Uji Antibakteri
Pada uji ini diukur respon pertumbuhan populasi mi kroorganisme terhadap agen antimikroba. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti metode Diffusi seperti Disc diffusion, E-test, Ditch-plate technique, Cup-plate technique, dan Gradient-plate technique (Pratiwi, technique (Pratiwi, 2008). Uji Difusi
Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan. Metode ini dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu secara sumuran dan cakram disc. disc. Metode sumuran yaitu dengan membuat lubang/sumur pada media agar yang telah ditanami dengan bakteri uji dan pada lubang/sumur tersebut diberi larutan antibakteri yang akan diuji (Pratiwi, 2008), lalu pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan disekeliling lubang/sumur. Sedangkan, metode cakram disc merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan yaitu dengan menggunakan Cakram disc berisi disc berisi antibakteri ditempatkan pada permukaan medium padat yang sebelumnya telah diinokulasikan bakteri uji pada permukaannya (Geo F et al, 2005). Setelah diinkubasi, area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan bakteri uji oleh agen antibakteri pada permukaan agar (Pratiwi, 2008). Misalnya, hasil positif (+) apabila terbentuk zona bening pada media MHA (Muller Hinton Agar), Agar), ini menunjukkan bahwa zat uji memiliki daya antibakteri. Sedangkan hasil negatif (-) apabila tidak membentuk zona bening pada media MHA (Muller Hinton Agar). Agar).
Cakram Batas zona Zona pertumbuhan bakteri
6
7
Gamber 2.6 : Interpretasi Hasil Metode Difusi
Sumber : (Geo F et al, 2005)
Tabel 2.6 Kelebihan dan Kekurangan Metode Difusi Kelebihan
Kekurangan
Dapat menggunakan beberapa jenis antibakteri pada 1 lempeng agar secara
Dipengaruhi banyak faktor
bersamaan Dapat menentukan Sensitif atau
Biasanya bakteri uji menggunakan
Resisten
biakan murni Memerlukan volume media yang
Hasil kuantitatif
relatif banyak
Dapat menentukan KHM
Sumber : Geo F et al, (2005), Vandepitte et a l (2010).
Ekstrak Biji ketumbar dengan konsentrasi 25%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% dan 75% (contoh). dimasukkan ke dalam tabung tabung reaksi yang sudah sudah diberi label. Blank label. Blank disc disc direndam selama 60 menit atau sampai menjadi jenuh pada masing-masing konsentrasi ekstrak Biji ketumbar. Lalu pindahkan disc disc dalam cawan petri steril sesuai masing-masing variabel konsentrasi. Suspensi bakteri yang sudah dibuat di inokulasikan pada media Mueller Hinton Agar (MHA) secara merata menggunakan kapas lidi steril, diamkan selama 10 menit. Selanjutnya letakkan disc ekstrak disc ekstrak bunga cengkeh dengan konsentrasi yang sudah ditentukan pada media MHA yang sudah ditanami bakteri uji. Inkubasi dalam ikubator selama 24 jam pada suhu 37
.
Kontrol positif untuk bakteri Escherichia bakteri Escherichia coli adalah disc antibiotic kloramfenikol. antibiotic kloramfenikol. Kontrol negatif untuk masing-masing bakteri uji adalah VCO (Virgin Coconut Oil) (Uun, 2016).
8
Metode E -test -test
Metode E-test digunakan untuk mengestimasi KHM (Kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan
strip plastic yang yang mengandung agen
antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan media Agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media Agar (Pratiwi, 2008). Metode Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media Agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kea rah parit yang berisi agen antimikroba (Pratiwi, 2008). Metode Cup-plate technique
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dif fusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi, 2008). Metode G r adi adi ent-plate techni technique que
Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media Agar secara teoritis bervariasi dari 0-maksimal. Media Agar dicairkan dan larutan sampel ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang keatasnya. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba bedifusi dan ermukaan media mongering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) di goreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di bandingkan dengan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan (Pratiwi, 2008). 2008). Uji Dilusi
Sejumlah zat antimikroba dimasukan ke dalam medium bakteriologi padat atau cair. Biasanya digunakan pengenceran dua kali lipat zat antimikroba. Medium akhirnya diinokulasi dengan bakteri yang diuji da n diinkubasi.
9
Tujuan akhir dari metode dilusi adalah untuk mengetahui seberapa banyak jumlah zat antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri yang diuji. Uji keretanan dilusi agak membutuhkan waktu yang banyak, dan kegunaanya terbatas pada keadaan-keadaan kead aan-keadaan tertentu. Uji dilusi dil usi kaldu tidak praktis dan kegunaannya sedikit apabila dilusi harus dibuat dalam tabung pengujian, namun adanya serangkaian preparat dilusi kaldu untuk berbagai obat yang berbeda dalam lempeng mikrodilusi telah meningkatkan dan mempermudah metode (Jawet, et al., 2007). Keuntungan uji dilusi adalah bahwa uji tersebut memungkinkan adanya hasil kuantitatif, yang menunjukan jumlah obat tertentu yang diperlukan untuk menghambat (atau membunuh) mikroorganisme yang diuji (Jawet e t al.,2007). 1. Metode dilusi cair Metode ini mengukur MIC ( Minimum Inhibitory Inhibitory Concentration) Concentration) atau KHM (Kadar Hambat Minimum) dan MBC ( Minimum ( Minimum Bactericidal Concentration) Concentration ) atau KBM (Kadar Bunuh Minimum). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen a gen antimikroba pada medium cair cai r yang ditambahkan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Selanjutnya, cairan kultur hasil inkubasi digoreskan pada media agar MHA menggunakan ose lalu diinkubasi pada suhu 37 ℃ selama 18-24 jam. Pertumbuhan koloni bakteri pada media agar MHA diamati dan dibandingkan dengan kontrol untuk menentukan Kadar Bunuh Minimum (KBM) (Kumalasari, 2011). Prosedur kerja metode dilusi diawali dengan pembuatan sta ndar McFarland 0,5 yang setara dengan jumlah bakteri sebanyak 1,5 × 108 CFU/ml. Bakteri uji yang telah di remajakan pada media Nutrient Agar Slant (NAS) (NAS) diambil dengan kawat ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi larutan NaCl 0,9% steril hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan standar McFarland 0,5. Kemudian suspensi bakteri di encerkan dengan perbandingan 1:100 yaitu dengan mencampur 1 bagian suspensi bakteri dengan 99 bagian media Mueller Hinton Broth (MHB).
10
Bahan yang digunakan adalah ekstrak Biji ketumbar (Coriandrum Sativum L.), media L.), media MHA (Muller Hinton Agar) dan Agar) dan MHB ( Muller Hinton Broth), Broth) , DMSO 10%, suspensi bakteri Escherichia bakteri Escherichia coli, coli, dan antibiotik Kloramphenikol antibiotik Kloramphenikol (contoh). Menyiapkan kontrol positif dan negatif serta melakukan pengenceran pada ekstrak Biji ketumbar dengan menyiapkan tabung reaksi steril. Semua konsentrasi pengenceran dibuat dalam volume 1 ml, sehingga volume ekstrak yang digunakan untuk konsentrasi 25%, 10%, 15%, 10%, 5%, 0% (contoh) berturut-turut yaitu 0,25 ml; 0,20 ml; 0,15 ml; 0,10 ml; 0,5 ml; 2 ml (contoh), kemudian di add -kan -kan hingga volume total 1 ml (contoh) dengan DMSO (Dimetil sulfoksida). Menggunakan pengencer DMSO (Dimetil sulfoksida) 10% karena hasil ekstraksi biji ketumbar bersifat non polar dengan menggunakan pelarut etanol 96%, sedangkan DMSO dapat larut pada pelarut polar dan non polar, yang artinya larutan DMSO dapat digunakan sebagai pengencer ekstraksi biji ketumbar. Untuk kontrol negatif (-) memipet 1 ml antibiotik Kloramphenikol yang dilarutkan dalam aquadest steril, sedangkan untuk kontrol positif (+) memipet 1 ml DMSO (Dimetil sulfoksida). Membuat suspensi Bakteri dengan cara mengambil 1 ose suspensi bakteri Escherichia coli coli dan mencampurkannya dengan PZ steril yang kekeruhannya disetarakan dengan Mac Farland 0,5. Setelah itu membuat media Muller Hinton Broth yang Broth yang digunakan untuk tes dilusi. Suspensi bakteri yang setara dengan 0,5 Mac Farland diencerkan dengan Muller Hinton Broth (0,1 mL larutan kuman ditambahkan 9,9 mL Muller Hinton Broth). Broth). Memipet 0,5 mL ekstraksi biji ketumbar dengan berbagai konsentrasi lalu ditambahkan campuran suspensi dengan media MHB 0,5 mL ke dalam masing-masing masing-masing tabung, lakukan secara aseptis, kemudian menginbukasi selama 24 jam dalam suhu 37 oC. Pada hari berikutnya, menyiapkan media MHA (Muller Hinton Agar) ambil Agar) ambil 1 ose dari masing-masing tabung dan streak pada media tanam, lakukan secara aseptis, kemudian menginbukasi selama 24 jam dalam suhu 37 oC. Pada hari selanjutnya, amati pertumbuhan koloni bakteri bakteri pada media tanam. Kontrol positif metode metode dilusi menggunakan menggunakan campuran suspensi
bakteri
dengan larutan antibiotic kloramfenikol 2%. Kontrol negatif menggunakan campuran suspensi bakteri dan larutan DMSO 10%. Data KHM dan KBM pada masing-masing pengenceran hanya menyajikan hasil positif dan negatif.
11
2. Metode Dilusi Padat Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat. Keuntungan metode ini adalah adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
