidad de obtener falsos positivos por contaminación cruzada del medio de cultivo durante el traspaso de la tira de esporas. La contaminación cruzada consiste en la transferencia accidental de microorganismos, distintos a las esporas presentes en la tira, al medio de cultivo.

B. indicadores biológicos autocontenidos.

Contienen un papel de filtro embebido con esporas bacterianas y un medio de cultivo específicamente diseñado en una ampolla de vidrio. Estos componentes están alojados dentro de un tubo plástico contenedor, permeable al agente esterilizante. Luego de la exposición al agente, se rompe la ampolla de vidrio, quedando el medio de cultivo en contacto con las esporas. A continuación, el sistema se incuba a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo durante 24 a 48 horas según el microorganismo en cuestión. Del mismo modo que al utilizar tiras de esporas, como resultado de un ciclo de esterilización fallido se observa un viraje de color del medio. Para el usuario, esta tecnología resulta metodológicamente más sencilla de utilizar que la incubación de tiras de esporas, y se elimina la obtención de falsos positivos por fallas en la manipulación del indicador que conducen a contaminaciones cruzadas.

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C. indicadores biológicos autocontenidos rápidos colorimétricos

El principio de funcionamiento de los mismos es similar al de los Indicadores biológicos autocontenidos, pero difieren en su presentación. El sistema contiene un tubo con base cónica en donde se inoculan directamente la esporas bacterianas, además poseen un filtro especial que permite mantener el vidrio en la parte superior del tubo luego de la rotura de la ampolla de vidrio. Luego de la incubación a la temperatura de crecimiento del microorganismo en cuestión se lleva a cabo la lectura del resultado.

D. indicadores biológicos autocontenidos de lectura rápida de fluorescencia

Poseen una presentación similar a los indicadores biológicos autocontenidos pero estos indicadores revelan la presencia de esporas vivas mediante la detección de la actividad de enzimas asociadas a las esporas de Geobacillus stearothermophilus y Bacillus atrophaeus. Tales enzimas son del tipo glucosidasas y son capaces de degradar un sustrato específico generando un compuesto fluorescente, el cual es detectado por una 20

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incubadora de lectura rápida de fluorescencia. La detección de fluorescencia indica una falla en el ciclo de esterilización mientras que la ausencia de fluorescencia indica la inactivación de las enzimas y por lo tanto de las esporas, evidenciando que el proceso de esterilización fue eficaz. Este sistema arroja resultados en tiempos muy cortos que oscilan entre 1 y 4 horas según el caso. E. indicadores biológicos autocontenidos de lectura súper rápida de fluorescencia

El principio de funcionamiento de los mismos es equivalente al de los Indicadores biológicos autocontenidos de lectura rápida, pero los componentes del sistema han sido optimizados de modo tal que permiten la detección de fluorescencia en tiempos extremadamente cortos que van de los 30 minutos a 1 hora. Son capaces de medir directamente la letalidad inducida por un dado ciclo de esterilización, sumado a la posibilidad de evaluar los resultados en tiempos tan cortos, convierten a este sistema en la alternativa más poderosa del mercado al momento de decidir la liberación de los materiales para su utilización.

5.2. Esterilización de líquidos

Al momento de esterilizar líquidos por vapor y monitorear tales procesos de esterilización, deben considerarse algunas variables asociadas a este tipo de sistemas. Dado que el líquido debe disponerse en un recipiente contenedor, el agente esterilizante no estará en contacto directo con el mismo; además dependiendo del volumen de líquido y formato del envase contenedor seleccionados, la penetración efectiva del vapor debe tenerse en

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consideración al momento de establecer la duración del ciclo a fin de que el mismo sea efectivo. Se han diseñado métodos de control especiales para el monitoreo de procesos industriales de esterilización de líquidos por vapor. Éste consiste en la utilización de ampollas autocontenidas con esporas, las ampollas se colocan dentro del recipiente que contiene el líquido a esterilizar, o alternativamente, en un envase con algún líquido de características fisicoquímicas similares al del líquido a esterilizar. Luego de la exposición al agente esterilizante, las ampollas se incuban entre 24 y 48 horas a la temperatura de crecimiento del microorganismo en cuestión.

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IV.


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3 ed. OMS 2005 2. Biorisk Management: Laboratory Biosecurity Guidance OMS. 200 3. Directive of the European Parliament and of the council. 2000 /54/EC. 4. Casimiro, A. M. Niveles de riesgo y condiciones de bioseguridad en el laboratorio clínico Subcomisión de Bioseguridad AAM 2005. 5. Micucci, Horacio A. Niveles de Bioseguridad en Microbiología. La Norma IRAM 80059. Publicación del Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 35(4) 515-519, 2001 6. Mazzali, L. R. Nivel 4 de Bioseguridad. Publicación Revista Sociedad de Microbiología de Venezuela 25(1).50-53, 2005 7. Publicación Unidad 2. Bioseguridad. Facultad Cs. Químicas y Farmacéuticas. UNR 2009

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