Metode Uji (Robustness) Kekuatan dan SST I.
(Robustness) Kekuatan
Metode robustness mrupakan kemampuan metode analisis untuk memvalidasi kekuatan suatu metode yang kecil dan terus menerus mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Serta dapat memeberikan indikasi dalam penggunaan secara normal. Stabilitas dari nilai yang diamati dapat diuji dengan mengubah beberapa kondisi analisis seperti pH pelarut, suhu raksi, waktu reaksi atau penambahan reagen. Ketika nilai yang diamati tidak stabil, prosedur analisis harus diperbaiki. Untuk mevalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus seta mengevaluasi respon nalitik dan efek pada presisi dan akurasi. Aspek metode yang mungkin mempengaruhi hasil harus diidentifikasi, dan mempengaruhi kinerja metode dievaluasi dengan menggunakan tes robustness. Metode uji ini dengan sengaja memperkenalkan perubahan kecil prosedur dan memriksa efek pada hasil. Sejumlah aspek dari metode ini mungkin perlu dipertimbangkan, tetapi karena sebagian besar akan memiliki efek yang dapat diabaikan biasanya mungkin untuk beberapa beberapa variasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan menunjukkan kekukatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak (±0,2 unit) dan perubahan temperatur kolom (± 2-3°C). Contoh faktor-faktor yang tes kekasaran dapat mengatasi adal ah: perubahan dalam instrumen, operator, atau merek reagen; konsentrasi reagen; pH suatu larutan; suhu reaksi; waktu diizinkan untuk menyelesaikan proses, dan lain-lain. Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor ini dapat diidentifikasi sebgaia A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a,b dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemerikasaan r uggedness. uggedness. Berikut ini, merupan petunjuk pelaksaan validasi metode dan cara perhitungannya : Nilai Faktor
Penetapan Faktor Eksperimen
A atau a
#1
#2
#3
#4
B atau b
A
A
a
a
C atau c
B
b
B
b
D atau d
C
c
c
C
Untuk menentukan efek perubahan A, bandingkan rata-rata hasil (#1 + #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, untuk efek perubahan B, bandingkan (#1 + #3)/2 dengan (#2 + #4)/2 dan seterusnya. Sebagai contoh seorang peneliti menguji metode penentuan azithromycin dengan HPLC dengan prosedur sama oleh analis yang berbeda. Robustness dilakukan dengan melakukan variasi terhadap komposisi fase gerak yaitu ±2.0% (22:78-18:82), variasi laju alir ±10% (1,1 mL sampai 1,3mL/min) dan variasi suhu Column ±5.0°C (40°C -50°C). Hasil penentuan robustness dapat dilihat pada tabel berikut :
Ketahanan suatu metode analisis adalah ukuran dari kemampuannya untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil, tetapi disengaja dalam parameter metode, dan memberikan indikasi kehandalan selama penggunaan normal. Ketangguhan metode kromatografi, misalnya, dapat dievaluasi oleh variasi dalam parameter seperti komposisi fase gerak, pH dan kekuatan ion, suhu dan banyak yang berbeda atau pemasok kolom. Evaluasi ketahanan harus dipertimbangkan dalam tahap pengembangan metode. Bahkan, proses validasi metode tidak dapat dipisahkan dari perkembangan aktual kondisi metode, karena tidak mungkin untuk mengetahui apakah kondisi metode dapat diterima sampai studi validasi dilakukan. Evaluasi kekerasan kromatografi metode sering kompleks, dengan mempertimbangkan jumlah besar parameter analisis yang harus dianggap melakukan tes. Beberapa penulis memilih parameter analisis analisis yang spesifik untuk dievaluasi, interpretasi data dilakukan dengan t-test atau uji ANOVA.
Tabel di atas merupakan hasil dari uji robustness dengan menggunakan HPLC, Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui kestabilan metode analisis (tidak terpengaruh oleh variasi yang diberikan). Salah satu contoh yaitu ketegaran metode uji penentuan ketoprofen dengan HPLC dilakukan dengan kondisi variasi dan variasi standar deviasi relatif yang diperoleh pada uji ketegaran adalah 1,42%, yang berarti metode ini memiliki kestabilan yang baik terhadap variasi waktu yang diberikan karena memenuhi kriteria penerimaan yaitu <2%. II.
System Suitability Test
Uji kesesuaian sisitem dilakukan untuk memastikan suatu sistem berjalan dengan baik dan benar serta memastikan bahawa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Tujuan dilakukan uji kesesuaian sistem untuk menhetahui apakah metode analisis masih mmeberikan hasil yang sama atau masih bisa digunakan. Uji kesesuaian sisitem didasarkan pada konsep bahwa elektronik, peralatan, zat uji, dan kondisi operasional analit merupaka suatu sistem analit tunggal yang dapat diuji fungsinya secara keselurhan. Data dapat dikumpulkan dari penyuntingan berulang larutan standar dan uji sebanyak 6 kali, diefaluasi kromatografinya dengan melihat faktor kapasitas, presisi, retensi relatif, resolusi, tailing factor (faktor ikutan), jumlah lempeng teoritis. a.
Faktor kepastian (k’) Faktor kepastian memastikan bahwa peak yang diharapkan tidak mengganggu volume kosong, setiap peak harus terpisan dari kromatogram yang lain dan volume kosong. Nilai faktor kepastian sebaikknya >2
b.
Presisi Nilai RSD ≤ 1 untuk n ≥ 5
c.
Retensi relatif Untuk mempandingkan letak kromatogram dengan standart, nilai retensi relatif yang baik 95%-101%
d.
Resolusi Mengukur keterpisahan dua puncak , nilai Rs >2
e.
Tailing factor (faktor ikutan) Untuk menguji kesimetrisan kromatogram, nilai faktor ikutan yang baik ≤ 2
f.
Jumlah lempeng teoritis Nilai jumlah lempeng teoritis sebaikknya > 2000 Misalnya, dilakukan enam kali penyuntikan terhadap sampel dengan konsentrasi 10
µg/ml, yang mengandung standar internal 5 µg/ml, kemudian diamati waktu retensi, rasio
luas area, dan rasio tinggi puncak kromatogram. Konsentrasi tersebut dipilih untuk mewakili konsentrasi rendah, diasumsikan jika hasil konsentrasi rendah sudah dapat memberikan nilai yang baik, maka diharapkan konsentrasi tinggi memberikan nilai yang baik pula. hasilnya dapat diketahui KV dari waktu retensi, rasio luas area kromatogram, dan rasio tinggi puncak kromatogram < 4%, nilai ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan telah memenuhi kriteria kesesuaian sistem yaitu KV < 10%. Kesesuaian sistem juga digunakan untuk mengetahui faktor asimetri dan faktor ikutan (tailing factor) dari puncak. Asimetri dan faktor ikutan digunakan untuk mengetahui kondisi kolom dan kondisi percobaan. Asimetri puncak dengan konsentrasi10 µg/ml dan adalah 0 (terdapat pada hasil kromatogram), dapat dilihat pada kromatogram kesesuaian sistem bahwa kedua puncak terlihat cukup simetris. Nilai tersebut telah memenuhi kriteria nilai asimetri yakni < 2. Nilai faktor ikutan untuk puncak dari kedua sampel adalah 0 (terdapat pada hasil kromatogram),. Faktor ikutan yang diperoleh telah memenuhi nilai persyaratan, yaitu < 2.
