Manual de Trabajos Practicos Parasitologia Medica

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL “FRANCISCO DE MIRANDA” AREA CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA U.C. MICROBIOLOGIA I

MANUAL DE TRABAJOS PRACTICOS DE PARASITOLOGIA MÉDICA

REALIZADO POR: LIC. YOTSABETH SAUL GARCIA SANTA ANA DE CORO – 2009

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INDICE

Generalidades…………………. …………….………………………………. ………………………………. UNIDAD I: Generalidades…… …………….

……………. 3

Normas de Bioseguridad…………………………………………………….

……………. 4

Microscopio Óptico…………………………………………………………

……………. 6

UNIDAD II: Protozoarios …….……………………………………………..

…………….. 10

Prá ctica Nº1: Protozoarios Intestinales y Genitales………………………… Prááctica

…...……….. 11

Práctica Leishmaniooisis………………. Práctica Nº2: Leishmania , sus vectores y las Leishmani oisis……………….

……………. 21

Práctica Práctica Nº3: Trypanosoma , sus vectores y las Tripanosomosis Americana  y Rangeliana ………………………………………………………………...

…………… 29

Práctica Práctica Nº4: Plasmodium , SUS VECTORES Y LAS MALARIAS HUMANAS..

…………… 35

gondii   , y toxoplasmosis y otras coccidiosis Práctica Nº 5: Toxoplasma gondii, coccidi coccidioosis sis emergentes en inmunosuprimidos. (Criptosporidiasis, Ciclosporiasis, Isosporiasis) …………………………………………………………………

……………. 41

UNIDAD III: Helmintos ……………………………………………………. Práctica Nº6: Geohelmintos y Geohelmintiasis ……………………………. Práctica Nº 7: Biohelmintos y Biohelmintiasis ……………………………. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………….

……………. 47 ……………. 48 ……………. 59 ………………69

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Realizado 2009 Realizado or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl arcía. U.C.: U.C.: Microbiolo Microbiol Microbioloo ía. Pro  Pro rama Medicina Med Mediicina cina UNEFM. UNEFM. 2009 

UNIDAD I GENERALIDADES

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Realizado por: por: Yotsabet h Saúl García. Microbiologí a. Programa Medicin a UNEFM. 2009 Realizado Reali Realizado zado por: or: Lic Yotsabeth Yotsa Yots abeth beth arcía. U.C.: U.C.: Microbiología. Microbiol Micr Mic robiolo obioloo ía. Pro rama Medicina Medi cina UNEFM. 2009 

Microbiología I  

N Noor as de Bioseguridad

Normas de Biose uridad en el Laboratorio de Mic obiología INTRODUCCIÓ INTRODUCCIÓ Todas las personas que trabajan con materiales que que cont conten enga gan n agen agente tess infe infecc ccio iosos deben estar cons consci cien ente tess de de los los peli peligr gr s potenciales asociados a su manipulación; además, deben esta estarr ent entre ren nadas adas en las las prá práct cticas y técnicas requeridas para manejar estos materiales biológicos de una manera segur a. Es por por ello ello que que antes antes d comenzar con las actividades actividades prácticas, prácticas, toda todas las personas invo involu luccrada radass (es (estu tudi dian ante tess, pers personal técnico y prof profes esor ores es)) ten tenem emos os la obl oblig igac ación de conocer cuál cuáles es son las las nor norma mass de de seg segur uriidad a seguir en el lab labor orato atorio rio,, de mane manera ra tal, tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto para las personas que lo ejecutan como para para el medi medioo amb ambient ientee los los de ás seres vivos. El objetivo general de esta lectura, es ofrecerle al estudiante una uía para que realice sus actividades pr cticas en el Laboratorio de Microbiología e una manera adecuada y segura.

en el Laboratorio de Micro iología, razón por la cual ual deb debem emos os llev llevar ar as a cabo con prec precauc aución ión,, adem además ás de de ten tener un ambiente de trabajo en el que seamos capaces de reconocer evitar los peligros involucrados con estas activ activida idades des,, para para así así pod poder evitar posibles accidentes. •

Infecciones Adquiridas en el Laboratorio: Se dice que ocurre una co taminación en un Labo Labora rato tori rioo Micr Microb obio ioló lógi gi o, cuando un microorganismo, capaz de ausar enfermedad, entra al cuerpo de un individuo en una concentración suficiente y a través de una ruta determin determinada, ada, siend siendoo capaz de vencer las defensas del individuo. Una Infección Adquirida en el Laboratorio (IAL) es aqu aquella lla que que res res lta de una tarea realizada en el Laboratorio de Microbiología, tanto por el operador como por cualquier otra person personaa que pudo pudo queda quedar expuesta, como resultado de la mani ulación de un determinado agente infeccioso.

BIOSEGURIDAD •

La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conoci iento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prev preven enir ir la expo exposi sici ción ón del del per perso sonal, del área de lab laborato atorio y de del me medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o Bi peligrosos. •

•

Agentes Biopeligrosos: Son todos aquellos agentes biológicos y mate materi rial ales es que que son pote potenc ncia ialm lmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos itar: bacterias, virus, hongos, parásitos (helmintos y protozoarios), productos recombinantes, alergenos, priones, etc. Riesgo Microbiológico: En el Lab Laborat orator orio io de Mic Microb robiol iol  gía existen dos fuentes principales de peligros biológicos, uno de ellos lo representa el pr cesamiento de muestras provenientes de un paciente, y en segundo lugar el manejo e cultivos de microorganismos, los cuales p eden alcanzar concentraciones muy elevadas pueden llegar a provocar una infección si no son manipulados con precaución. El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que realicemos una actividad práctica

Vías de Infección Los microorganismos pu den ingresar al orga organi nism smoo a trav través és de: de: la la bo bo a, los pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. En las IAL, IAL, la ruta ruta de entrad entradaa n es necesariamente la mism mismaa que que cuand cuandoo la enfermedad se adquiere en forma natural. Las vías de contaminación ás frecuentes en el laboratorio se dan a través d e:

o

o

o

La boca Comer, beber y fumar en el laboratorio. Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección. Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utens ilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.). La piel Inoculación accidental con una aguja hipodérmica u otros instru entos punzantes o de vidrio. Cortaduras o rasguños. Los ojos Salpicaduras de materiales i fecciosos. Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contami ados. 4

Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab Garc U.C.: Micro Microbi crobio crobiolog biolog ología. logía. Programa Prog Medi Medic Medici 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab abeth eth Saúl Saúl García. arcía. arcía. U.C. U. C.:: Micr Mi crob obio iolo lo ía. ía. Pro Pr oogram rama ramaa Medici Me dici cii a UNEFM. 2009 

Microbiología Microbiologí Microbiologíaa I o

Los pulmones Inhalación Inhalación de microorganism microorganismoos transportados por el aire (aerosoles). NORMA NOR NORMAS MASS DE SEGURI SEGURIDA DAD EN EL LABORATORIO DE MICRO BIOLOGÍA - Entr Entrar ar al lab laborat orator orio io en forma ordenada; dejar las carteras, libros y otros objetos pers person onale aless en el el lugar lugar que que se se l s indique para tal fin. - Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento momento.. La misma misma deb deb permanecer completamente cerrada. - Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo con cloro diluido, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica. - No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar eguro de cómo emplearlo. - No devolver sustancias sus envases originales. - Emplear la propipeta al medir líquidos biopeligrosos. - Reali Realiza zarr solam solamen ente te aqu aquel elllas actividades indicad indicadas as por por el Profes Profesor, or, y n llevar a cabo experimentos no autorizados. - Reportar inm inmediat iatame amente cualquier accidente al Profe Profesor sor (derram (derramee de materi materi l contaminado, heridas, quemaduras, etc.), por lo que ninguno debe ser catalogado como meno r. - Red Reduc ucir ir al mínimo mínimo la form formac aciión de aerosoles durante la realización de cualquier trabajo práctico. - Ex Extremar las las precaucion iones cu cu ndo se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación accidental y la generación de a rosoles durante su manipulación y desecho. - Emple Emplear ar técnica técnicass aséptic asépticas as pa a el manejo de cultivos de microorganismos. MEDIDAS EN CASO DE EMERG NCIA - Derrame de material biol  gico sobre el cuerpo: remover la ropa inmediatamente. Lavar vigorosamente el área ex uesta con agua  y jabón por un (1) minuto. Reportar el incidente al Profesor. Buscar atención médica si es ne esario. - La ropa ropa cont contami amina nada da debe debe ser colocada en una solución solución desinfect desinfectante ante ante de ser lavada. - Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: lavar inmediata ente el globo ocul ocular ar e inte interi rior or de de la sup super erfi fi ie del párpado con abund abundante ante agua agua durant durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar

Nor as de Bioseguridad

efectivamente el lavado, c menzando por los párpados. Reportar el incidente al prof esor. Buscar atención médica inm ediatamente. - Cortadas Cortadas menores y herida heridas por pinchazo: Lavar vigorosamente la herida con agua y  jabón por varios minutos. Reportar el incidente al Prof  sor. Buscar atención médica inmediatamente. - En el caso de derrames Reportar el incidente al Prof  sor. Limpiar y desinfectar inmediatamente el área. La persona que realice la operación debe llevar pues puesto to guan guante tes. s. Para Para limp limpiar la porción del derram der rame, e, los troz trozos os de vidri vidrio rotos y/o cultivo deben cubrirse con t allas de papel impregnadas en solución desinfectante. Al cabo de diez minutos debe li piarse empleando nuevas toallas de papel y de infectante. El mater material ial cont contam amina inado do debe ser colocado en un rec recipi ipien ente te para para mate materi rial contaminado o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse  junto con los guantes utiliza dos.

El éxito éxito de estas estas normas norm normas as depen depe depen nor mas dep enn e de la sinceridad, la cons consta tanc nciaia,, la part particicip ipac acióiónn ac activa y cooperativa de cada estudiante, por ello  antes ntes de asistir al laboratorio, deben leer el  fundamento y las  actividades a realizar, para  así evitar posibles  accidentes, con el conocimiento y las técnicas de trabajo apropiadas  . . BIBLIOGRAFÍA - College of Egineering and Engineering Technology. 2001. L boratory Safety Guidelines. HHMI Lab Safety: Emergency Response Guide: Personal Injury. 2 01. - Mahon, Conni and Manuselis, George. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiology.. Second edition. .B. Saunders Company.USA. - Univ niversidad de Alicante. Facultad de Ciencias. Manual de Su ervivencia en el Laboratorio.. Marzo 2001. http://www.ua.es/centros/ ciencias/seguridad /hab_seg_lab_biol.htmProf .

Alessandra Garcés Octubre 2001 5

Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab Saúl Garc García arcía. U.C.: Micro Microb crobio crobiolo biolog iología. logía. gía. Programa Progr Medic Medici 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab ab th Saúl Sa úl García. arc ía.. U.C. U. C.:: Micr Mi crob obio iolo lo ía. ía. Pro Pr oograma rama raama ma Medi Me dici cii a UNEFM. 2009 

Microbiología I

Mic oscopio ptico

MICROSCOPIO OPTICO El microscopio es un in trumento de ópti óptica ca,, que que perm permit itee dis distting ing ir los objetos que por su pequeñez se hacen más o meno menoss inv invis isib ible less al al ojo ojo desn desnu udo, aportando de los mismos una imagen agrandada e invertida. Consta de dos partes: una mecánica y otra óptica. La pa parte mecánica es está co constituida por: - El El ttubo: ubo: soporta la pa parte óptica, tiene una longitud variable según el fa ricante, en su parte superior se encuentra el ocular y en la infer inferior ior el revó revólve lverr co la serie de objetivos. - La columna colu column mnaa o brazo: braz brazo: o: se un n en su parte superior con el tubo y en la inferior con el pie; sirve de soporte a la pl platina. Posee los tornillos macrométrico y mi rométrico, los cuales permiten el despl zamiento del tubo. - La platina: destinada a soportar las preparaciones, es plana y presenta un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos, posee pinzas que aseg asegur uran an la inmo inmovi vili lidd d de las preparaciones y un carro p ovisto de dos tornillos para desplazarlas en dirección late latera rall y anter anteroo-po post ster erio ior, r, con lo cual se logra visualizar toda la prep ración. - El pie: tiene forma variable  y por su pese da estabilidad al microscopio microscopio. La parte óptica está formada por: - Fuente Fuente de luz: luz: puede puede ser u espejo móvil con dos caras: una plana ue se utiliza para para la ilumi iluminac nación ión con con lu solar y otra convexa para luz artificial. Su función es dirigir los rayos luminosos hacia el eje ópti óptico co.. En En los los micr micros osco cop pios con luz incorporada, el sistema de iluminación se encuentra en el mismo. - El El condensador: co condensador: se se en encuentra colocado exactamente en el eje óptico del

micros microscop copio io;; su finali finalida da es condensar la luz en un punto sobre la platina, donde va a ser colocado el objeto.. Está constituido por un diafragma-iris ara controlar la cantidad y el ángulo de los rayos lum luminoso nososs y por por un un sis sistte a de lentes. Posee un apar aparat atoo enf enfoc ocad ador or,, q e consiste en un piñó piñón n y una crem cremal alle lerr , que permiten baja bajarr y sub subir el cond ondensa ensa or por voluntad. - Objetivos: es el rimer elemento aumentador de del mi microscopio, su función es formar la la im imagen de del ob objeto; se encuentra en el el infer inferior ior del tubo tubo e un revólver que lleva adaptados 2-3 ó 4 objetivos, lo que permit permitee el camb cambio io de de uno a otro con sólo  girar el revólver. Ca a objetivo está marcado con su au ento, abertura numé umérica y foco eq equivalente. El aumento o poder de amplificación s diámetros, está indicado por un número seguido de una X o de de :1, :1, por por eje ejemp mplo: lo: 10X ó 10:1, lo que indi indica ca que que tal tal obje objeti ti o aumenta 10 diámetros. Hay Hay dos dos tipo tiposs de de obj objet etiv iv s: los secos, que son aquellos construidos para ser usados sin sin la la inte interp rpos osic ició ión n de otro medio entre la lente lente frontal frontal del del objeti objetivv  y el objeto, los más usados son de 10X, 0Z y 45X. los de inmersión son los que se usan siempre sumergidos en un medio para el cual están calculados, este medio  generalmente es: aceite, agua o glicerina y su aumento es de 97X y 100X. - Ocular: Ocular: constituye el segundo elemento aumentador del micros opio, son lentes colocados en la parte su erior del tubo y su función es aumentar la imagen dada por el objetivo. Pu de ser único (monocular) o doble (binocular) y los más usados son de 8X y 10X. El aum aumento ento o magn magnif ific icac ación de la imagen está está dado dado por el el produ product ct de los aumentos ocasionados por el objetivo y el ocular. Ejemplo: Ocular= 10X Objetivo= 40X, proporciona un aumento de 400X. (Fig. Nº 1) 6

Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab Saúl Garc García arcía. U.C.: Micro Microb crobio crobiolo biolog iología. logía. gía. Programa Progr Medic Medici 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab ab th Saúl Sa úl García. arc ía.. U.C. U. C.:: Micr Mi crob obio iolo lo ía. ía. Pro Pr oograma rama raama ma Medi Me dici cii a UNEFM. 2009 

Microbiología I

ptico icroscopio Óptico

Fig. º1: Partes del Microscopio Ópt ptic ic Ópt

Disponible en: htt ://es.wikipedia.org/wiki/Desarrollo_del_  icroscopio

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Microbiología I

USO DEL MICROSCOPIO Para examinar correctamente la prep prepar arac ació ión n debem debemos os est estud udii r su forma y estructura ura general en en pr pri er término y después los muchos y finos detalles de que está compuesta, para lo cual se requiere de varios aumentos, ya que mie tras más bajo es el aumento, mayor es l tamaño del campo campo que que se obse observa rva,, per per menores los detalles de las diferentes estructuras y viceversa. Procedimiento: 1- Ajustar Ajustar la iluminaci iluminación ón del campo de tal forma que éste quede bien il minado, para lo cual cual se colo coloca ca el obje objeti tivo de menor aumento, se abre todo el di fragma-iris y se sube totalmente el conden ador. 2- Mont ontar la pre prep parac aració ión n so sobre la platina, fijarla de tal modo que el centro de la prepar preparaci ación ón coin coincid cidaa co el orificio cent centra rall de la plati latina na por donde pasan los rayos luminosos. 3- Observar lateralmente y on el tornillo macrométrico, bajar el tubo hasta que el objeti objetivo vo de meno menorr aument aument quede muy cerca de la preparación. 4- Observar por el cular, subir lentamente el tubo con el tornillo macrométrico hasta que aparezca la preparación y aclarar la i agen con el micrométrico. Si una vez obtenida la imagen, la iluminación es muy intensa, ésta puede disminuirse cerrando el diaf diafra ragm gmaa-ir iris is del del cond conden ensa sador hasta que su margen sea igual al ta año del lente posterior del objetivo. Con los objetivos secos, el condensador debe star bajo y el diafragma no muy abierto. Al encontrar encontrar una parte parte del campo que merezca merezca mayor análisis análisis d detalles, se cambiará para un aumento mayor de la siguiente manera: - Centrar en el campo la p rte que desea estudiar, ya que al cambiar el objetivo el campo se se reduce reduce y se corre corre e riesgo de que el objeto quede fuera del mis o. - Girar el revólver hasta que el objetivo de mayor aumento aumento seleccio seleccionad nad quede en la posición indicada.

icroscopio Óptico

- Enfocar la prepa ación con el micrométrico si no se ha movido el tubo, y con el macrom macrométric étricoo s éste se movió, proced procedien iendo do de la la mism mism forma que para el enfoque con menor au ento. En la medida que se incrementan los aumentos, la cantidad de luz requerida va siendo mayor por lo que ebe corregirse el diafragma-iris y el conde sador. Cuan Cuando do se dese deseaa util utiliz iz r el objetivo de inmersión se procede así: - Abrir el diafragma-iris subir al máximo el condensador. - Colocar una gota de aceite sobre la preparación. - Colocar el objetivo de inmersión (100X) en su posición efectiva, siguiendo el eje óptico. - Bajar cuidadosamente l tubo por medio del del torn tornil illo lo macr macrom omét étri rico, bajo control visual lateral externo, ha ta que el objetivo entre en contacto con el ceite sin tocar la lámina. - Observar a través del ocular y enfocar con mucho cuidado con el tornillo micrométrico hasta que sea posible ver bien la preparación. Para lograr mayores aumentos se procederá procederá al al cambio cambio del ocular, usando 15X o 20X, 20X, en en luga lugarr de 8 o 10X. CUIDADO DEL MI ROSCOPIO 1. Cuando no se utiliza ebe cubrirse con una funda de tela que o deje pelusa, o devolverlo a su estuche. 2. Cualquier suciedad líquido que se derrame sobre el microscopio debe limpiarse de inmediato. 3. La part partee mec mecán ánic icaa de debe limpiarse con silicón para proteger la pintura; los engr engrana anaje jess de la pla plati tin n , condensador y tornillo macro y micrométrico, deben aceitarse periódicamente para mantener su movilidad. 4. El aceite de inmersión ebe limpiarse del objetivo inmediatamente inmediatamente espués de usado, para ello lo mejor es q itarlo con papel seco especial para lentes o sustituirlo por  gasa o un paño suave q e no deje pelusa; luego limpiarlo con el mi mo material pero 8

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Microbiología I

humede humedeci cido do ligera ligeramen mente te con xilol y por últi últim mo, seca secarl rloo con con el mi mis o papel seco especial. 5. Los oculares se limpian ara quitar el polvo polvo cuid cuidado adosam sament entee co papel seco esp especia eciall par paraa le lentes ntes,, gas gasaa o p ño suave.

Microscopio ptico

6. El micr microsc oscopi opio, o, par par ser trasladado, deberá sujetarse por la arte del brazo y apoyarl apoyarloo en la palm palmaa de l mano. 7. Cualq ualqui uieer desp despeerfe rfecto deberá ser corregido por personal especializado.

ACTIVIDAD: En el el dib dibuj ujoo ane anexo xo,, ide ident ntif ifiq iq e cada una de las partes indicadas.

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UNIDAD II II PROTOZOARIOS

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PRACTICANº1: PR TOZOARIOS INTESTINALES Y G NITALES MORF MO MORF OR RFOL FOLOG OLOGIA IA Y EST ESTRU RUC CTU A DE AMIBAS PARASITAS DEL HO BRE:  E E ntamoeba h istol y y ica/E. dispar  dispar:  ::   Complejo En Entamoeba histol 

La especie E. histolytica  es la que tiene la capa capaci cida dadd de invad invadir ir teji tejidd s y producir enfermedad, mientras que la especie E. dispar   no es patógena. El examen micr micros oscó cópi pico co de las las mat mater erias fecales no permite diferenciar estas dos especies. E. histolytica posee las características nucleares del género Enta  oeba que son: cari carios osom omaa comp compac acto to,, pequ pequee o y cromatina distribuida por la parte interna de la membra membrana na nucl nuclear ear (Fig (Fig Nº2 Nº2 . La especie E. histolytica se reconoce or tener el cariosoma cariosoma en el centro centro de del núcleo y la cromatina en gránulos de ta año uniforme  y regularmente dispuestos. dispuestos. Trofozoito: o forma forma veget vegetativ ativa mide de 20 a Trofozoito: 40 micras de de di diámetro; cu cua do está móvil, emit emitee un seud seudóópod podo amplio, hialino y transparen transparente te que que se se proyec proyectt como un saco herniario hacia el exterior de la célula, muy fácilmente diferenciable el resto del citoplasma que es gr nuloso. Este seud seudóp ópod odoo es unid unidir irec ecci cion on l, se forma a partir del ectoplasma y mediante éste, el trofozoito se desplaza ejerciendo tracción sobre sobre el rest restoo de la cél célula ula.. E el citoplasma se encuentran encuentran vacuola vacuolas digestivas, eri eritroc trocit itos os y rar raraa vez vez otros elementos fagocitados. Los trofozoitos patógenos,  generalmente contienen eritrocitos fag citados pero presen presentan tan morf morfolo ología gía sim simil ilaa ; por lo tanto, cuand cuandoo se usa usa mic micro rosc scop opía de luz, el reporte clínico es E. histol tica/E. dispar , aun habiendo hematíes fago itados. Sólo es posible la diferenciación a través de métodos inmunológicos. Quist Quiste: e: orga organi nism smoo redo redond ndea ea o u ovoide de Quiste: 10 a 20 mic micra rass de diám diámet etrr , inmóvil, con una membrana quística en vía de formación, sin inclusiones itoplasmáticas, pero ocasionalmente on cuerpos cromatoides y vacuolas de gl cógeno.

DIBUJO

DIBUJO 11

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Práctica Nº1: PROTOZOARIOS I TESTINALES Y GENI GENITALES. TALES.

Corte histológico de de p red intestinal con trofozoitos de Entamoeba histolytica. : Se obser a destrucción parcial de la pared intestinal y trofozoitos de forma redondeada con núc núcleo leo compa ompaccto, to, rod rodea os de un halo claro de lisis separados por zonas de mucosa sana

DIBUJO

Entamoeba coli coli 

Trofozoito: En  coloraciones perman permanent entes es prese present nt forma variada; mide 20 a 50 mi ras; se observa membrana fina, citoplasma granular sin sin dife diferrenc encia entr entree e to y endoplasma, núcleo esférico ro eado por una membrana tapizada internamente por  gránulos de crom tina gruesos e irregularmente distribuidos, su cariosoma es grande y excéntrico.

DIBUJO 12

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MICROBIOLOGIA I

Práctica Nº1: PROTOZOARIOS INT STINALES Y GENITALES. GENITALES.

Quiste: En En colorac coloracione ione permanentes Quiste: presenta forma esférica, mide de 10 a 30 micras, se observa p red quística y de 1 a 8 núcl núcleo eoss co con las mismas características que el núcleo de su trofo trofozo zoit ito. o. Los Los qui quist st s inmaduros presentan cuerpos cromatoides fila filame ment ntos osos os con con ext extre rem m s astillados.

DIBUJO

DIBUJO

MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA DE Giardia lamblia  (in testinalis)  testinalis)

Quiste: Es ovalado con membrana  gruesa, lisa que suele verse separada del citoplasma, mide a 14 micras de largo por 6 a 10 icras de ancho, contiene de 2 a 4 núcleos con cariosoma grande y entral, restos de axonemas, cuerpos parabasales y flagelos.

Trofozoito: Es piriforme, simétrico, con extremo anterior red ndeado y el poster posterior ior afil afilado ado;; mide mide 10 a 20 micras de largo. En la extre idad anterior presenta dos discos su torios, uno a cada lado de la línea nea me ia, dos núcleos ovalados con cariosoma rande, central dos axonemas que recorren el eje longitudinal del cuerpo, los cuales son atravesados en el ce tro por dos cuerpos parabasales en forma de coma. Los cuatro pares de flagelos sólo se colorean con tinciones especiales.

DIBUJO 13

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Práctica Nº1: PROTOZOARIOS INTESTINALES Y GENI GENITALES. TALES.

Balantidium coli.

Quiste: es de forma más redondeada, con un diámetro de 40 a 60 icras, con doble membrana membrana gruesa, gruesa, a travé travé de la cual puede observarse el parásito, a veces con algún movimiento. En el interior resalta el macronúcleo.

Trof Trofoz ozoi oito to:: For Forma ma oval ovalaa a, con una Trofozoito: long longit itud ud prom promed edio io de 50 a 2 0 micras y 40 a 50 micras de ancho. Está r deado de cilias que le permiten desplaza iento rápido. Posee en la parte anterio anterior una “boca” prim primit itiv ivaa o cito citost stom omaa con con cilios largas que le sirv sirvee par paraa obt obten ener er alim alimen en o, el cual pasa a vac vacuo uola lass dig digeesti stivas. vas. Los Los re re tos alimeticios son elimina eliminados dos por por vacuola vacuola contráctiles a través través de una una aper apertur turaa en el extremo post poster eriior, or, llam llamaada cito citopi pi io. Tiene 2 núcleos, uno mayor arriñonado, llamado macr macron onúc úcle leo; o; el otro otro redo redon ndo y pequeño,  generalmente cerca de la oncavidad del anterior, denominado micro úcleo.

TECNICAS DIRECTAS DE DIAGNOS DIAGNO DIAGNOSTICO COPROCOPRO-PARAS -PARAS TLOGICO: DIBUJO TECNICAS DIRECTAS DE DIAGN STICO CORPOCORPO-PARASIT -PARASIT LOGICO

DIBUJO

Obtención de la muestra fecal: Generalmente la muestra emitida espontáneamente es ad cuada para el examen examen coprol coprológico ógico.. Deb Deb recogerse en un recipiente (frasco o caja plástica), seco y limpio limpio.. La muest muestra ra fecal fecal no debe mezclarse con con ori orina na y deb debee env envia iarrse al laboratorio inmediatamente después de obtenida. En algunas circunstancias, n las cuales se puede obtener muestras directamente de

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intestino, como sucede cuando se efectúan rectoscopias o se hace tacto rectal, este material es adecuado para el estudio parasitológico. Son muestras inadecuadas las que se han mantenido por más de un día a temperatura ambiente; las que se obtienen después de un estudio radiográfico del tubo digestivo, en el cual se usa bario; y las que presentan abundante cantidad de algunas sustancias que se han ingerido con fines terapéuticos, como aceite, algunos antidiarreicos con bismuto, etc. Uso de laxantes: únicamente están indicados en casos de constipación. No deben utilizarse de rutina, pues en las heces líquidas llevan a una mayor dilución de los huevos y quistes, lo que dificulta su hallazgo. Número de muestras: debe estudiarse más de una muestra fecal, cuando en el primer estudio no se obtiene el resultado que clínicamente se presume o cuando se sospecha una parasitosis intestinal y exámenes previos de laboratorio han sido negativos. En amibiasis y giardiosis crónica es aconsejable hacer dos o tres exámenes irregulares en días diferentes, debido a la eliminación irregular de quistes. Conservación y envío de muestras fecales: las muestras deben ser llevadas al laboratorio la más pronto posible después de obtenidas, pues los trofozoitos pierden, en pocas horas, las características morfológicas. La putrefacción, por multiplicación bacteriana, puede hacer que la muestra sea inadecuada después de tiempo prolongado. Las muestras con más de un día de obtenida, favorecen la incubación de algunos huevos de helmintos, lo cual dificulta su reconocimiento. Si es indispensable conservar la muestra para envío o examen posterior, se recomiendan varios métodos: a) Refrigeración: este es el método más sencillo y práctico, cuando la conservación debe hacerse por algunas horas o por un día. El frasco se debe colocar en el refrigerador a 4 ºC, pero no en el congelador.

Práctica Nº1: PROTOZOARIOS INTESTINALES Y GENITALES. GENITALES.

b) Preparaciones selladas: pueden hacerse con vaselina o barniz de uñas, aplicados en los bordes del cubre-objeto. Se obtienen preparaciones semi-permanentes con el método de la doble laminilla, que consiste en cubrir la muestra con una laminilla pequeña sobre la cual se aplica bálsamo y una laminilla de mayor tamaño. c) Formol: se mezcla una cantidad aproximada de 3 g de materias fecales por cada 10 ml de formol diluido al 5 ó 10%. Este mantiene la muestra sin descomposición, disminuye el mal olor y fija los parásitos para estudio posterior. Con este método se conservan bien los huevos de helmintos y los quistes de protozoos. 1. EXAMEN COPROLOGICO DIRECTO:

a) Examen macroscópico: es importante determinar la consistencia de las heces  y clasificarlas en líquidas, blandas o duras. El color normalmente y con dieta

mixta, la deposición es de color pardo o marrón más o menos oscuro en el adulto.Con dieta láctea y en los lactantes es amarillo canario. Con dieta cárnea se hace hace marrón oscuro. Una alimentación alimentación rica en verduras (espinacas especialmente) tiñe las heces de un color verdoso, mientras que si preponderan las patatas y el pan, las heces se aclaran hacia un marrón amarillento. En  general, las heces duras de los estreñidos son más oscuras que normalmente, y las deposiciones diarreicas suelen ser más claras, aunque en esto último hay numerosas excepciones. Las heces de color Blanco-grisáceo, de color ceniza, son las heces en la acolia de las ictericias obstructivas. Amarillentas, con diferentes matices, son las heces en las "diarreas de fermentación". De color verde, por la biliverdina, aparecen otras veces las deposiciones por paso rápido  global en las diarreas duodenales ("diarrea (" diarrea  yeyunal" de Nothnagel). Rojizas, irregularmente, son las deposiciones que contienen sangre no transformada, de origen bajo (hemorroides, tumores de colon colon distal, etc.). etc.). La hematina puede dar un color pardo-rojizo a las heces. De color pardo suelen ser las diarreas  gastrógenos. Pardo oscuras son las heces de putrefacción que aparecen en distintos

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Realizado Reali Realizado zado or: Lic Yotsabeth Yotsa beth Saúl arcía. U.C.: U.C.: Microbiol Micr obioloo ía. Pro rama Medicina Medicina UNEFM. UNEFM. 2009  2009 Yotsabeth Microbiolo

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proc proceesos sos (col (coliitis, is, cánc áncer, ure ia, etc.), o las debidas a pleiocromia por xceso de bilis, en la ictericia hemolítica. Negruzcas y pastosas, son típicamente las hece hecess en las las "mel "melen enas as"" -de -de a í su nombre-, es de decir, en en la las he hemorra ias digestivas altas. No hace falta recurrir al laboratorio cuando la sangre inalterada es reconocible a simple vista embadurnando la dep sición (sangre de origen bajo: hem hemorroides, etc.), ni tampoco en los casos de he orragias altas abundantes con heces negras.  La sangre en heces puede roceder de un cánc cánceer de esó esófago fago,, var varii es esofágicas (cirrosis hepática), ulcus astroduodenal, carcinoma gástrico, ulceraciones intestinales (tifoidea, tuberculosis, colitis ulcerosa), infarto mesentérico, invag vaginac nación in intestinal, cá cá cer de colon, poliposis, hemorroides. Debe observarse si existe moco, sangre, restos alimenticios o helmint s. b) Examen microscópico: microscópi co: en un portaobjetos se coloca separada ente una gota de solución salina al 0.85% otra de Lugol (Fig Nº3). Se cubren con p rta-objetos de 22x22 mm y se observa al icroscopio con objetivo de 10X y luego con 40X. La cantidad de materia fecal se controla de tal modo que se pueda leer través de la preparación; evitar preparaciones muy  gruesas o muy delgadas. Los parásitos móviles se observan en solución salina. Al hacer hacer la prep prepara aració ción n se usa un palillo o aplicador que se descarta y o introducirlo en la gota con Lugol. El Lug Lugol ol hac hacee re resa salt ltar ar alg algun unas estructuras, como núc núclleos de de pr protozoa ios y da una coloración café a los huevos y larvas. Además de las formas parasi arias, se deben obse observ rvar ar ele elemento entoss de ori en vegetal o animal que son importantes e reconocer, o que pueden pueden semejar semejar parásito parásito (Fig. Nº4).

INTESTINALES Y GENI GENITALES. TALES. PPráctica ráctica Nº1: Nº1: PROTOZOARIOS PROTOZOARIOS IN

Leucocitos: estas células n materia fecal,  generalmente se encuen ran asociadas a moco y se observan en diferentes enfermedades intes inales. Los polimorfonucleares p edominan en shigelosis; salmonelosis, excepto fiebre tifo tifoid idea ea,, coli coliti tiss invas invasiv ivaa p r E. coli  y colitis ulcera ulcerativ tiva; a; en esta esta últim últim existen también eosinófilos en menor proporción. Los mononucleares o macrófagos se encuentran en mayor proporción en fiebre tifoidea. Algunos macrófagos semejan trofozoitos trofozoitos de amiba amibass po tener pequeños seudópodos; se se id identifi an porque son  granulosos y por carecer de las cara caraccterí teríst stic icas as de movi ovili ad y morfología nuclear, qu que tienen la las am amibas. Eritro Eritrocit citos: os: se obse observa rva cuando hay Eritrocitos: hemorragias del colon, hemorroides y fisuras sangrantes, etc. Aparecen con abundan abundancia cia en el sínd síndrom rom disentérico. Restos alimenticios de o igen vegetal: los almidones almidones son frecuente frecuentes y se observan como gránulos de forma y tamaño irre irregu gula lare res. s. Son Son fác fácil ilm me te identificados, porque en las preparaciones con Lugol toman color rojo o azul violeta, según el  grado de digestión que hayan sufrido; los no digeridos son de c lor violeta. Las células y fibras ve veget les se ven, en ocasiones, fo formando re retículos en forma de panal panal y a vec veces es en en form form de espiral. Estos restos vegetales deben diferenciarse de for formas pa parásitarias y aun aun ue muchas veces no tienen importancia, pueden aparecer en sínd síndro rome mess de de mal malab abso sorc rcii n o asociarse a diarreas. Restos al alimenticios de de or origen animal: son principalmente grasas y fibras musculares. Las Las pri prime mera rass se se pre prese sent nt n en forma de  gotas de diferente tamaño, trasparentes o amarillas y las segundas omo rectángulos amarillosos con estrías tra sversales. Flora bacteriana: siempre está presente de manera normal. A v ces está muy aum aumentada, lo que no tiene importancia, por lo cual no debe repor arse. Abundantes bacilos cortos, delgados, con movimiento

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rápido en forma de tira uzón, pueden corresponder a Campyloba  ter , productor de diarrea en cuyo caso se r quiere de una coloración especial. Levaduras: pueden observarse en Levaduras: cond condic icio ione ness nor norma male les, s, pero aumentan notoriamen notoriamente te cuando cuando exist exist desequilibrio de la flora bacteriana, espe ialmente en la terapia con antibióticos. Son ovaladas, algunas veces con gemaci nes y de un tamaño aproximado de 2 a 4 micras. Sólo cuando estas blastoconidias se asocian a seudomicelios, se deben eportar como presencia de hongos. Células cristales: se Células de descamación pueden ver al examen co rológico y no tienen significado especial.

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TECNICAS DE CONCENTRACION DE DIAGNOSTI O COPROCOPRO-PARASITOL -PARASITOL GICO: Los Los méto método doss de conc concen entr trac acii n fecal tienen como objetivo reunir en un pequeño volumen los elementos parasitarios inicialme inicialmente nte desperso despersoss en una gran masa de heces. Se deben emplear en aso de que las formas formas evolut evolutiva ivass parasi parasitar tarii s sean escasas  y no se observen en un exa en al freco y exista una sospecha clí ica de una infección parasitaria. Los métodos de concentración son muy numerosos, pero ningu ninguno no de de ell ellos os pued puedee pon pon r en evidencia todos los parásitos que ha itan el tracto  gastrointestinal. Cada mét do tiene sus indicaciones precisas y la elección del método a implementar va a epender de los datos clínicos disponibles.

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centri centrifug fugado ado cambi cambiand and de agua y mezclando nuevamente. - Se mezcla el sedimento on 34ml de sulfato de zinc al 33% (densidad .180). - Se Se co completa co con el el su sulfato de zinc hasta lle llegar gar a 1 cm cm del del bor bor e del tubo y se centrifuga a 2.500 rpm urante un minuto, sin frenar la centrífuga. - Se coloca el tubo cuid dosamente en una  gradilla y se recoge el so renadante con un asa de plat platino ino o una una pipet pipet  y se lleva al porta objetos.

Los métod métodos os de conce concentr ntrac ació ió se dividen en dos grandes grupos: 1. Los métodos físicos: por flotación, sedimentación, o por afi idad acuosa, hidrofila, etc. a) Técnica de Faust o de flotación con sulfa ulfatto de de zinc: zi zinc: nc: es este es es un un método en el cual sulfato la materia fecal se diluye en un líquido de alta densidad y los arásitos, que proporcionalmente son más livianos, van a la su superficie. Pa Para es esta té téc ica se utiliza sulfato de zinc (ZnSO4) al 33%, con densidad 1.180. Para ara pr prepararl arlo se se aña añadden 3 1g de sulfato de zinc a un litro de agua tibia. Una vez disuelto el sulfato, se verifica con n densitómetro que la densidad sea 1.180; si es preciso se añad añadir iráá agu aguaa o sulf sulfat atoo de de zi c, según el caso, hasta obtener este valor. La técnica utilizada es la siguiente: - Una cantidad de materia fecal de apro aproxximad imadaament mentee 1g, 1g, se dil  ye en 10 ml de agua y se se filtra filtra a travé travé de una gasa cuádruple. - Se centr entrif ifug ugaa a 2.50 2.500 0 rpm durante un minuto. - Se descarta el líquido sobrenadante. Si la muestra es muy grasosa se repite el

Las preparaciones se montan en Lugol y soluci solución ón sali salina na y se se lleva llevan al microscopio para buscar formas parasitarias. Como los parásitos que flotan a la superficie de la solución vuelven a descender al cabo de una hora, se deben hacer las preparaciones en por porta-o ta-obbjet jetos, tan tan pr pro to como termine la co concentración. El El contacto prolongado con con el el sul sulfa fatto de de zinc inc, puede deformar los quistes y dificultar su ide tificación, por lo tant tantoo esta stas pre prepara paracciones deben ser exam examin inad adas as lo ante antess pos posib ible. Esta técnica es mejo mejorr par paraa det detec ecta tarr qui quisstes de protozoos que para huevos y larvas e helmintos.

El éxito depende de la exactitud en la densidad del sulfato de zinc. Cuando la materia fecal está fijada en formol al 5-

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10%, debe debe usar usarse se el sulf sulfat at de zinc con densidad de 1.200. b) Técnica de Willis Willis--Mollo con solución salura salurada da de cloru cloruro ro de sodi sodi (NaCl) : esta técn técnic icaa no no re requier uieree ce centr ntríf  ga y es útil, principalmente, para huevos de uncinarias, que flotan fácilmente; pero también sirve para los otros parásitos incluyendo los protozoarios. Se utiliza con mucha frecuencia en parasitología eterinaria, por la facili facilidad dad de de realiz realizars arsee e el campo. El procedimiento es como sigue : - Se disu disuelv elvee sal sal de coci cocina na e agua caliente, hasta hasta que que hay hayaa sat satur urac ació ión; la solución debe tener, como mínimo, una densidad de 1.200. - Se mezcla aproximadamente 1 g de materias fecales con 10-20 de la solución saturada. - Se traslada la mezcla a un ubo, probeta o caja de petri, que se llena on la solución hasta el borde, de modo que forme un menisco. - Se col coloc ocaa una una lam laminil inilla la sobre el menisco durante 10 o 15 minutos o se toma el sobr sobren enad adan ante te con con asa asa o pip pip ta capilar. - La laminilla o el material recolectado, se coloca en el porta- bjetos, para observarlo directamente o on Lugol.

Práctica Nº1: PROTOZOARIOS I TESTINALES Y GENI GENITALES. TALES.

- Mezcle el sedimento con la pequeña cantid cantidad ad de líqu líquido ido qu que baja por las paredes del tubo y haga preparaciones en fresc frescoo y con con Lug Lugol ol,, par paraa v r al microscopio.

c) Técnica simplificada de fo rmol rmol--éter: -éter: es el procedimiento mas utilizado para concentrar qu quistes de de proto oos, huevos y larvas de helmintos. El étodo es el siguiente: - Tom Tomee en en un un tub tuboo par parttes iguales de solución salina isotónica y ormol al 10% aproximadamente 10 ml. - Agregue más o menos 1 g e materia fecal  y mezcle bien. - Filtre por gasa doble. - Agregue Agregue 3 ml de éter, éter, tape tape, agite fuerte y destape cuidadosamente. cuidadosamente. - Ce Centr ntrifugue ugue 2 mi minutos a 2. 00 rpm. - Dec Decan ante te las las tre tress prim primer er s capas (éter, restos de materia fecal y el formol salino). (Fig. Nº5). - Con Con un un pal palil illo lo aflo afloje je de las paredes del tubo el anillo con restos de aterias fecales cuidadosamente decante las tres capas superiores.

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Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab Saúl Garc García. U.C.: Micro Microbi crobio crobiolog biolog ología. logía. Programa Prog Medi Medic Medici 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab ab th Saúl Sa úl García. arcía. U.C. U. C.:: Micr Mi crob obio iolo lo ía. ía. Pro Pr oogram rama ramaa Medici Me dici cii a UNEFM. 2009 

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MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA TURA DE Trichomona vagi nalis. alis.

Trofozoito: Es pirifor forme u ov ide, mide 10 a Trofozoito: 30 micra icrass de de lar larggo, pres presee ta membrana, citoplasma, y nú núcleo an ante ior grande y alargado con gránulos de cr matina finos y difusos, axostilo que se extiende del extremo anterior al posterior el cual rebasa, se observan c atro flagelos anteriores y un flagelo recurrente que forma forma la la memb membra rana na ond ondul ulan ante y no llega al extremo posterior.

DIBUJO TECNICAS DE DIA NOSTICO PARASITOLOGICO Las muestras a utilizar son secreciones vagina vaginale less y uret uretra rale les. s. Pa a la toma de la mues muesttra en las muje ujeres res d be emplearse un espé espécu culo lo esté estéri rill y seco seco ( o lubricado), la paciente paciente debe evitar evitar tod tod lavado vaginal, antes antes de realiz realizars arsee la tom de la muestra y en lo los hom hombres la la mi mis a se la toma el mis mismo pac paciiente ente haci hacieend se presión en el pene para obtener la secreción La muestra obtenida se coloca entre l mina y laminilla, con con so solució ución n sal saliina al 0,8 0,8 % en caso de ser necesario buscando T. aginalis   con sus movimientos típicos. Se pueden ut utilizar colorantes de contraste tales como rojo neutro y/o tinta china. MUESTRA MUESTRA DE ORINA ORINA: La muestra reco recome mend ndad adaa es es la la pri prime mera de la mañana a que existe mayor oncentración de trofozoitos. Se debe recolectar en un envase limpio y seco, tapar y llevarlo rápidamente al laboratorio. Proc Proced edim imie ient nto: o: la ori ori a se mezcla completamente y se pasan de 10 a 15 ml en un tubo ubo de centrífug fuga. Lu  go, se centrifuga de 10 a 15 minutos a 1000 r.p.m. Se descarta el sobrenadante  y se transfiere el sedime sedimento nto a una lám lámin in portaobjetos, la cual será será observada observada bajo bajo el microscopio con objetivo de 40X, buscando los trofozoitos de Trichomonas vaginalis  co  co sus movimientos  giratorios característicos. característicos. Cuando la movilidad del microorganismo comienza a disminuir, es posible observar la membrana ondulante.

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Práctica Nº 2: Leish  ania, SUS SUS  VECTORES  Y LAS LEI MANIO MANIOSIS SIS Los Los age agente ntes etiológ ológic icoos, pará itos del género Leishmania, son protozoarios que pertenecen a la familia Tr  panosomatidae (clase Mastigophora , orden Kinetoplastida)  al igual que los tripan somas poseen hospedadores vertebrados e invertebrados, pero pero difie difiere ren n de de ell ellos os porq porq e en su ciclo evolutivo só sólo ap aparecen fo for as amastigotas  y promastigotas. Se presenta bajo dos formas undamentales: (Fig (Fig Nº 6) 6) una afla aflagel gelad ad denominada amastigota, encontrada en los tejidos del amastigota hombre hombre y de de los los animale animales vertebrados, susceptibles a la inoculación del parásito y una forma flagelada o promastigota que se obse observ rvaa en en el el tub tuboo dig diges esti ti o del insecto vector y en lo los me medios ar artific ales de cultivo. Los Los ama amast stig igot otas as son son form form s parasitarias intr intrac acel elula ulare res, s, apar aparec ecie ien ndo a la microscop microscopía ía óptica óptica dentro dentro d las células del sistema fagocítico mono uclear como organi organism smos os ovoid ovoides es de pequeñas dimens dimension iones es µm por por 1, a 2,5 µm dependien dependiendo do de la especie especie.. S distinguen los siguientes elementos celulares: una membrana celular, cit plasma con diferentes organelos un núcleo y un kinetoplasto. El núcleo generalmente se halla adosado al margen e la célula o hacia uno de los polos. El kinet kinetopl oplast astoo es una re re fibrosa, que contiene el 20%, aproxi adamente del ADN total del parásito, presente en su mitocondria, formada por la unión del cuerpo parabasal y el blefaroplasto; el primero es mas grande y el segundo es puntiforme. Tiene forma b ciliforme o de bastoncito corto próximo l núcleo y a veces sumamente aplicado a éste. La forma flagelada o prom stigota es fácil de estudiar en material e cultivo de laboratorio, son formas parasitarias alarga alargadas das o fusi fusifor forme mess de 1 a 25 µm por 1,5 a 3,5 µm de ancho, con na extremidad anter anterio iorr más más grue gruesa sa de don don e sale un solo flagelo de unas 15 a 25 µm de largo y una extremidad posterior afilada. El citoplasma es abundantemente granular..

DIBUJO

DIBUJO

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Prác Prácti tica ca Nº2 Nº LEI LEISH SHM MANIA NI A, SU SUS VE V EECT CT Nº2 2:: LEIS LE ISHM HMA NIA, IA VEC T RES Y LAS LEISHMANIOSIS LEISHMANIOSIS

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Prác Prácti tica ca Nº2 Nº2:: LEI LEISH SHMA MANI NIA, A, SUS SUS VECT VECTO O ES Y LAS LEISHMANIOS LEISHMANIOSIS IS

MÉTODOS DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGI O 1. MÉTODOS DIRECTOS DIRECTOSS:: 1.1. Raspado: Raspado: En las lesiones cutáneas 1.1. iniciales sin contaminación bacteriana de Leis Leishm hman ania iasi siss cutá cutáne neaa (L ), es posible obte obtene nerr una una buen buenaa mues muestt a de aspecto  granular, con células del te jido, con muy poca sangre y en donde la coloración muestra con facilidad los a astigotes intra  y extracelulares. El método clásico consiste en hacer una incisi incisión ón en el el rebord rebordee de l úlcera, en la lesi lesión ón pap papul ular ar o nodu nodula lar, r, pa pa a luego raspar el tejido tejido y obtener obtener histioci histiocito to o macrófagos para parasi sita tado dos. s. La La abund abundan anccia de sangre indica que la muestra no es ideal y se enmascara o dificulta el diag óstico. Se conside considera ra qque ue la muestr muestra obtenida del centro de la úlcera, es poco eficiente para hacer un buen diagnóstico. 1.2. Impronta: Otro procedimiento, especialmente útil para recolectar material aséptico para los cultivos, revia limpieza del borde de la lesión, es una aspiración por punc punció ión n con con jeri jering ngaa y agu agu a delgada. En este método se inyecta 0.1 ó 0.2 ml de solución solución salina salina amortigua amortiguadd entrando por el borde borde y rotand rotandoo la aguj aguja varias veces para macerar el tejido i ternamente y desprender la las cé células qu que l ego se aspiran (Fig Nº 7). 7). Con el materi materiaal obtenido por cualquiera de los procedimi ntos, se hacen cultiv cultivos os o se se extie extiende nde en en un portaobjetos para hacer uno o dos ext ndidos de un cent centím ímet etro ro de diám diámet etro ro,, q e después de estar seco, se colorea con Gi msa, Wright u otro colorante para células s nguíneas. Se deben tomar 2 ó 3 pre araciones por pacien paciente te y en cada cada muestr muestr examinar un mini minim mo de de 100 100 camp ampos c n objetivo de 100X. Para el diagnóstico par sitológico de Leishmaniasis Viceral (LV), la muestra de elección se trata de punción esplénica y de médula ósea. Con el primer material obte obteni nido do se hac hacen en ext exten endi didd s para buscar formas amastigo amastigotes tes dentr dentroo d las células del sistema retículo- endotelial (segmentados,

macr macróf ófag agos os); ); la pre prese senc ncia de núcleo y kinetoplasto, es la característica morfológic morfológicaa que que distingu distingue los amastigotes de Leishmania de otros protozoarios u hongos de localización intracelular (Ej. Histplasma sp). En las biopsias de estos ó  ganos se pueden obse observ rvar ar nidos nidos de pará parási sittos intracelulares. En sangre periférica es raro encontrar amastigotes. Coloración de  iemsa: Procedimiento: - Colocar la preparación seca en posición horiz horizon onta tal, l, con con el exte extend ndii o hacia arriba. - Fijar el extendido con al ohol metílico por 1-2 minutos. - Bo Botar eell fi fijador y dejar secar la lámina en posición vertical. - colocar la lámina en posición horizontal y cubr cubriir con con la solu solucci n de Giemsa, preparando una gota de c lorante y 1 ml de Buffer (aproximadamente 3 ml por cada lámina). - Dejar actuar por 30 ó 45 minutos. - Botar el colorante sobra te. - Lavar con agua. - Dejar secar al aire en posición vertical o en estufa a 37ºC. - Observar la prep ración en el micros microscop copio io ópt óptico ico con objetivo de inmersión.

2. M TTOD TO ODO OS S IND INDIRE IREC CTO CT TOS: 2.1. Cultivo: Cultivo: son ade uados para el 2.1. crecimiento nto y multiplica ión del parásito. Los más usados son: el edio de Novoy, MacNeal y Nicole (NNN)  y el de Infusión de Hígado Hígado y Triptosa Triptosa (LIT), que son bifásico

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Prácti Práctica ca Nº2: Nº2: LEISHMANIA, LEISHM LEISHMAN ANIA, IA, SU SUSS V VECTO VEC ECTTOR OR S Y LAS LEISHMANIOSIS Práctica

 y líquido respectivamente. respectivamente. En la forma superf superfici icial al tie tienen nen poco poco valo valo , ya que no es fácil obtener material en ondiciones de asepsia, además cuando no ay parásitos al exam examen en dir direc ecto to,, los los cult cultiv iv s difícilmente son son muy muy útil útiles es en cier cierto toss cas casos. En la forma visceral, los más usados son el cultivo de la médula ósea (mielocultivo)  y de la sangre (hemo (hemocu cult ltiv ivo) o).. Estos Estos cult cultiv ivos se revisan periódicamente por unas 6 s manas. 2.2. Inoculación Inoculación de Animales Experiment Experimentales: ales: es de mayo mayo utilidad en la Experimentales: lei leishm shmania aniasi siss vic viceeral. ral. El ani al utilizado es el hámster (género (género Cricetus) Cricetus). En el caso de las formas formas superfici superficiales ales se prefiere la inoculación cutánea, en el ocico, cola y planta de las las patas (Fig. (Fig. Nº8). En la visceral, la vía vía intraper intraperitone itoneal al es es l utilizada. El método es demorado, pues la observación de los animales puede prolongarse por varios meses, sobre todo en las leishmanias superficiales. Los materiales noculados son: tri tritura turado doss de de pie piell en el c so de formas cutáneas (o mucosa enfe nfer a) y médula ósea ósea en la leis leishm hman ania iasi siss vis visce ceral. Tanto los cultivos, como la inoculación en animales sensibles, carecen de verdadero valor práctico, pues no pueden ser empleados como métodos de rutina.

2.3. - Xenodiagnóstico: diagnóstico: consiste en utilizar Xenodiagnóstico: vectores naturales (flebotominos) mantenidos en colonias en l laboratorio y libres de infección. Con ellos se hace picar a los los pac pacie ient ntes es sosp sospec echo hoss s u otros hospedadore hospedadoress vertebrados; vertebrados; si en la sangre ingerida existen formas arasitarias de Leishmania , se obtiene su multiplicación

dentro del tubo digestivo del flebotomino. Este método equivale un cultivo de leishmania en el intestino e los vectores. Se pref prefie iere ren n ninf ninfas as,, que que hay hay n tenido algunas semanas de ayuno y estén ávidas de alim alimen enta tars rse, e, par paraa favo favore recc r la ingestión de bue buena cant cantiidad de san sanggre. Cada insecto ingiere entre 0.05 y 0.3 l, según el estado evolutivo de la ninfa. Se olocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca boca libre libre,, cubier cubiertta con gasa; se utilizan 4 de es estas ca cajas s bre la piel de los ante antebr braz azos os o extr xtremi emida es de los otros vertebrados.

A través de la gasa, los in ectos efectúan la picadura y chupan san gre durante 20 minuto minutoss aproxi aproximad madame ament nte. Se debe tener en cuenta que la s sceptibilidad es dife difere rent ntee en las las dist distin intas especies de flebo fleboto tomi mino nos, s, por por lo lo cu cu l se recomienda uti utilizar el el tr transmisor na nat ral de la región, que en el caso caso de de Ven Venez ezue uela es el Lutzomyia longipalpis . Para au aumentar la la se sensibilidad del método, se re repite en en la la mi misma pe persona cada 10 ó 14 días, por 3 a 6 veces. Se prefiere emplear el xenodiagnóstico artificial, artificial, utilizand utilizandoo sangr sangr venosa citratada en bolsas bolsas de de látex, látex, a travé travé de las cuales los vectores pueden ingerirla. Después de 15 a 45 días de la succión de sangre, los vectores se examinan para buscar tripomastigotes o e imastigotes en el contenido intestinal. Generalmente, la lect lectur uraa del del xeno xenodi diag agnó nóst stiico se hace a los 30,60 y 90 días espués de la alimentación. Para la obtención del contenido de del tu tubo di digestivo, se hace un masaje abdominal nal a la ni fa, sin presionar,

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Práctica Práctica Nº2: LEISHMAN LEISHMANIA, IA, SUS VECTORE VECTORES Y LAS LEISHMANIOS LEISHMANIOSIS IS

o se se pro provo voca ca una una de de ecc ección al colocarla vert vertic ical alme ment nte, e, util utiliz izand andoo una pinza que apriete la parte media. T mbién puede macerarse macerarse el intestino intestino de lo vectores, con el objeto objeto de obtene obtenerr mayo mayor cantidad de material para estudio. Las eishmanias  se buscan microscópicamente y deben hacerse coloraciones nes para diferenciarlos de otros trip tripano anoso soma matí tíde deos os.. Se Se pue puede tratar de aumentar el número de parásitos en animales vertebrados susc ptibles, como ratónes o ratas, por inoculación del contenido intestinal o del m cerado. En los animales inoculados se exa ina la sangre, se hacen estudios histop tológicos y/o xenodiagnósticos.

lesiones. Por otro lado, se ha reportado un 10% 10% de de po positividad de la intradermorreacción de Montenegro en individuos de zonas endémicas sin antecedent antecedentes es de habe padecido la enferme enfermedad dad,, en cuyo cuyo cas cas estaría indicada una cuidadosa evaluación del paciente.

TECNICAS DE DIGANOSTICO INM IN M UNOL UN GI CO LECULAR INMU MUN NOL GICO GICO IC O Y  M LECULAR  1.1. INMUNOLOGICO: Intrader ntrade ntradermo rmorre morreacci rreacc acción ión ón de Montenegro: 1.1. IIntradermorre es un métod métodoo indire indirecto cto par par el diagnóstico de la leismaniosis y corresponde a una reacción de hipersensibilidad tardía. Consiste Consiste en la aplicación aplicación de un antígeno compuesto compuesto pos suspensió suspensión n d promastigotes procedentes de cultivos, el cual recibe el nombre de Leishmanina. stos parásitos fenolizados se aplican intrad rmicamente al paciente en la cara interna el antebrazo y entre entre 48 48 y 72 hora horass se hac hac la lectura. Es posi positi tiva va si si se pal palpa pa un un nódu nódulo inflamatorio de 5 mm o más, semejante al observado con la tuberculina. Es una prueba de valor di  gnóstico, muy útil en los casos no recientes de infección de las leishmaniasis cutánea o cutáneamuco mucosa sa,, prec precis isam amen ente te cuan cuando el hallazgo de parásitos en las lesiones o es fácil. Una reacción po positiva, en en un un pa paciente con lesión cutánea o mucosa activa y s spechosa de la enfermedad, procedente de ona endémica es suficien suficiente te para para conside considera ra el caso como leishmaniasis y proceder l tratamiento específico, sin embrago, esta prueba por si sola, no es indicativo de n diagnóstico defin definit itiv ivo. o. Pero Pero,, la reac reacci ci n permanece posi posittiva iva des despu pués és de la curac urac ón clínica y se cree cree que duran durante te toda toda la vid vida del paciente, por eso eso su valor valor dism disminu inuyy en casos sin

1.2. Métodos Métodos serológicos: se han utilizado dife diferrente entess téc técnic nicas p ra el estudio serológico de las leishmaniosis. La prueba de inmunofluorescencia i directa (IFI) es la más más em emple pleada, ada, pero pero tamb amb én se hacen otras como la pruebas de ELISA, la hemagl hemagluti utinac nación ión indire indirect ct , la aglutinación directa, diferentes pruebas de precipitación, incluyendo variantes e electroforesis, redi redioi oinm nmun unoe oens nsay ayo, o, et . Aunque se detectan anticuerpos circ lantes, los títulos son muy bajos. La in unofluorescencia tiene poco valor en el diagnóstico de las formas cutáneas de lei hmaniosis, tiene mayor importancia en la leishmaniosis mucocutánea. Los títulos arían entre 1:16 1: 1024, pero existe eacción cruzada entre las infecciones e las distintas especies de Leishmania  on Tripanosoma , que también es un Kin  toplastida   y un, Tripanosomatido . En algunas infecciones acti activa vass no se logr lograa det detec ectt r anticuerpos. El uso de las pruebas serológicas es complementar el diagnóstico, espe especi cial alme ment ntee cuan cuando do hay metástasis a mucosas, para evaluar la infección latente, en las recaídas y en las infecciones crónicas.

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Práctica Nº2: LEISHMANIA, LEISHMANIA, SUS VECTORES VECTORES YY LAS LEISHMANIOSIS

1.3. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia indirecta y la prueba de ELISA : detectan la presencia de anticuerpos circulantes. También se han utilizado otras reacciones como la fijación de complemento y la aglutinación directa. Todos estos procedimientos ayudan, especialmente en los casos iniciales. Existe hipergammaglobulinemia la cual se demuestra por electroforesis de proteínas; las gammaglobulinas están elevadas con disminución de la albúmina. 1.4. Formol Formol gelificación: es una prueba inespecífica pero con utilidad para el diagnóstico de leishmaniasis vicerales. Consiste en la opacificación y coagulación del suero, cuando se le añade 1 a 2 goras de formol comercial (40%). Se acepta que la inversión en la relación albúmina/globulina y, según algunos autores la aparición de globulinas anómalas, sean las causas de una reacción positiva. Se toma el tiempo hasta la aparición de opacidad y coagulación. Sólo se da valor a las alteraciones ocurridas durante la primera hora. La prueba es inespecífica, pues varias enfermedades pueden ocasionar las alteraciones proteicas en el suero. En lo que respecta a Kalazar, difícilmente es negativa después de 3 meses de enfermedad y una reacción intensa antes de 10 minutos, es muy probable que sea por dicha enfermedad. Criterio de valorización: - =negativa, suero no alterado. a lterado. +=dudosa, coagulación sin ipacificación ++=positiva, coagulación y opacificación discreta. +++=positivo fuerte, coagulación con opacificación acentuada no total.

enfermedad cede. Tiene como inconveniente la inespecificidad, pudiendo ser positiva (cuando se usa antígeno heterólogo), en TBC, lepra, Chagas crónico  y leishmaniasis tegumentaria tegumentaria a títulos bajos. 2. Diagnóstico Molecular: 2.1. PCR: utilizando los métodos de la biología molecular es posible aplicar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR  PCR) PCR  para amplificar segmentos específicos de ADN de los parásitos e identificar su presencia en una muestra. Esta técnica tiene  gran valor en tejidos en donde no ha sido posible detectar parásitos, especialmente en lesiones de mucosas y para comprobar la infección en los flebotominos. Si se practica una biopsia, el tejido puede examinarse histológicamente, lo cual va a permitir el estudio anatomopatológico. Recientemente han sido usadas técnicas sofisticadas para detección de amastigotas “in utilizando anticuerpos situ” , monoclonales para evidenciar los amastigotes, mediante pruebas inmunocitoquímicas. Además, se ha utilizado la amplificación del kDNA mediante la reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), no solo para el diagnóstico sino también con fines taxonómicos, caracterizando los parásitos en los tejidos.

1.4. Reacción de fijación de complemento (RFC): esta reacción puede hacerse con antígeno homólogo (L. chagasi  de  de cultivo) o antígeno heterólogo de bacilos ácidoalcohol resistentes ( M. tuberculosis  y M. butiricum ), ), los cuales se han demostrado más útiles. Es altamente sesible (más del 90%) y en Kalazar se hace positiva a las 3 ó 4 semanas de comenzada la infección. Por otro lado, tiene valor como criterio de curación, ya que se hace negativa cuando la

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MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA TURA DE FLEBOTOMIN S  p .) (Lutzomyia Lutzomyia sp 

Los Los fleb flebot otom omin inos os son son ins insec ectt s nematóceros (antenas largas) que se caracterizan prim primor ordi dial alme ment ntee por pres presen enttar las hembras hábi hábito toss hema hemato tofá fági gico coss y que se mueven dand dandoo peq peque ueño ñoss sal salttos, y de de de el punto de vista morfológic morfológicoo por por se de tamaño pequ pequeñ eñoo (1(1-4 4 mm mm), con con ante antenas largas, alas pilosas, erectas hacia arriba  y hacia atrás y poseen un radio con 5 ra as. Sus piezas bucale bucaless son son larga largass y se encuentran adaptadas a la hematofagia, proceso hecho por la las he hembras, la las cu cu les tienen 2 espermatecas; sus palpos axilares están formados por 5 segmentos. Así mismo, se puede mencionar dentro de los rasgos biológicos más resaltantes de los vectores de que son insectos Leishmania, holometábolos, con un tipo de desarrollo completo en que los estadios inmaduros son diferentes a los adultos. El ciclo vital comprende huevos aguzados, 4 estadios estadios larvale larvaless de hábito hábito terrestres que se alimentan de materia or ánica y púpas sésiles, alimentándose los machos de azúcares de las plantas, necesitando las hembras además de sangre éstos últimos nutrientes, cuya actividad picadora es  generalmente en horas c epusculares y nocturnas. Es interesante encionar, que exis existe ten n espe especi cies es fleb flebot otom omii nas que son autógenas e inclusive parten  géticas.

Fig. Nº12: Lutzomyia sp. Holótipo macho– macho 1:gen 1:genitá itália lia (x40 (x400) 0).2 .2:b :bom omba y ductos eyaculad eyaculadores ores(x40 (x400). 0). 3: palp palp (x400). 4: antena (3ºsegme gmento nto) (x (x400). 0). 5: 5: an an ena (5º segmento) (x400). 6: 6: ala ala (x1 (x100). M m. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol 82(3): 395-398  jul./set. 1987

Adulto Macho de L tzomyia sp.

– H lótipo hembra  – Fig. Nº13: Lutzomyia sp. –  –  – 7: cibário (x400). 8: palpo (x400). 9: antena (3ºsegme gmento nto) (x (x400). 10 10: an antena (5º segmento) (x40 (x400) 0).1 .11: 1:es espe perm rmat atec eca( a(x4 x40 0 ). 12: espermateca (x600). 13 13: ala ala (x1 (x100). Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol 82(3): 395-398  jul./set. 1987

Adulto Macho de L tzomyia sp. 27

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Práctica Nº2: LEISHMANIA, SUS VECTORES Y LAS LEISHMANIOSIS LEISHMANIOSIS

TECNICAS DE CAPTURA DE FLEBOTOMINOS

carpetas ad hoc   para su transporte al laboratorio.

Se realizan capturas diurnas y nocturnas de flebotominos adultos en refugios naturales (huecos de árboles, rocas, madrigueras de animales, etc), en domicilios humanos y sus alrededores (peridomicilio), abarcando, asimismo, áreas de cultivo. Se emplean diferentes métodos de captura: trampa lumínica de Shannon, papel aceitado, aspiración directa, cebo humano, trampa lumínica CDC (Communicable Disease Center) y la trampa de Disney.

- La trampa CDC está compuesta por un tubo acrílico, en cuyo interior se encuentra centrado un motor pequeño de 6 voltios para hacer girar una hélice pequeña de plástico acoplada en su parte inferior. Por la parte de arriba del motor, se encuentra acoplado un pequeño bombillo. El funcionamiento tanto del motor y del bombillo, se hace mediante batería de 6 voltios. En la región superior de la trampa se coloca un techo acrílico, que sirve de protección contra la lluvia y para reflejar la luz del foco; y en la parte inferior de la CDC, se acopla una malla de tul para caprurar los fleborominos, los cuales fueron atraídos por la luz y se succionaron por el flujo de aire generado por la hélice.

- La trampa lumínica de Shannon emplea una estructura rectangular (1,40cm x 1,40cm x 1,10cm) construida de tela blanca de sábana, la cual se puede suspender con cuerdas a árboles. En el interior de la misma, se coloca una lámpara de luz fluorescente con baterías internas sobre dos soportes. Los insectos atraídos, ya sea a los colectores o hacia la fuente lumínica, se posan sobre la sábana y se succionan con aspiradores de boca. - Para el empleo del método de cebo humano, las hembras flebotominas atraídas sobre los colectores se aspiran con los capturadores de vidrio. - El método de aspiración directa consiste en realizar capturas manuales; los insectos se capturan con capturadores o aspiradores de boca, construidos a partir de tubos rígidos de vidrio o plástico y un tubo de  goma o látex flexible. Los insectos se colectan en huecos de árboles, cuevas de animales, paredes de viviendas, gallineros, etc. - Las trampas adhesivas denominadas papel aceitado (sticky paper) , se preparan con hojas de papel bond (28 x 22 cm) que se impregnan con aceite de ricino, las cuales se sujetan mediante tachuelas en los sitios donde se sospecha existen flebotominos (Ej: huecos de árboles, refugios de anamales, paredes de viviendas humanas, gallineros). Al cabo de 1-2 días, los papeles aceitados se retiran, y se colocan cuidadosamente en

- Para la trampa de Disney, se colocan pequeños roedores (Ej: ratones albinos, hámsteres) como cebos atrayentes dentro de una jaula pequeña (16,5cm x 18 cm x 18 cm), la cual se coloca sobre una bandeja metálica (47cm x 47cm) y se sujetaron mediante cable o alambre a un árbol. Sobre la superficie de la bandeja se exparció aceite de ricino, de manera tal de atrapar los flebotominos que eran atraídos hacia los roedores. Al igual que con la técnica del papel aceitado, al cabo de 1-2 días las bandejas deben ser transportadas al laboratorio. Los flebotominos capturados con las técnicas de papel aceitado y de Disney, deben ser retirados cuidadosamente con agujas entomológicas. entomológicas. Aquellos insectos capturados con las restantes técnicas, se transportan al laboratorio en cavas de anime con alta humedad, sacrificándose con vapores de cloroformo. En cuanto al montaje, todos los insectos se clarifican en solución de Nesbitt a temperatura ambiente durante 24 horas y deben ser montados sobre láminas portaobjetos en líquido de Berlese.

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PRACTICA Nº3: Tryp  nosoma , SUS VECTORES Y LAS TRIPA OSOMOSIS MERICANA Y RANGELIANA. Trypanosoma Tripomast Tripomastigote igote Sanguícola Sanguícola d Trypanosoma  cruzi: Esta forma flagelada de T. cruzi  se encu encuen entr traa en sang sangre re per perif ifér érii a de humanos o animales infectados (hospedadores vertebrados). Es alargado, usiforme y su tama tamaño ño alre alrede dedo dorr de 20 mic as de longitud. Pose Poseee un un núc núclleo gran grande de ce ca de la parte central, y a lo la largo de su cu cuerpo tiene una membrana ondulante bor eada por un flagelo, que se inicia en el inetoplasto, el cual cual es pos post-nuc -nucle lear ar y gru grueso y sale del pará parási sitto por por el ex extre tremo ante nte ior (Fig. Nº 14  y 15).

Nidos de Amastigotes tisulares: El tripom tripomast astigo igote te sanguí sanguícol col , en el huésped vertebrado, tiene predilección por los macrófagos, células del sistema retículoendotelial, tejido c rdíaco, muscular est estriad riado, o, musc uscular ular liso y menos frecuentemente por tejido nervioso. Dentro de estas células el tripoma tigote sanguícola se transforma en amast gote, el cual se caracteriza por ser redon eado u oval, con kinetoplasto an ante-nu lear. Miden aproxi aproximad madame amente nte de 1. a 4 micras de diámetro. No poseen flagelo libre. Los amasti amastigot gotas as se se aglom aglomera eran dentro de las células formando nidos tisulares, similares en su morfología, a las formas amastigotas del género Leishmania (Fi . Nº 16).

DIBUJO

DIBUJO

Dent Dentro ro de su cicl cicloo celu celull r, los vectores se infe infect ctan an al chup hupar la san san re del hombre o huésped huéspedes es verte vertebra brados dos co con tripomastigotes sangu sanguíc ícol olas as prov proven enie ient nt s de sangre periférica. Estas formas sufren transformaciones a lo largo del tubo digestivo del ve tor. estudios experimentales han per itido dividir su evolución en tres fases: fo mas redondeadas

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Práctica Nº3: Trypanosoma , SUS VECTORES VECTORES Y

LAS LAS TRIPANOSOM TRI PANOSOMOSIS OSIS AMERIC AN Y RANGELIANA. TRIPANOSOMO SIS AMERICAN AMERICAN

en el estómago, denominadas esferomastigotes; epi epimasti otes en el intest intestino ino medi medio, o, que que s multiplican intens intensame amente nte por por divis divisió ión binaria y tripom tripomast astigo igotes tes metací metacícli clico cos, infectantes para el huésped hu ésped vertebrado. TECNICAS DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGI O El diagnóstico diferencial de la enfermedad de chag chagas as varí varíaa de de acu acueer o a la forma clínica clínica en que se encuen encuentre tre el paciente.

2- Tom Tomar otro otro por portaob taobjjetos que sirve de disper dispersor sor y apoyar apoyarlo lo sobr sobr la superficie del primer portaobjetos, con na inclinación de 30 grados por delante de la gota de sangre, deslizarlo hacia la gota para que éste se extienda por el borde. 3- Deslizar Deslizar el el portaobje portaobjeto tos dispersor hacia el extremo opuesto para que la sangre se extienda y forme una pe pelí ula delgada. 4- Dejar secar y aplicar la coloración de Giemsa. 5- Observar en el micros opio con objetivo de inmersión (100X).

METODOS PARASITOLOGI METO ME METOD TODOS OS PARASITOLOGIC PAR PA PARAS ARASIT ASITOL ITOLOG OLOGIC OGIC ICOS DIRECTOS: Estos procedimientos son de utilidad en los perí períod odos os de para parasi site temi mia, a, co o sucede en la fase aguda de de la infección, pero los resultados negativos no son excluyentes. Exam Examen en en fresco: fres fresco co:: tie tie e por objeto 1. Examen visualizar el tripomastigote sanguícola en una una got gota de sang sangre re en re lámina y laminil nilla. En la fase ag da se puede encont encontrar rar el el parási parásito to hasta hasta e un 90%. Procedimiento: - Col Coloc ocar ar una gota gota de sang sang e en el centro de una lámina portaobjetos. - Cubrir con una laminilla c breobjetos. - Obse Observ rvar ar en en el mic micro rosc scop op o con objetivo seca de mayor aumento. Esta Esta técn técnic icaa perm permit itee evid eviden encc ar la presencia de parásitos vivos provistos de movilidad, pero no proporcio proporciona na detalle detalles morfológicos que garanticen la identificación de la especie observada. 2. Extendido coloreado: se utilizan preferentemente para el estudio morf morfol ológ ógic icoo del del pará parási sito to,, pe o la detección del parásito por esta técnica sólo es posible cuando se encuentra en n mero elevado. Tiene la ventaja de que hay oca distorsión de las es estructuras pa parasit rias, pero la desventaja es que debe exa inarse muchos campos microscópicos para evidenciar al parásito. Preparación de un extendido:: 1- Colocar una una gota pe pequ ña de sangre cerca del extremo de un portaobjetos, limpio y desgrasado.

- Gota Gota ggruesa: ruesa: tiene la ve taja de aumentar la probabilidad de det ctar las formas evolutivas evolutivas de los parásitos parásitos, pero distorsiona su morfología. Procedimiento: 1- Colocar una gota g ande o 3 gotas pequeñ pequeñas as de sangr sangree sobr sobr un portaobjetos limpio y desgrasado. 2- Con Con el el ángul ánguloo de otro portaobjetos se extiende la sangre de anera uniforme, forma formand ndoo un un cír círcu culo lo de 1.5 cms, con el fin de desfibrinar la muestra. 3- Dejar secar por 12 hor s. - Colocar el portaobjetos n agua destilada para su hemólisis. h emólisis. 4- Dejar secar. 5- Color Colorear ear con con Giem Giemssa sin fijar con alcohol metílico. 6- Lavar con agua cuidad samente. 7- Dejar secar al aire o en estufa a 37ºC. 8- Observar en el micros opio con objetivo de inmersión.

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SUS VECT VECTOR ORES ES Y LAS LAS TRI TR IIPAN PANO PA NOS SOMOS OMOSIS IS A MERI ERI Práctica Nº3: Trypanoso  a  a,  SUS TRIP ANOS OSOM AMER AM

METODOS PAR SITOLOGICOS INDIRECTOS: Estos mé métod s tienen por INDIRECTOS: Es obje objeto to mult multip ipli lica carr la la can canti tidd d de parásitos en el laboratorio, a partir de diferentes muestras del paciente (hospedadores vertebrados) y son más se sibles que los métodos di directos; si sin em emb rgo, tienen el inconveniente de que los resultados se demoran varias semanas. e utilizan con más fre frecuenc uenciia en la la fa fase crónica en la cual la parasitemia es mas baja. 1. Ino Inocu cula laci cion ones es e animales experimentales: lo los an anim les utilizados experimentales: deben proceder de colonias protegidas de infecciones naturales por tri anosomas. Los principales animales de e perimentación util utiliz izad ados os en el labo labora rato tori rioo s n los ratones y ratas. A éstos se le inyecta 0.5 a 1 ml de sangre venosa venosa citrat citratada ada de la capa de células blancas después de centrifugar, o del material proceden te de los xenodiagnós xenodiagnóstico ticos, s, bien sea el contenido de las deyecciones o el ma erado de los vectores. vectores. La inocul inoculación ación se debe hacer intraperitoneal, subcutánea a través de la conjuntiva. Después de 3 a días se inicia el estudio de la parasit mia, el cual cont contiinúa núa has hasta la la sext sextaa sem sem na después de la inoculación inicial. La b squeda de los tripomastigotes sanguícolas se hace de la misma misma manera manera descrita descrita par los exámenes en fresco fresco coloreado coloreados. s. Est Este método de diagnóstico no es de gran s nsibilidad y se rec recurre urre a ééll cua cuand ndoo se se qui qui re diferenciar las especies de tripanosomas visualizadas en las deyecciones de los vectores. La impo import rtanc ancia ia mayo mayorr del del méto método radica en el estudio de virulencia de las cepas de Trypanosoma.

2. - Xenodiagnóstico: Xeno Xenodi diag agnó nóst stic ico: o: cons consiiste en utilizar vectores naturales (triatominos), mantenidos en colonias en l laboratorio y limpios de infección. Con ellos se hace

ANA Y RANGELIANA.

picar a los pacientes sospechosos u otros hospedadore hospedadoress vertebrado vertebradoss; si en la sangre ingerida existen formas parasitarias de Tripanosoma sp , se obtiene su multiplicación dentro del tubo digestivo del Triatomino. Se debe tener en cuenta que la suscep susceptib tibili ilidad dad es difere diferen n e en las distintas especies de triatomíneos, por lo cual se recomienda utilizar el transmisor natural de la la regió región, n, que que en en el cas cas de Venezuela es el Rhodnius prolixus . Los tripanosomas se buscan microscópicamente y deben hacerse coloraciones para diferenciarlos de T. rangeli  o  o de otros tripanos matídeos. METODOS DE DIA NOSTICO INMUNOLO ICO 1. Proc Proce eedi dimi diimie ntos nttos sero se lógi giicos: los diferentes oced mien mieent serol erroló ológ ógi procedimie procedimientos ntos serológ serológico icos que detectan la presencia de anticuerpos, indican indirectamente la existe cia, presente o pasada, del parásito en el organismo. Estas pruebas se utilizan especialmente en las etapas latente y crónica de la infección, cuando es difíci difícill encontra encontra los parásitos. Los Los an antígenos se se prepa an de parásitos completos o de fracciones antigénicas. Con éstos se han desarrollado na gran variedad de reacci reacciones. ones. Los título títulos de anticuerpos varían ampliamente, de acuerdo al tipo de antígeno, purificación de ste, especificidad sens sensiibil bilida idad de de la la re reacc acci n; estos títulos no  guardan relación con la presencia o  gravedad de las manifesta iones clínicas, ni con la extensión de las lesiones. En la fase aguda se se detectan an anticu rpos IgM contra son reemplazados T. cruzi   que prog progre resi siva vame ment ntee por por los los  gG I a medida que prog progrresa esa la la enf enfeerme rmedad. dad. S lo en infecciones inf ecciones recien recientes tes se encue encuentr ntr reducción o neg negativización de los tít los después del tratamiento con drogas tri anocidas. 2. Reacción de fijación el compl complemento emento (RFC): tambi también én llama llamadda reacción de (RFC): Machado Guerreiro. La reacción consta de dos istemas: 1. consta de cantidades exactas de suero del paciente, el antígeno y el complemento (de

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Realizado Realiz aliz liizad zado ado or: eth Saúl Saúl arcía. arcía. U.C  U.C. U.C.:.: Mi Micro crob crobio obio biolo iolo loo ía. ía. Pro Pr Pro  Pro  o rama ra rama ma Medi Me edici dici ici cina UNEFM. 2009  2009 Real Re or or: Lic Li Licc Yotsa  Yots Yo Yotsab tsab abeth .: Micr Mic Micro robi biol olo ro Medic ed

Práctica Nº3: Trypanosoma , SUS VECTORES Y LAS TRIPANOSOMOSIS AMERICANA Y RANGELIANA.

cobayo), los dos últimos son dosificados y diluidos de acuerdo con su título. 2. se añade el sistema hemolítico, formado por un antígeno (glóbulos rojos de carnero) más su anticuerpo específico o hemolisina (sueros de conejo inmunizado con glóbulos rojos de carnero). Si el antígeno reacciona con su anticuerpo específico (del paciente), el complemento se fija sobre el complejo antígeno-anticuerpo formado, así como también en la reacción del 2º sistema. Cuando el complemento se fija en este primer sistema, no ocurre nada visible en la reacción, pero si se fija en el segundo sistema, entonces ocurre la destrucción de los glóbulos rojos, es decir se produce una hemólisis. El segundo sistema actúa como un indicador de la fijación o no del complemento, en la reacción no visible entre un antígeno y su anticuerpo. En consecuencia, en la reacción negativa hay hemólisis porque el complemento no fue usado en el primer sistema y en la positiva no hay hemólisis porque no hay complemento, ya que fue empleado en el primer sistema, es decir, en la reacción específica entre el antígeno de T. cruzi  y  y los anticuerpos del suero del paciente. 3. Hemaglutinación indirecta: esta reacción es más sensible que la fijación del complemento. Esta técnica se fundamenta en la adherencia de antígenos específicos sobre la superficie de glóbulos rojos, que luego se aglutinaran al producirse la reacción entre el antígeno y el anticuerpo homologo existente en el suero del paciente. Para facilitar la adherencia del antígeno a la superficie de los glóbulos rojos, estos son tratados previamente con acido tánico. 4. Prueba de ELISA: Utiliza como antígenos extractos del parasito o sus fracciones, absorbidas en microplatos. Es una prueba muy sensible para detectar anticuerpos IgG o IgM, de especial utilidad para bancos de sangre. Las pruebas de ELISA positivas se confirman con la Inmunofluorescencia Indirecta.

5. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): En esta técnica los epimastigotes fijados con formol son antígenos estables y con ellos es posible diferenciar anticuerpos IgM e IgG. En algunas ocasiones muestra reacciones cruzadas con infecciones por otros protozoarios como los del genero Leishmania ; esa inespecificidad se acentúa en los títulos bajos. La prueba esta indicada para estudio de recién nacidos con posible infección congénita, por la posibilidad de detectar tanto anticuerpos IgG como IgM, para diferenciar transmisión pasiva de anticuerpos, de infección intrauterina. La IFI se usa como prueba confirmatoria de infección con T. cruzi cuando la prueba de ELISA o hemaglutinación esta positiva, especialmente en los estudios de bancos de sangre. DIAGNOSTICO DIAGNOSTICO MOLECULAR MOLECULAR  Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): consiste en utilizar sondas de ADN capaces de reconocer, por hibridación molecular, secuencias de nucleótidos especificas del ADN nuclear o del Kinetoplasto de T. cruzi  , , que estén presentes en el suero u orina de pacientes. El resultado se observa al revelar el marcador que lleva la sonda de ADN. MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA DE LOS TRIATOMINOS Rhodnius prolixus a. Adultos: tamaño aproximado de 20 mm. Color general pardo=amarillento con manchas marrón oscuro en varias regiones del cuerpo. Cabeza: alargada hacia adelante ¿cabeza prognata?, ojos compuestos predominantes  y multifacetados. Por delante de los ojos compuestos se extiende la región anteocular; en esta región se implanta un par de tuberculos anteniferos, que sirven de base de sustentación a las antenas. Los tuberculos anteniferos se encuentran situados en estos insectos cerca de la

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Realizado Realizado or: Lic Yotsabeth Yotsa Yotsabeth beth Saúl arcía. U.C.: U.C.: Microbiol Mic Micro robiolo bioloo ía. Pro Medicina UNEFM. UNEFM. 2009  2009 Microbiolo Pro  rama Medicina

MICROBILOGIA I

Práctica Nº Nº4 4: 4: Plasmodium,

extremidad anterior de la región ant anteoc eocular ular,, lo cual cual cara caraccte iza el genero Rhodnius. Las antenas son siempre muy visibles visibles y están formada formada por cuatro segmentos de los cuales el primero es muy corto. La proboscide es recta y esta inte integr grad adaa por por tres tres segm segmen enttos. Cuando el inse inseccto no est esta ali alimentá entánd nd se, permanece flexio flexionad nadaa por deba debajo jo de l cabeza y su extr extrem emid idad ad desc descan ansa sa en u a ranura del torax ¿surco estridulatorio? En medio del primer par de patas. Por de rás de los ojos compuestos¿region post cular?, se observan los ojos simples  ¿ocelos?. Esta región se une al torax por un cuello. Tora Torax: x: vist vistoo por por la cara cara dors dors l, solamente se Torax: observa el pronoto ya que el mesonoto y metanoto están ocultos por las alas plegadas. El pronoto es ap oximadamente trapezoidal, con los an ulos posterolaterales proyectándose de anera que le dan al “chipo” el aspec to de poseer hombros. En la superficie el pronoto se ven unas saliencias denom nadas carenas long longit itud udin inal ales es.. Inme Inmedi diat atam ameente detrás del pron pronot otoo est estaa un un par par de al s ¿solo el par anterior es normalmente visible?, plegadas encima del abdomen y cubriéndolo excepto en sus bordes laterales. Este primer par de alas es conocido como hemielitros ya que tienen tienen una porción porción basa basal dura, muy quitinezada, llamada corion,  y otra porción distal membranos nosa o membrana. Debajo de los hemialitros, que se implantan en el meso mesotó tóra rax, x, exis existe te un segu segun n o par de alas enterament enteramentee membranos membranosas as. Del borde posterior del pronoto sale na estructura triangular ¿el escutelo?, que se sitúa en

SUS VECTORES Y LAS

ALARIAS HUMANAS HUMANAS..

medio de las las bases bases de de lo hemielitros. Por ultim ultimo, o, del del tóra tóraxx sale salen n tr s pares de patas delgad delgadas as term termina inadas das en en u par de uñas. Abdo Abdom men: es de for forma oval y sus bordes Abdomen: laterales aplanados presentan dibujos uti utilizados para su clasific ficación. Estos bordes reciben el nombre de conexivo. En la hemb hembra ra el extr extrem emoo post poster erior del conexivo se interrum interrumpe, pe, dejand dejandoo ver el ovipositor, en cambio en el macho el conexivo no es interrumpido (Fig. Nº 19). b. Ninfas: Ninfas: en líneas ge erales, podemos b. decir decir que que las las ninfa ninfass tiene tiene una morfología muy parecida a la e los adultos, diferenciandose de ellos principalmente, por ser de menor tamaño  y carecer de alas. En la ninfa de IV estadio comienzan a ser vist vistos os los los rudi rudime ment ntos os ala alares de los cuales presentan un mayor de arrollo en el V estadio. coloración general oscura con manchas am rillentas o color naran a pálido en div rsas partes del cuerpo. La La mo morfología ge general es semejante a la ya descrita para el  prolixus   , pero debe observarse que los tubérculos anteniferos se sitúan en la parte media de la región región anteocular, anteocular, lo cual es característico para todos los ejemplares pertenecientes al  género Triatoma (Fig. Nº2 -a y 20-b). Triatoma

maculata:

Panstrogylus geniculatus: ejemplares más

 grandes que los anteriores  ¿aproximadamente 25=3 mm de largo?. Coloración general am rillo claro con manchas negras en diversas partes del

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Real Realiz izad adoo or: or: Lic Lic Yots Yotsab abeth eth Saúl Saúl arcía. arcía. U.C. U.C.:: Micr Microb obio iolo lo ía. ía. Pro Pro rama rama Medi Medici ci a UNEFM. 2009  2009

cuer cuerpo po.. Obs Obsér érve vese se que que los tubérculos ant anteniferos es están mu muy pr próximos a los ojos compuestos, lo cual es car cterístico para todos los ejemplares del genero Panstrongylus. La especie P geniculatus pued puedee ser ser re reco cono noci cida da por porqq e además del color amarillo amarillo claro, claro, presen presentt sobre la parte media de del pr pronot noto una una mancha negra que semeja un trébol de cuatro hojas y en el borde posterior de dicho pr noto, hay una franja transversal negra de argen anterior ondulado.

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Real Realiz izad adoo oor: orr: L Lic Liic Y Yots Yoottsab saabbeth eth Saúl Saúl arcía arc ía.. U.C. U. C.:: Micr Mi crob obio iolo lo ía. ía. Pro Pr o rama ra Me 2009 Realizado arcía. U.C.: Microbiolo Micro biolo Pro  rama ma Medi Medici dici cina UNEFM. 2009 

PRACTICA Nº4: Plasmodium, SUS VECTORES Y LAS MALARIAS HUMANAS. que contiene pigmento malárico. La cromatina se presenta como una masa única, algunas veces difusa, según el sexo del gametocito. Estos son redondeados, con excepción de P. falciparum   que tiene forma alargada o de media luna. TECNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLOGICO

Diferentes especies de Plasmodium parasitan a diversos animales y cuatro (4) especies al humano. Las 2 especies principales que lo parasitan son P. vivax y P. falciparum . Morfológicamente pueden diferenciarse las 4 especies de Plasmodium cuando se observan preparaciones coloreadas. En sangre periférica se deben diferenciar tres formas parasitarias: a- Trofozoito: consta de dos partes, citoplasma que se colorea de azul y núcleo o cromatina, de color color rojo. El citoplasma en los parásitos jóvenes tiene forma de anillo y en los adultos es ameboide o en banda, según la especie de Plasmodium . El espacio sin teñir en el anillo contiene la vacuola digestiva que no toma los colorantes. La cromatina siempre es una masa única compacta. El eritrocito parasitado puede sufrir deformaciones y presentar granulaciones rosadas, que en la especies P. viv ax se denominada de Schüffner; en P. falciparum   se llaman de Maurer. b- Esquizontes: presentan 2 ó más masas de cromatina, según el grado de maduración. Cada masa de cromatina está rodeada de citoplasma. Los esquizontes maduros al terminar de dividir su cromatina están constituidos por un acúmulo de merozoítos, a veces en forma de roseta y con el pigmento malárico de color café en la parte central del parásito. Según la especie de Plasmodium , los eritrocitos parasitados presentan forma y tamaño y presencia o ausencia de gránulos (Fig. Nº 21). c- Gametocitos: ocupan casi todo el eritrocito o pueden estar libres. Constan de un citoplasma voluminoso de color azul

El método más práctico para un diagnóstico definitivo del paludismo, es la demostración del Plasmodium  en  en la sangre del paciente. 1- El examen de la sangre se realiza habitualmente en extendido y/o gota  gruesa,  gruesa ambos teñidos con Giemsa. El extendido permite estudiar el parásito dentro de los glóbulos rojos y establecer el diagnóstico de la especie. La gota gruesa facilita el diagnóstico de la infección malárica, principalmente cuando los parásitos son escasos en sangre. La gota  gruesa reúne en un espacio relativamente pequeño, una mayor cantidad de sangre. Se acostumbra practicar en una misma lámina la gota gruesa y el extendido. Individuos experimentados pueden diagnosticar la especie del parásito en la  gota gruesa. Hay que recordar que con este método se destruyen los glóbulos rojos, no pudiendo utilizarse las modificaciones de éstos como ayuda diagnóstica. En las infecciones producidas por P vivax  y P malaria  se   se observan todos los estadios en la sangre periférica, pero en infecciones por P falciparum sólo se ven formas anulares o trofozoitos jóvenes y  gametocitos. Los plasmodios son más numerosos en la sangre periférica durante la fase final del acceso febril, mientras que en los paroxismos, especialmente en infecciones por P falciparum , se alojan en su mayoría dentro de los capilares de órganos internos. 2- “QBC” (Quantitative Buffy Coat Analysis) : consiste en la observación de muestras de sangre centrifugadas en tubos de microhematocrito especiales que

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Realizado or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl arcía. U.C.: U.C.: Microbiolo Microb Mic Microbiolo robiol biolo ioloo ía. Pro Pro  rama Medicina Medicina UNEFM. UNEFM. 2009  2009 Realizado Micro

MIC MICROB ROBILO ILOGIA GIA I MICROBILOGIA

Prrác rá áctica Nº Nº4 4: 4: Plasmodium,

SUS VECTORES VEC VECTO TORE RESS Y LAS LAS M MAL A ALAR LA ARI RI S HUMANAS HUMANAS.. SUS

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Realizado por: Realizado Realiz alizado ado por: por Licc Yots Yotsab Yot Yotsabe sabe Micro Microbiología. biología. Programa Programa Medic 2009 Reali Re aliza zado do por: or: or: Lic Li Yo tsabe abeeth Saúl Saúl García. arcía. arcía. U.C.: U.C.: Microbiolo Microb Mic robiol ioloogía. ía. Pro rama Medicin Medicin ina UNEFM. 2009 

MICROBILOGIA I MICROBILOGIA

Pr Práctica Nº4 4: ctica Nº 4: Plasmodium,

SUS V ECTORES Y LAS LAS M MA MALA IAS HUMANAS HUMANAS.. SUS VECTORES

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Realizado por: Realizado po por: Liic Yot Yotsa García. Garc ía. U.C.: U.C.:: Microbiol Microbiología. Microb Microbiol iologí a. Pro  Prog rogram rama Medi edic 2009 R eali alizado ado por: r: Lic L Yo Y otsa eth Saúl García. arcía. U.C. Micr obiolo oogía. ía. P ro grama rama Medic M edic na UNEFM. 2009 

MICROBILOGIA I MICROBILOGIA

Prá Pr Práctica Nº Nº4 4: 4: Plasmodium,

SUS VECTORES VECT VECTOR ORES ES Y LAS LAS M MA ALLAR LA ARIAS HUMANAS HUMANAS.. SUS

cont contie iene nen n acr acrid idin ina. a. Esta le da fluorescencia al núcleo del parásito y así son ob obervables al al mi microsc pio con luz ultravioleta, directamente en el tubo capilar, entre la capa de glóbulos blancos (“buffy coat”) y los gl bulos rojos. Demanda menos esfuerzo que el examen del frotis de sangre y es ás rápido. Se hace difícil diagnosticar la especie parasitaria.

Para el diagnóstico m lecular existen existen disponibles las técnicas e PCR y las de sondas de ADN y RN, mediante hibridizaciones con oligonucleótidos complementarios de regiones específicas de especie del parásito y que se detectan con radioisótopos o métodos inmunoenzimáticos.

TECNICAS DE DIAGN STICO INMUNOLOGICO Y MOLECULAR LECULAR 

MORFOLOGIA Y ESTRU TURA DE LOS ANOFELINOS (An opheles )

Para el diagnóstico serológico se utilizan métodos como inmun fluorescencia indire indirecta cta,, hemagl hemagluti utinac nació ió indirecta, ELISA. Se utilizan antígenos homólogos de cepas de P. falciparum  de P vivax. Estas técnicas serológicas deben considerarse como un medio eficaz en la evaluación epidemiológica o selección de posibles donant antes de de sa sangr ngre. En En ca cam io, son menos útiles en el diagnóstico de ca os.

Curp urpo de delicado, pa patas la lar as, antenas con varios segmentos (nematóceros), probóscide alargada y presencia de escamas en las alas. Adultos: en posición de re oso o picada, el Adultos: anofeli anofelino no adult adultoo adopt adopt una posición oblícu oblícuaa caracte caracterís rístic tica. a. Con respecto a la superficie.

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Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab Saúl García arcía. U.C.: Microb Microbiol Miccrob crobiolog robiologí iología. ía. Progr Program Medici Medic Medici 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab ab th Saúl Sa úl García. arc ía.. U.C. U. C.:: Micr Mi Microbiolo Micro obio biolo iolo loogía. íaa.. Programa Pro Pr Pro  oograma rama ra rama ama ma Medi Me edici dici ci a UNEFM. 2009 

MICROBILOGIA I MICROBILOGIA

Práctica Nº Nº4 4: 4: Plasmodium,

HUMANAS.. SUS VECTORES Y LAS MALARIAS HUMANAS

a) Cabeza: (Fig. Nº 22) - Ojos: compuestos y hexagonales; no hay ocelos.

ommatidias

- Antenas: al igual que en los culicinos, se implantan por delante de la concavidad anterior del ojo correspondiente. Tienen un escalpo reducido, un pedicelo o toro  globuloso y un flagelo formado por los 13 segmentos restantes (total 15 segmentos). Las antenas son plumosas en los machos y pilosas en las hembras. - Palpos maxilares: están formados por cinco segmentos y siempre son largos en ambos sexos. En la hembra tienen un  grosor uniforme y en el macho tienen la extremidad distal ensanchada en forma de espátula. b) Torax: el segmento mas desarrollado es el mesotórax ya que el protórax y metatórax están muy reducidos. Lo mas característico del tórax de los anofelinos es el escutelo, el cual presenta un borde regularmente redondeado, semilunar, con una hilera continua de cerdas pequeñas (excepto en el género Chagasia ), ), a diferencia de los culicinos que tienen el borde posterior trilobulado con un mechón de cerdas en cada lóbulo. c- Alas: las escamas que recubren las nervaduras de als alas de los anofelinos son de color blanco, crema y negro. Ellas se agrupan formando manchas, manchas a veces tan constantes que permiten clasificar las distintas especies (excepto el género Chagasia   que no tienen manchas). La presencia de alas manchadas es la característica fundamental de la tribu Anophelini.

Larvas: a diferencia de las larvas de los culicinos, no poseen sifón respiratorio. La respiración se realiza a través de espiráculos ubicados a todo lo largo de la cara dorsal del abdomen, por lo que la larva tiene que flotar en forma horizontal con respecto a la superficie del agua, ayudada por unas cerdas palmeadas, ubicadas a todo lo largo del tórax y del abdomen. Esta posición nos permite fácilmente diferenciarlas de las larvas de los culicinos (Aedes, Culex ). ).

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Realizado Reali Realizado zado or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl arcía. U.C.: U.C.: Microbiol Micr obioloo ía. Pro rama Medicina Medicina UNEFM. UNEFM. 2009  2009 Microbiolo

MICROBILOGIA I

Práctica Nº Nº4 4: 4: Plasmodium,

SUS VECTORES VECTORES Y LAS LAS MA MA ARIAS HUMANAS HUMANAS.. SUS

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Realizado Real Realiz izad adoo or: or: Lic Lic Yotsabe  Yots Yotsabe abe Saúl arcía. arcía. U.C.: U.C.: Microb Microbiol ioloo ía. Pro rama rama Medici Med Medic Medicin icin in n UNEFM. 2009 2009  Reali zado Yotsabet Yotsa betth Saúl

PRACTICANº5:: Toxoplasma gondii , Y TOXOPLASMOSIS Y OT AS PARASIT SIS EMERGENTES EN INMUNOSUPRIMIDOS (CR (CRISPT ISPTOS OSPO POR RIAS IASIS, CICLOSPOSIASIS, ISOSPORIASIS IISOSPORIASIS, SOSPORIASIS,, BLASTOCI TOSIS)

MORFOLOGIA Y ESTRUCURA DE Toxoplasma gon  ii 

Taquizoito: formas parasitarias extraepiteliales que se multiplican multiplican rápidamente. Su tama tamaño ño es de 4 a 6 mic micrr s de longitud, por 2 a 3 de ancho. Cua do se hacen coloraciones con Wright o Giemsa, adem además ás de ob obser servar var su su for for a arqueada, con una membrana externa compuesta de laminina unida a proteínas y otra membrana interna, ambas nterrumpidas en uno de sus lados por el icroporo. En el citoplasma se les visualiza el citoesqueleto con lo microt bulos y en la parte anteri anterior or se localiz localizan an la roptrias y los anillos polares. Tienen además, los micronemas, mitocondrias, aparato de Golg Golgii y vari varios os grá gránu nulo loss (Fi (F g. i Nº24,25 y 27).

Quistes Tisulares: poseen una membrana propia y miden entre 20 200 micras, de forma generalmente redondeada, algunas vece vecess alar alarga gada da.. En su interior se encuentr ntran cientos de fo formas parasitarias cono conoci cida dass com comoo bra bradi dizo zoít ítos, término que señala los elementos extr -epiteliales que se fo forman po por mu multiplica ión lenta. Estos pará parási sittos intr intraq aquí uíst stiicos miden apro aproxi xima maddame amente nte 7 mic micras de longitud por 2 de ancho (Fig. Nº26 y 28).

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Reali Realiza zado do por: por: poor: L ic Yotsabe  Yots tsabe U.C..:: Microbiología. Microbiolo Medicin icin in 2009 Realizado  orr:: Lic Lic Yot Yo tsabe abeth Saúl Saúl García. arcía. arcía. U.C.: U.C Microb Mic robiol ioloogía. ía. Programa Programa rama rama Medici Med Medic Me dicin n UNEFM. 2009 

Práctica Nº5: Tosoplasma gondii,  Y Y TOXOPLASMOSIS Y OTRAS PARASITOSIS EMERGENTES EN IN UNOSUPRIMIDOS.

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Real Realiz izad adoo por por:: Lic Lic Yots Yotsab abeth Saúl Saúl García. García. García. U.C.: U.C.: Microb Mic Microbiol robiologí robiol iolog ogía. ía. a. Progra Pro Programa grama ma Medic Me Medici diciina UNEFM. 2009  2009

Práctica Nº5: Tosoplasma gondii,  Y Y TOXOPLASMOSIS YY OTRAS PARASITOSIS EMERGENTES EN INMUNOSUPRIMIDOS.

La toxoplasmosis es una enfermedad de difícil diagnóstico parasitológico, pues no es fácil demostrar el agente etiológico y establecer la relación entre infección y enfermedad. TECNICAS DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO a. Demostración directa del parásito: Este puede encontrarse en LCR, ganglios linfáticos, médula ósea y ocasionalmente en otros tejidos. Cuando se obtiene material por punción, se busca el parásito en fresco o coloreado. En los tejidos, las características morfológicas son difíciles de precisar, pues el estudio histopatológic h istopatológicoo muestra formas redondeadas o partes del parásito, según sea su posición y se requiere mucho tiempo, experiencia y cortes seriados para poder identificarlo. Se confunden sus estructuras con otros protozoarios, hongos, polen, etc. b. Inoculaciones: el parásito se puede aislar de sangre, LCR, esputo y de los tejidos infectados, músculo, placenta, ojos enucleados y vísceras. El procedimiento indicado para el aislamiento es la inoculación al ratón a nivel de laboratorio. DIAGNOSTICO INMUNOLÓGICO a. Reacción de fijación de complemento: Fue la primera técnica serológica empleada para el diagnóstico de la Toxoplasmosis. La interpretación se hace mediante la observación directa de la ausencia o presencia de la hemólisis, indicativa de que hubo o no fijación del complemento por el complejo antígenoanticuerpo. La reacción es de tipo cuantitativa. b. Reacción de Sabin y Feldman: el suero que contiene anticuerpos específicos antitoxoplasmas, al actuar sobre toxoplasmas vivos in vitro , en presencia de un suero normal conteniendo un “factor accesorio”, impide que éstos se colorean con azul de metileno básico. El fenómeno tiene que ver aparentemente con modificaciones de la estructura citoplasmática y no solamente de la permeabilidad de la membrana, mediante la cual el ARN sale de la célula o se modifica al punto de no dar la tinción característica con el colorante. Es una reacción cualitativa y con diluciones

crecientes puede hacerse cuantitativa. El título está dado por la máxima dilución del suero en que permanece más del 50% de los toxoplasmas sin colorearse a la observación microscópica. Un mismo suero puede presentar variaciones en su título, que no debería ir más allá de una dilución. c. Reacción de Hemaglutinación Indirecta: consiste en la aglutinación de eritrocitos de carnero, previamente tanizados y sensibilizados con antígeno soluble de Toxoplasma , en presencia de un suero con anticuerpos específicos. La detección precoz de la primo-infección se detecta con títulos muy altos (más de 1/16.000) en la fase temprana de la infección. Pero como no detecta IgM, su interpretación está sujeta a repetir la prueba a diferentes intervalos de tiempo y a la evaluación de la modalidad clínica de la infección. d. Reacción de Inmunofluorescencia Indirecta: se utilizan taquizoítos muertos por formol o liofilizados. Los anticuerpos de clase IgG presentes en el suero del paciente se adhieren a la pared del parásito, donde se detectan por medio de  gammaglobulina anti-humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. La reacción se lee al microscopio de luz ultravioleta y se determina el título en la última dilución del suero, en la cual se encuentra fluorescencia de la pared del parásito. e. Intradermorreacción: prueba cutánea (Toxoplasmina) la reacción es de Hipersensibilidad retardada, consistente en la inyección por vía intradérmica de 0,1 ml de antígeno preparado de Toxoplasmas. La lectura se hace a las 24, 48 ó 72 horas, evaluando el diámetro de la infiltración cutánea y no del eritema. Se recomienda el uso de un segundo antígeno control (proteínas del ratón) para la detección de falsos positivos. Prueba positiva: infiltración con un diámetro mayor de 10 mm, indica que el sujeto en estudio ha tenido una infección o la tiene todavía, pero no indica actividad del proceso. Prueba negativa: no permite excluir infección reciente. El uso combinado de ésta con otras sero-reacciones, sirve de orientación diagnóstica para el tipo de infección (reciente o crónica), además es una prueba de gran utilidad en las encuestas epidemiológicas. epidemiológicas.

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Microbiologí a. Programa 2009  Realizado Realizado por: or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl García. arcía. U.C.: U.C.: Microbiología. Microbiol Mic Microbiolo robioloo ía. Pro Pro  rama Medicina Medi Medicina cina UNEFM. UNEF UNEFM. M. 2009

Práctica Nº5: Tosoplasma gondii,  Y Y TOXOPLASMOSIS Y OTRAS PARASITOSIS EMERGENTES EN INMUNOSUPRIMIDOS.

CRITERIOS CLINICOCLINICO-INMUNOLOGICOS PARA PARA EL EL DIAG DIAGNO NOST STIC IC DE LA TOXOPLASMOSIS Detección de Interpretación de los anticuerpos Resultados IgG IgM + - Fase temp ana de la infección  guda. + + - Infección  guda + - No hay infección aguda (paciente in mune). - No hay inf ección: Paci Pacien ente te no inmune Peligro de infección. DIAG DIAGNN NN STIC STICO O MOL MOLECULAR  ECULAR Detección de Antígenos: la reacción en cade cadena na de de la la pol polim imer eras asaa (PC (PCR) se usa para amplificar ADN de T. gondi i indicando la pres presen enci ciaa del del par parás ásit itoo en en los líquidos o tejidos, tejidos, inclus inclusive ive en en el líquid líquid amniótico. MORFOLOGIA Y ESTRU TURA DE COCCIDEOS INTESTI ALES.

obse observ rvan an grán gránul ulos os sim simil ilar ares a los cuerpos tilacoide tilacoides, s, mient mientras ras que que l forma madura contiene dos esporoqu istes con dos esporozoítos, cada uno e ellos, con un área apical estructural ente compleja, similar similar al conoid conoidee de lo coccidios, con ropt ropthr hria iass y micr micron onem emas as (Fig. Nº29).

2. Cryptosporidium Cryptosporidium spp : Oöquiste: quiste: esféricos o eli soidales, en el intestino pr presentan un un ta ta año entre 2 y 6 µm y se encuentran localizados en vacuolas parasitóforas. Los ooquistes presentan cuatro es orozoitos, sin esporoquistes son ovoides  y pueden medir entre 4,5 4,5 y 7,9 µm (Fig. (Fig. Nº: 30).

1. Cyclospora cayetanensis : Oöquiste: quiste: ácido alcohol resistente, esférico  y de 8-10 micras de diám tro, con una  gruesa pared de 50 nm de e pesor que los protegen del medio ambiente exterior. Se ha demostrado la presencia de dos formas: una inmadura, no esporulada y otra madura, esporulada. mbas formas pres presen enta tan n una una envo envolt ltur uraa fibr fibrilar de 63 nm de espeso espesor, r, por por debajo debajo d la cual se localiza una pared de 50 nm de espesor. Fig. Nº30: Las flechas señalan Oöquis quiste tess de de Cryp Crypto tosspori po dum spp, porid orrid id Ácidoresist resistent entes, es,, nótes nó nótes tes color rojo Ácido-resistentes -resistentes azul.. Coloración brillante sobre fondo azul de Kinyoun. Objetivo inm rsión (100X). Tomado de: Atlas de parasitología médica, Tomado Rodriguez, E.

Fig N Nºº29: fle flech chaa señal se ñal º29: La flech señ señal al un oöquiste acidoca y  ca y etanensis etanensis,, de acido-res -resistente resistente de  C. cay  color rojo brillante sobre fondo azul. azul. Nótese corpúsculos internos que corres correspon ponde den n a esporo esporozoí zoíto to . Muestra de materia fecal. Coloración de Kinyoun. Obje Objeti tivo vo de inme inmers rsió ión n (10 (100 0 ). Tomado de: Atlas parasitología médica odriguez, odriguez, E. En el interior de la forma inmadura, se 44

Práctica Nº5: Tosoplasma gondii,  Y Y TOX PLASMOSIS Y OTRAS PARASITOSIS EMERGENTES EN IN UNOSUPRIMIDOS.

3. Isospora belli : Ooquiste Ooquiste al al examen examen al fresco de materias fecales se observan trans arentes, con mem membran branaa del delggada ada y de for for a oval. Mide aproximadamente 28 por 13 micras. En el momento de la eliminación contiene una masa granulosa llamada esp roblasto, que se div divide ide en dos en en el el me io ambiente, cada una de las cu les produce membrana, para constituir dos espo esporo roqu quis iste tes. s. En el inte interrior de cada esporoquiste se forman 4 esporozoítos fusiformes (Fig. Nº31).

Fig. Nº 31: Isospora belli. Oö uiste maduro. Presenta dos esporoquistes (1)de pared  gruesa, en cuyo interior se observan esporozoit esporozoitos os (2).Co ((2).Con 2).Contras ntraste tee d Fase. Tomado (2 ).Contrast traste de:www.tropeduweb.ch/ima de:  ges/isospora_  belli._1.pg.jpg

La técnica parasitológica ás precisa es, la coloración por el método de Ziehl-Neelsen modificado para Crypstoporidium , (Método de Cyclospora e  Iso Isospo spor Kinyoun); el cual consiste n: - La muestra de materia fecal o esputo se extiende nde en el portaobj tos en un área aproximada 1 ½ cm de di metro. - Después de secar la preparación se fija 10 minutos con metanol. - La La col color orac ació ión n se se hace hace c n carbol-fuccina concentrada, con este col rante se deja 20 minutos. - Lue Luego go lava lavarr 2 minut inutos os c n agua corriente. - Se deco decolor loraa con con con ácid ácido sulfúrico al 7%, para para luego luego lavar lavar duran durantt 2 minutos con agua corriente. - El El co colorante de contr ste es verde de malaquita al 5%. Dejar 2 inutos. Este co colorante pu puede emplearse por azul de metileno. - Final Finalmen mente te se lava lava co agua corriente durant durantee 1 minu minuto to y se deja secar a temperatura ambiente antes de la preparación al microscopio. Los oöquis oöquistes tes se obser observa va teñidos de rojo brillante ntes so sobre fo fondo ve ve de, mientras que las levaduras se colorean e color azul. Son redondeados redondeados u ovalado ovaladoss de 3 a 5 micras de diámet diámetro. ro. En En alguno algunoss se logra ver los corp corpús úscu cullos int interno ernoss te teñidos más oscuros que corresponden a espor zoítos. Para

concentrar oöquistes de Cryptosporidium , se realizan las técnicas de Ritchi Ritchiee modifi modificad cadaa que us formol-éter y la de She Sheathe atherr que que es u a flotación con azúc azúcar ar.. Am Ambas bas son son simi imila es en efectividad. Es necesario tener pr caución en la manipulación de muestras de pacientes con SIDA. TECNICAS DE DIA NOSTICO INMUNOLOGICO Y Y   OLECULAR. TECNICAS DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGI O El diagnóstico parasitológico se hace por el hallazgo de oöquistes en las materias fecales, esputo, lavado bronco-alveolar, y/o heces. En las preparaciones con solución salina y lugo lugoll se se puede ueden n obs obseervar rvar u as estructuras redondeadas u ovoides de ared definida, como “huevos vacíos”, de tamaño uni uniforme, refringente ntes, alg nas veces con est estruct ructur uraas gran granul ular arees inte interr as, que no son fáciles de identificar.

Debido a que, frecuente ente, se asocia la presencia de Cryptosp oridium en los pacientes con VIH, se han diseñado tinciones que detectan la presencia de ambo amboss par parás ásit itos os.. Exi Exist st n métodos de detección de antígenos en heces por inmunofluorescencia, hemaglutinación y ELISA que presentan b enos resultados, incluso superiores a los métodos tradicionales. También ay técnicas de inmun inmunof oflu luor ores esce cenc ncia ia pa a la detección  parvum y Giardia conjunta de C. intestinalis .

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Realizado Realizado por: Lic Yotsabet Yots abet U.C.: Microbiología. Microbiología. Programa Programa Medicin Medic in UNEFM. 2009  2009 Yotsab eth Saúl García. U.C.: Medicin

Práctica Nº5: Tosoplasma gondii,  Y Y TOXOPLASMOSIS Y OTRAS PARASITOSIS EMERGENTES EN INMUNOSUPRIMIDOS. INMUNOSUPRIM INMUNOSUPRIMIDO IDOS. S.

Se han descrito varios métodos de amplificación, basados en la PCR, con la utilización de cebadores específicos para Cryptosporidium, que consiguen una alta sensibilidad y especificidad en la detección de este parásito en muestras clínicas y ambientales. También mediante técnicas de biología molecular se ha conseguido diferenciar las distintas especies del género (amplificación de un fragmento  y corte con el enzima enzima de restricción). Para el diagnóstico del parásito en los pacientes inmunocompetentes es necesario el procesamiento de tres muestras de heces mientras que, en los pacientes infectados por el VIH, podría examinarse una única muestra, recomendándose el procesamiento de una segunda si la primera fuera negativa  y existiera una elevada sospecha clínica (Ej: diarrea).

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Microbiologí a. Programa UNEFM. UNEFM. 2009 Realizado Realizado por: or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl Saúl García. arcía. U.C.: U.C.: Microbiología. Microbiolo Microbiol Micr obioloo ía. Pro  Pro grama rama Medicina Medicina UNEFM. UNEF M. 2009 

UNIDAD III HELMINTOS 47

Programa  grama Medicin a UNEFM. UNEFM. UNEFM. 2009 Realizado Realizado por: or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl Saúl García. arcía. U.C.: U.C.: Microbiología. Microbiolo Microbiol Microbioloo ía. Pro  Pro rama Medicina Medicina UNEF M. 2009 

PRACTOC Nº6: Nº6: GEOHELMINTOS Y GEOHELMINTIASIS. TIASIS. Los Helmintos o vermes, comúnmente llamados gusanos, son seres multicelulares, ampliamente distribuidos en la naturaleza. Muchos de ellos viven libre ente y otros se han adaptado a llevar vida parasitaria en vegetales, animales o en el h mbre.

intervienen  huéspedes intermediarios, mientras que otros pueden transmitirse direc directam tament entee de person person a persona por ingestión de huevos, a ste grupo se les denomina Biohelmintos. Ascaris lumbricoides:

Los helmi helmintos ntos de mayo mayo importancia médi médica ca per perte tene nece cen n a los los Filu Filum Nematoda  y Platyhelmintes . Los nematodos y los plathel intos difieren morfológicamente en que los primeros pose poseen en cue cuerp rpos os cil cilín índr dric ic s (gusanos), cavidad corporal y tubo digestivo completo, mientras que los segundos on aplanados, sin cavidad corporal y ap rato digestivo muy rudimentario. Todos presentan un sistema reproductor muy desarrollado y la mayoría de los plath lmintos son herm hermaf afro rodi dita tas. s. Much Muchos os han adquirido órgano órganoss de fijaci fijación, ón, co  ganchos o ventos ventosas; as; otro otross han formad formad una cutícula resi resist sten ente te a los los jugo jugoss dig digeesti sti os del huésped la mayo mayorí ríaa han han adqu adquir irii o un aparato dige digest stiv ivoo senc sencil illo lo,, pue puess tom toman el alimento a digerido por el hué ped. Muchos hel helmintos, en especial las formas larvarias, poseen glándula ulas que secr tan sustancias líticas para facilitar la penetración de tejidos. El sis siste tema ma excr excret etor or es senc sencil illo, usualmente constituido por tubos colectores que desemb desemboca ocan n al al exteri exterior or d l parásito. El sistema ne nervioso es rudimentario y sirve para originar el movimiento  y la respuesta a los estím estímulo ulos. s. No No ha propiamente aparat aparatoo locomoto locomotor, r, except except en algunas larv larvas as que que lo lo han han desa desarr rrol olla la o en diferentes for formas. No No ha hay un un si siste a circulatorio propiamente y carecen de aparato resp respir irat ator orio io;; la mayo mayorí ríaa s n anaerobios facultativos. De acuerdo al modo de tra smisión de los nematodos intestinales, predominan los transmitidos a través de la tierra, la cual se cont contam amin inaa con con huev huevos os o larv larvas que salen en las las mat mater eria iass fec fecal ales es;; a este grupo de parásitos se les denomina Ge helmintos. Alguno Algunoss plathel plathelmi minto ntoss tiene tiene ciclos de vida  generalmente complejos, complejos, en los que

ADULTOS: ADULTOS: la hembra mi e de 20 a 20 cm de long longit itud ud y 3 a 6 m de diámetro, el macho de 15 a 20 cm de largo y 2 a 4 mm de diámet diámetro. ro. Son Son de colo rosado o blanco amarilloso y los sexos se pueden diferenciar macroscópicamente por la forma del extremo posterior, que en la hembra termina en forma recta, ientras que en el macho presenta una c rva en la cual existen 2 espículas quitinosas retráctiles que le sirven para la co ulación (Fig. Nº 32).

El aparato digestivo está onstituido por la apertura bucal situada en el extremo ante anteri rioor (Fig (Fig.N .Nºº33) 33) rode rode da por 3 labios promin prominent entes, es, por por un cort cort esófago y por el intes intesti tino no,, el el cua cuall se se obs obser erva aplanado y de color verdoso, que dese boca en el ano situado en una cloaca erca al extremo post poster erio ior. r. La La mayo mayorr par par e de la cavidad interior está ocupada por el aparato genital que se observa como un o illo de conductos de diferente diámetro.

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Realizado por: Realizado por por: Licc Yots Yotsab García obiología Programa Progr Medi 2009 Real Realiz izad adoo por: or: Lic Li Yo tsab abeth eth Saúl Saúl García. arcía. arcía arcía.. U.C.: U.C. U.C.:: Microbiología. Microbiol Micr Microb obiolo obio iolo looogía. ía. ía. Pro  Pro Pro grama rama ra rama ama ma Medici Me Medici dici ci a UNEFM. 2009 

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PRACTICA Nº6:: GEOHELMINTOS Y GEOHELMINTIASIS. GEOHELMINTIASIS PP RACTICA   Nº6  GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS.

En la hembra es notoria la presencia dos ramas uterinas que dese bocan en la vagina, vagina, la la cual cual se comu comunic nic con la vulva, localizada entre el tercio anterior y medio del cuerpo cuerpo.. En el mac mach h los órganos  genitales desembocan con el intestino en la cloac cloaca. a. Los Los adul adulto toss no no tie tien n n órganos de fijaci fijación ón y viven viven en en la lu lu del intestino delgado sostenidos contra las paredes debido a su musculatura. trichiura Trichuris trichiura 

ADULTOS:

Trichuris trichiura   o tric céfalo, deriva su

HUEVOS: Los huevos fértiles provienen de las hembras fecundadas, tienen forma oval o redondeada y miden aproxi adamente 60 micr micras as de diám diámeetro tro may may r. Tienen 3 membranas, una externa m melonada y 2 intern internas as lis lisas, as, inmed inmediat iatam amen ente debajo de la anterior. Estos huevos al ser examinados en las materias fecales se obs rvan de color café por estar colorados por la bilis y en su inte interrior ior pre prese sen ntan tan un un mat mateerial granuloso que que pos poste teri rior orme ment ntee dar daráá ori ori en a las larvas. Los huevos infértiles, observados menos frecuentemente, provienen e hembras no fecundadas, so son má más ir irregul res, alargados, con con prot protub uber eran anci cias as ext exter ern nas grandes o ausentes y generalmente con una sola membrana. Estos huevos no son infectantes pero tienen importancia en l diagnóstico y como los fértiles, fértiles, indican indican l presencia de Ascaris  hem  hembras en en el el int inteesti o.

Cortesía PP Parasitolo ía. LUZ

nom nombre bre del térm térmiino “tri tri o” que significa cabe cabeza za en form formaa de de pel pel . Es un gusano blan blanco co de apro aproxi xima maddame amente 3 a 5 cm de largo. La parte anterior que es delgada, ocupa dos dos tercera tercerass parte parte del parásito. El tercio posterior es más grueso y en conjunto simula un látigo. La he bra termina en forma recta en su e tremo posterior mien mientr tras as que que el el mac macho ho tie tiene una curvatura pronunciada pronunciada y está está provist provisto en este extremo de una una espí espícu cula la copu copula latt iz (Fig. Nº 34). Cerca de este órgano se e cuentra la cloaca donde desemboca el aparato genital masculino. Lo Los ma machos, c mo en casi todos los nemátodos, son más equeños que las hembras.

El tubo digestivo se inicia on la boca que es pequeña y provista e una lanceta diminuta, continúa con el esófago formado por por un tub tuboo rode rodead ad de glándulas unicelulares en forma de cadena y le sigue el intes intestin tinoo que termi termina na e el ano cerca del 49

Realizado por: Realizado Realiz Rea lizado por: por Yotsab Yot Yotsabe sabe Microbiologí biología. a. Pro Programa grama 2009 Real Re aliz izad adoo por: or: or: Lic Lic Yots Yo tsabe abeeth Saúl Saúl García. arcía. arcía. U.C.: U.C U.C..:: Microbiología. Microb Mic Microbiolo Micro robiol biolo ioloo ía. Pro  rama rama Medicin Medic Me Med Medic dicin icin in a UNEFM. 2009 

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extr extreemo post posteerior rior.. El El esó esóff  go está en la parte delgada del parásito, ientras que el inte intesstino ino y los los ór órgano ganoss ge genit nitales ocupan la parte gruesa del parásito. El aparato genital es muy desarrollado, princi almente en las hembras; el útero termina n una vagina corta que desemboca en un orificio vulvar situad situadoo cerca cerca de la la unió unió de la parte delgada con la gruesa.

PRACTICA Nº6 GEOHELMINTOS Y GEOHELMINTIASIS. GEOHELMINTIASIS. PP RACTICA   Nº6: 6: GEOHELMINTOS  GEOHELMINTIASIS

sirven como órganos cort ntes y de fijación, con ellos hieren la mu osa intestinal y producen producen hemorragia hemorragia (Fig. Nº 37).

HUEVOS: Los huevos son muy característicos y fáciles de identificar, miden aproxi adamente 25 micras de ancho por 50 de largo, de color café, membrana doble y tapones en los extremos (Fig. Nº 34).

La cápsula bucal actúa omo una bomba aspirante accionada por n fuerte esófago, con un bulb bulboo muscu musculos los que se contrae rítmicame rítmicamente nte (Fig. (Fig. Nº 39). A éste sigue un intestino tubular que esemboca a la cloaca. El interior de los v rmes, además del apar aparat atoo dig digest estivo, ivo, conti onti ne los órganos  genitales bien desarrollad desarrollad s. Ancylostomydeos.

La anquilostomiasis es la parasitosis ocasionada ocasionada en el hombre hombre po nematodos de la familia Ancylostomidae, espefíciamente Necator americanus v Ancylostoma

La diferenciación de las dos especies mas imp import ortante antes, s, est están res resum umii as en la tabla Nº 2.

duodenale.

La morfología macroscópica de los adultos es si similar een ntre sí sí. So Son gu gus nos cilíndricos de apro aproxi xima mada dame ment ntee 10 10 m de longitud, de colo colorr bbla lanc nco, o, las las hemb hembrr s tienen 2 a 4 mm mas mas de longitud longitud que que lo machos y son un poco mas gruesas (Fig. Nº 35). Es fáci fácill dif difer eren enci ciar ar el sexo sexo,, p es los machos, presentan en el extremo posterior un ensanchamie ensanchamiento nto radial de l cutícula, con prolongacio prolongaciones nes en forma d dedos que le sirv sirveen par paraa so soste stener ner la la he hembra durante la cóp cópula, ula, deno denomi mina nada da bu sa o bolsa copulatriz copulatriz (Fig. (Fig. Nº 36 y 38). Los dientes o plac placas as cort ortante antess de de la la re región bucal, les

Fig. Nº 39: Cortesía PP P rastilogía. LUZ

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PRACTICA Nº6: PP RACTICA   Nº6: GEOHELMINTOS Y GEOHELMINTIASIS. ELMINTIASIS.

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PRACTICA Nº6:: GEOHEL GEO GEOH GEOHELM HELMIN ELMINT MINTO INTO TO O  Y Y GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS. GEOHELMINTIASIS PP RACTICA   Nº6 GEOHELMINTIASIS.

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PRACTICA Nº6:: GEOHELMINTOS Y GEOHELMINTIASIS EOHELMINTIASIS.. PP RACTICA   Nº6

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PRACTICA Nº6 EOHELMINTIASIS.. PP RACTICA   Nº6: 6: GEOHELMINTOS Y  EOHELMINTIASIS

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HUEVOS: los huevos de las uncinarias que parasitan al humano son indistinguibles entr entree sí. sí. La for forma ma es oval ovalaa a y miden 60 por 40 micras, son de color lanco con una membrana única muy u iforme y un espacio entre ella y el contenido interior; éste éste consi consist stee en en un un gra granu nula lado fino en los huevos recié recién n puestos puestos por el vermes y con varios blastómeros al salir n las materias fecales (Fig. Nº40).

PRACTICA Nº6 EOHELMINTIASIS.. PP RACTICA   Nº6: 6: GEOHELMINTOS Y  EOHELMINTIASIS

Fig. Nº Nº 41 41:Adultos ma ma ho y hembra de E. vermic  laris  (  (Disponible  Disponible en: mx.geocities.com/imag s/nemato1.jpg La envo envolt ltur uraa ext exter erna na es muy transparente y permite ver el esófago con un bulbo prominente (Fig. Nº 42  y 43), que se continúa con el in estino, el cual desemboca ce cerca de del ex extremo posterior. El aparato genital es muy esarrollado y en estado de gravidez se bserva el útero completamente lleno de uevos, ocupando caso la la to totalidad del cu cu rpo del parásito hembra. El útero tiene dos ramas que confluyen en una vagina  y vulva, que sale al exterior un poco por d lante de la mitad del del cue cuerp rpo. o. El mach machoo mi mi e la mitad de la hembra (o.5 cm), tiene el xtremo posterior curvo, provisto de una es ícula copulatiz y rara rarame ment ntee se encu encuen entr tra, pues muere después de la cópula y es eliminado con las materias fecales.

Enterobius vermicularis :

ADULTOS: es un gusano peq eño y delgado ADULTOS: de color blanco. La embra mide aproximadamente 1 cm de l ngitud, con el extremo posterior recto y untiagudo. Al microscopio se ve un e sanchamiento bilate bilateral ral de de la cutí cutícul culaa en el extremo anterior, a manera de aletas (Fig. Nº 41). A lo largo del cuerpo y bilateralmente, existen dos en engrosamientos de de la cu cutícula en forma de aristas triangulares, características de este este nema nemattodo, odo, espe especi cial alme me te cuando se observa en cortes transversal s.

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HUEVOS: los huevos son bl ncos, hialinos, HUEVOS: con un lado aplanado, por lo cual tienen forma similar a la “letra ”, cuando se obse observ rvaa en en una una pos posic ició ión n que muestre el lado aplanad nado. Si esto no sucede se ven de forma aplanada (Fig. Nº 44). Poseen doble membrana  y desde el momento que salen están muy evolucionad evolucionados, os, por lo lo cua es frecuente observ observarl arlos os con con larv larvaa en su interior. Su tamaño año es de aproximadam nte 50 micras de longitud por 25 de ancho.

ermicularis Fig. Nº 44: Huevos de E. ermicularis  (Disponible en : www.asm.org/division/c/p rasite.htm rasite.htm )  )

PRACTICA Nº6:: GEOHELMINTOS  GEOHELMINTIASIS. PP RACTICA   Nº6  GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS.

DIAGN STICO PARASI OLOGICO DE E. vermicul  ris : El diagnóstico clínico diferencial de las enterobiasi enterobiasiss debe debe hacers hacers principalmente con las entidade entidadess causante causantes de prurito anal, algunas veces genital en el sexo femenino. Cuando el prurito anal o enital se presenta en niños niños o niñas, niñas, es en en la mayoría de los casos debido a oxiuros, mientras que en los adul adulttos es esta ca causa usa es es me me os frecuente. En ell ellos puede uede ser ser pro producido por fisuras, hemorroides, alergias o problemas infl inflam amat ator orio ioss de de ano ano y rrec ecto; en las mujeres adultas el prurito genital uede ser debido a cand candid idos osis is,, tric tricom omon onos osis, infecciones  genitales, alergias, etc, y n menor grado a enteroviasis. El diagnostico de la o iurosis se hace  generalmente por el mét do oviscópico, el cual cual cons consis iste te en el hall hallaz az go de los huevos en la región perianal, p rineal o vulvar, utiliz utilizand andoo el métod métodoo de l cinta engomada transparente(Fig. Nº 45). Las muestras deben tomarse en las mañanas, preferiblemente antes de defecar sin previo previo lavado lavado de l región perianal. Las cintillas deben observarse al microscopio el mismo ía, utilizando el cond conden ensa sado dorr baj bajo, o, para dar mejor cont contrrast aste, pues ues los los hue hue os son de color blanco y muy transpare te. Es necesario adqu adquir irir ir buen buenaa expe experi rien enccia en este examen de labo labora rato tori rio, o, para para evit evit r un diagnostico errado err ado,, al confun confundir dirlos los co co artificios que se pued pueden en ver ver en en la la ci cinta. Para mayor segu seguri rida dadd en el diag diagnó nóst stii o, se recomienda repetir repetir el el examen examen varias veces en días diferentes, pues la salida de los parásitos hembra hembra a través del del ano, no siempre es regular o constante. La po itividad aumenta cuando el número de muestras por paciente es mayor y continuo. El examen coproparas tológico directo corriente usado para el di  gnóstico de otros parásitos intestinales, no s efectivo para el diagnóstico de oxiuros. En pacientes con

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PRACTICA Nº6: Nº6: GEOHELMINTOS Y GE HELMINTIASIS. HELMINTIASIS. PP RACTICA  

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PRACTICA Nº6 GEO GEOH GEOHELM HELMIN ELMINT MINTO INTO TO OS Y GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS.. PP RACTICA   Nº6: 6: GEOHEL

esta esta parasito parasitosis sis se encue encuentr ntraa huevos en las materias fecales en aproxi adamente 5%. Esto implica que si se confía únicamente en el exa exame men n copr coprop opar aras asit itol ológ ógii o, pasarán sin diagnosticar el 95% de los casos de oxiurosis. A veces veces el pacien paciente te mism mism o la madre, encuent encuentra ra los los gusano gusanoss en l ropa interior, piyamas piyamas o en la piel periana perianal o perineal. La simple observación microsc pica permitirá la ide ident ntif ific icac ació ión, n, al obs obser ervv r los gusanos con las características morfológicas descritas. METODOS COPRO COPRO--PARAS TOLOGICOS DIRECTOS: Método cualitativo: en la ayoría de las helmintiasis intestinales, la búsqueda de huevo huevoss en las las mat mater eria iass feca fecall s es el método más simple y económico de iagnóstico. En estas enfermedades es importante conocer el número aproximado de  gusanos que existen existen en el intest intestino, ino, basad basad en el número de huevo huevoss que aparez aparezcan can en las materias fec fecales. Lo Los mé métodos de de recu nto de huevos hace hacen n pos posib ible le esta sta vval alor orac acii n, la cual ha permitido comprobar que la sintomatología está directamente relacio ada con el número de parásitos. Método cuantitativo: ativo: (Téc ica de Kato Kato-cuantitativo: Katz) este este  es el método método má recomendado en la actualidad y el que prefiere la OMS, tanto para estudios diagnósticos individuales, como para investigaciones epidemiológicas. La técnica es la siguiente Fi . Nº 46) - colocar sobre el papel higiénico la muestra materias fecales. - presionarla a través de la tela metálica o de nylon. - Ret Retir irar ar las las hec heces es feca fecale less q e traspasan la tela y transferirlas, co con el el au au ilio del palillo, al orificio de la pl placa que de erá estar sobre un porta-objetos. - después de llenar co pletamente el orificio, retirarla cuidadosa ente, dejando las materias fecales sobre el orta-objetos. - cubrir las heces con la la inilla de papel celofán, celofán, inverti invertirla rla sobre sobre un hoja de papel de filtro o higiénico y comprimirla suavemente. - esperar 1-2 horas y examinar al microscopio. El número de huevos enc ntrados en el frotis fecal, fecal, multiplic multiplicad ado por 23, corresponde al número por ramo de heces (h.p.g.).

De igual forma, se pueden emplear métodos de flotación como FA FAUST o WILLIS MOLLOY MOLLOY (des (descri critos tos en en l práctica Nº 1), MOLLOY  para para evidenc evidenciar iar huevo huevoss d  geohelmintos de interés médico. Técnicas de coprocultivo ara S. stercoralis : Son poco utilizados en l diagnóstico de parasitosis intestinales. A pesar de esto, se menciona la más útil en estudios especiales o en investigación de S. st  rcoralis . S. stercoralis tiene en su iclo de vida una

etapa de reproducción de vida libre, la cual se puede obtener en el laboratorio, utilizando los medios decuados. Estos procedimientos también son útiles para ais aislar la larvas rhab habditifor for es y filariformes de uncinarias y hacer la identificación de especie (Fig. Nº 47).

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PRACTICA Nº6 Nº6: 6: GEOHELMINTOS  GEOHELMINTIASIS. GEOHELMINTIASIS PP RACTICA    GEOHELMINTIASIS GEOHELMINTIASIS.

Método con arena o carbón egetal: Se utiliza ca carbón veg vegetal mo ido, arena sola o mezclada con tierra, previamente esterilizadas, la las cu cuales se se co co ocan en placas de petri estériles. - utilizand utilizandoo baja-le baja-lengua ngua se mezcla abun abunda dant ntee can canti tida dadd de de mat mateeria fecal con el medio de cultivo. - se agrega agua para umedecer sin excesos y se tapa la placa. - se deja a temperatura amb ente durante 2 a 7 días, días, agregando agregando agua, agua, si es necesario, para mantener mantener la humedad. humedad. - a los 3 días pueden enc ntrarse larvas filariformes de Strongyloide   y a los 6 días las de uncinarias. Se buscan en las gotas de agua que que se conde condensa nsan n en l tapa o donde haya líquido líquido acumula acumulado do en el cultivo. También puede utilizarse el método de Baerma Baermann nn para para la sepa separac ració ió de larvas. Método de Baerm nn: Esta técncia se emplea en estrongiloidosis, para concent concentrar rar las las larva larva a partir de materiales fecales, cultivos o tierra. El procedimiento es el siguiente : - En un embudo colocado en un soporte vertical, que tenga en el extremo un tubo de caucho caucho cerrado cerrado con pinza pinza, se vierte agua a temperatura de 40-42 ºC, hasta cerca del borde. - Se Se coloca so sobre el el em emb do una malla metálica o cedazo, cubierto on gasa doble o cuádruple cuádruple,, que debe hacer contacto con el agua. - Se ponen ponen sob sobre re la la gasa gasa 8-1 8-1  g de materias fecales, tierra o material de ultivo, lo cual se deja por 60-90 minutos. - Las larvas, sedimentadas en el tubo de caucho, caucho, se se obtien obtienen en abriend abriend la pinza, para obte obtene nerr líq líqui uido do en un tu o o gotas de portaobjetos, que se xaminan al microscopio (Fig. Nº 48).

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PRACTICA Nº Nº7 7: BIOHELMINTOS HELMINTOS Y BIOHELMINTIASIS. 7: BIO Phylum: Platyhelminthes. Clase: Cestoda Cestoda  Taenia solium y   Taenia sagin ata.  yy  y Taenia Adultos: T. solium  y T sagi  ata  viven   viven en el inte intest stin inoo delg delgad adoo del del hum huma o (hospedador defin finitivo), principalm nte yeyuno, adherid adheridas as por el escóle escólexx (Fi (Fi g. Nº 49). Los proglótidos grávidos t rminales se desprenden y salen espo táneamente o mezclados con las materias ecales (Fig. Nº 50). El contenido de ellos es esencialmente el útero útero ramifi ramificado cado lleno de huevos, que son son redo redond ndea eado doss o lige ligera ram me te ovalados, de aproximadamente 30 a 0 micras de diámetro, con doble membrana gruesa y radiad radiadaa que le da da semeja semejanz nz a una llanta, son de de color color café café y pres present entaa en su interior el embrión hexacanto u oncósfera, con 3 pares de ganchos. A sim simpl plee vis vista ta los los par parás ásit itos os s n aplanados y se observan como una c nta blanca o amaril amarillos losaa (Fig. (Fig. Nº Nº 51), con un extremo más de delgado que que correspo de al escólex, del tamaño tamaño de una una cabeza cabeza d alfiler, de 1-2 mm de diámetro. Al icroscopio se observan 4 ve ventosas del escólex en ambas Taenias y en T. solium  l róstelo está provis provisto to de una una doble doble coron coron de ganchos en número aproximado de 30.. El escólex se continúa con un cuello aún ás delgado, el cual cual se va ensa ensanc ncha hand ndoo ha ta alcanzar el tama tamaño ño de 1 cm, cm, co proglótides inma inmadu duro ros. s. Le Le sigu siguen en l s proglótides madu maduro ros, s, un poco poco más más anc anch h s que largos y en la parte terminal del pa ásito están los  grávidos que son 3 veces ás largos que anchos. Las principales difer ncias entre las dos especies de Taenia , se e umeran en las Tabla 3.

Fig. Nº 49: Escólex de una T. solium. Nótese las cuatro ventosas (A), (A),  yy el rostro con hileras hileras circularte circulartess de gancho ganchos característico de la especie (B) (B)..

Fig. Nº Nº 50 50: Pr Proglótide gr grávido ido de T. solium inyectado con tinta china a través del poro  genital, para delinear el ú ero ramificado. (Tomad (Tomadoo de: Diag Diagnós nóstic tic Microbiológico. Koneman. 5º Edición)

Fig. Nº 51: Taenia sagin  ta   adulta con el pequeño escólex y el estróbilo, de varios metros de long longitud, itud, que contiene una larga cade ad a de pro proglóti es. (Tomado de: aden na Diag Diagnó nóst stic icoo Mic Micro robi biol ológ ógiico. o. Koneman. 5º Edición )

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Real Realiz izad adoo or: or: Lic Lic Yots Yotsab abeth eth Saúl Saúl arcía. arc arcía ía.. U.C. U.C.:: Micr Microb obio iolo lo ía. ía. Pro Pro rama rama Medi Medici cinaa UNEFM. 2009  2009

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MICROBIOLOGIA I

Huevos: Tienen forma esférica, uy pequeños, miden de de 30-40 µm µm de diámetro, presentan un color caoba y poseen: a) un contenido  granuloso con 3 pares de  ganchos, es la oncósfera o embrión hexac hexacanto ; b) una cáscara gruesa o embióforo que rodea a la oncósfera, mide cerca de 3 m de espesor, que que se se pres presen enta ta como como una estructura finamente finamente estriada estriada en senti sentidd radial, debido a la yuxtaposición de elem ntos en forma de bastonetes, unidos por una sustancia cementant cementante. e. En la la prácti prácticc es imposible distinguir un huevo de T. so ium  de   de uno de T. saginata , por lo que los resultados de los exámenes exámenes de heces heces se refiere refieren como huevos de Taenia sp.

PRACTICA Nº7 Nº7: 7: BBIO IOHELM NTOS Y BIOHELMINTIASIS BIOHELMINTIASIS. PP RACTICA   HELMINTIASIS.

En estos tejidos el embrión crece, pierde sus  ganchos (en el caso de T. aginata ) y al cabo de un tiempo el embrión comienza a invagin invaginars arsee y vacu vacuoli olizar zarss . Se forma así en el fondo de esta in aginación, una estructura parecida a la de un ejemplar adulto, 4 ventosas para T saginata y T.  además de de un ró róst lo (Fig. Nº XX). solium, ade

Fig. Microfoto grafía biopsia de Fi g. Nº 53: Microfoto cere cerebr bro. o. C isstic ercos rcosis is hum humana por T. solium  Cis Ciisti tice ticcerc en corte transversal. (Tomad (Tomadoo de: Diag Diagnós nóstic tic Microbiológico. Koneman. 5º Edición). Fig. Fig. Nº Nº 52: 52: Micr Microf ofot otog ogra raffía de huevos inmaduros de Taenia sp. Nó Nótesela cubierta con estrías radiales. (Tomado de: Diagnóstico Microbiológico.  Koneman. Koneman. 5º Edición). Edición).

Metodología de Análisis nálisis copro--parasito copro -parasitológico

Cisticerco: Es la forma larvaria que se encuentra en el hospeda hospedador dor interme intermedia diari ri  y cuya denominación varía también con la especie: par T. solium  y Cysticercus cellulosae   pa Cysticercus bovis para  T. sa   ginata (Fig. Nº 53). Los cis cistic ticerc ercos os se aloja aloja en tejidos específicos, para T. sol um , el tejido conjuntivo de los músculos masticadores, lengua, lengua, corazón, diafragm diafragmaa, cerebro, ojos del cerdo; para T. sagi  ata , el tejido conjuntivo de los músculos masticadores, corazón y lengua del bovino.

La orientación pri cipal para el diagnóstico se basa en la observación por parte del paciente, de los fragmentos (proglótides), que salen espontáneamente o en las materias fecales. Al tamizar las materias f cales a través de una malla, se pu den recuperar proglótides. El método ás simple para clas clasif ific icar ar la espec specie ie,, se b sa en el número de ramas uterinas princi ales, que salen a casa lado del conducto u erino central del progló proglótid tidee grávid grávido, o, que que so menos de 12 en T. sollium  y  y más de 12 en T. saginata . Para que el número e ramas pueda observarse bien, es necesario que los

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proglótides sean grávidos. e otra manera no se podrá diferenciar entre las dos especies. Si se obtiene obtiene el escólex escólex deb deb observarse al microscopio para identificar los ganchos en T. solium   o confirmar la ausencia de ellos en T. saginata  El examen examen de materias materias fecale fecales es importante para observar macroscópicamente la presencia de fragmentos y ara identificar los huevos en el microsc pio. No debe confiarse en este estudio como método único, pues es frecuente que no se observen huev huevos os al exam xamen co coprol prológ ógico, aunque el paciente tenga la tenia en su intestino. El método de concentración de formol-éter es rec recome omendab ndable le (véa (véase se Prác Práctica Nº 1), por la posi posibi bili lida dadd de de que que exi exist stan huevos en poca cantidad. Un importante avance inm nológico en el diagnóstico de teniosis, lo constituye la detección de coproantígenos por el método de ELISA ELISA.. Esta Esta es una una prueb prueb colorimétrica en materia fecal. Trematoda Clase: Trematoda  Trematoda  hepática Fasciola hepática 

Adul Ad ulto to:: Es Es un gusa gusano no apl aplan anaa o en forma de Adulto: hoj hoja (Fig. Nº 54), de apariencia carnosa y color café claro, con extremo anterior saliente en forma de cono. Mide apro aproxi xima mada dame ment ntee de de 2 a 3 cm de largo por 1 cm de ancho y en la parte anterior presenta 2 ventosas. Son hermafroditas y los los órg órgan anos os geni genita tale less mas mascu cullino y femenino (vitelaria), están muy desarrollados, ramificados y poseen un rificio o poro  genital cercano a la vent sa ventral. El aparato digestivo consiste en faringe, esófago y el ciego dividido en dos tubos ramificados.

PRACTICA Nº7 BIOHELMINT S Y BIOHELMINTIASIS PP RACTICA   Nº7: 7: BIO BIOHELMINTIASIS. HELMINTIASIS.

Fig. Nº 55: Huevo de F. hepática. (Disponible en: www.gefor.4t.com/.../fasci lahepatica11.jpg)

Metodología de Análisis nálisis copro--parasit parasitológico copro -parasito El modo más frecuente de establecer el diagnóstico etiológico es or el hallazgo de los huevos en bilis, cont nido duodenal o materias fecales. Existen iagnósticos falsos positivos cuando se encuentran huevos al coprológico, en pacientes que han ingerido hígado crudo o mal cocido, con los  gusanos; en estos casos el hombre no sufre la infección sino que elimina los huevos ingeridos. Los parásitos adultos se ncuentran en el acto acto qui quirú rúrg rgic icoo y s identificación confirma la parasitosis. En el diagnóstico de la enfermedad son útiles los estudios radi lógicos, pruebas hepáticas, pruebas inm nológicas, tales como ELISA, hemaglutin ción indirecta y reacc rea ccion iones es de precip precipita itaci cióón. Recientemente se ha utilizado pruebas modernas como iden identi tifi fica caci ción ón de de antí antíge gen n s y de complejos inmunes circulantes. mansoni Schistosoma mansoni 

Huevos: Son ovalados y con un opérculo o tapa en uno de sus extremos, miden aproximadamente 150 ecas en su longitud longitud mayor, mayor, Tiene Tienen n colo colo café debido a la pigmentación biliar (Fig. º 55).

Adultos: Son alargados, ci índricos y curvos Adultos: hacia la parte posterior, iden entre 1 y 2 cm en prom promed edio io,, la la hem hembbra es más larga y delgada delgada que que el macho. macho. Est Est último posee

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Realizado por: Realizado po por: Liic Yot Yotsa Garc ía. U.C.: U.C.: Micr Mi crob obio logí a. Pr rogram ogra rama Me Medic 2009 R eali alizado ado por: r: Lic L Yo Y otsa eth Saúl García. arcía. M Microb Mic iicrobi crrobiol oobiolo bio biiolo oología logía. íía. a. Prog P Pro  ro ram ra rama ma Medi M edic dic na UNEFM. 2009 

MICROBIOLOGIA I

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una apertura longitudinal llamada canal  ginecóforo, en el cual aloja la hembra en determinados períodos. Ambos sexos presentan 2 ventosas en la parte anterior, una en el extremo o ventosa oral y la otra a cort cortaa dis dista tanc ncia ia,, lla llama mada da vent vent sa ventral.

Estadios larvales: Miracidio: Tiene forma ovalada y está cubierto de cilias que le ermiten moverse activamente en el agua para buscar el intermediario (Fig. Nº58), al cual penetran activamente a través de su cuerpo.

S. m  manosini. anosini. Ad Fig. Nº 56: S. Ad ltos macho y hembra. 40X

Fig. Nº 58: Miracidio e S. mansoni. Microscopio óptico 40X

Huevos Huevos:: Son grande grandes, s, mide mide en promedio Huevos: de 100 100 a 150 150 mic micra ras, s, s n ovalados y pres presen enta tan n una una car carac acte terí ríst stiica diferencial import important antee que consis consiste te en una espina lateral grande (Fig.Nº 57).

Fig. Nº 57: Huevo de S. man soni. soni . La flecha señala la la espina espina lateral lateral cara terístico de la señala especie. especie. (Disponible en: www.seimc.org/control/revi_Para/esqui_img.gif a/esqui_img.gif )  )

Los Los hué huéspedes inte ntermediarios, pertenecen a var varios géner neros de carac les pulmonados, según la especie de Schis osoma , como por ejemplo, Biomphalaria labrata para S. mansoni . En los los tej tejid idos os de est est s caracoles, el miracidio se transforma en una segunda forma larvaria in óvil, llamada esporoquiste madre o primario, el cual aument aumentaa de tamaño tamaño y s reproduce para dar dar ori orige gen n a una una segu segun n a generación de esporoquistes hijos o s cundarios. Estos últim últimos os tie tiene nen n movi movimi mien entt s e invaden otros sitios de del caracacol y for an en su interior las cercarías cercarías que salen salen de molusco (Fig. Nº 59) 59). Estas son alarga as y de cola bifurcada, nadan li remente hasta encontrar el huésped defi itivo (Humano),

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al cual cual se adhi adhiere eren n y penet penetra ran a través de la pie piel uti utillizan izando do sec secreci recion onees lít líticas.

Fig. Nº 59: Cercaria de de . manson  manso ni  n n i  i .  Microscopi Micros copioo óptico óptic Microscopio ópticoo. 40X

Metodología de Análisis  copro copro--parasitoló copro -parasitoló ico El método más comúnmente usado para la comprobación de la par sitosis, es la identificación de los huevos e S. mansoni  en las materi materias as fecale fecales. s. Este método no siempre es suficiente para comprobar el diagnostico, pues la cantidad de huevos que salen al al exterior exterior es escasa. escasa. Po Por lo anterior se recomienda los métodos de concentración, especialmente la técnica de ato-Katz. En la esquistosomosis intestinal es útil la biopsia de mucosa mucosa rectal rectal,, para para lo cual se toma una porción pequeña del tejido, para observar directamente al microscopio entre lámina y laminilla. Las pruebas inmunoló icas pueden contribuir al diagnóstico. Las más utilizadas son son int intra rade derm rmor orre reac aciión, ón, p ra determinar hipers hipersens ensibi ibilid lidad ad inm inmedi ediat at , fijación de complemento e Inmu ofluorescencia indirecta, estas dos últimas uy especificas. También se se ha han em empleado otras reacciones muy específicas como ELISA.

PRACTICA Nº7 Nº7: 7: BIOHE BI BIO OHELM HELM HELMIN INTO TO Y BIOHELMINTIASIS BIOHELMINTIASIS. PP RACTICA   HELMINTIASIS.

Morf Mo Morfo rfol rfolo olog logí ogía gía íaa del de dell hosp ho hos hospe sped peda edad dad ad dor intermediario de S. mansoni  mansoni:  ::  Biomph laria glabrata . Presenta concha arrollada en espiral, plana,  generalmente con una depresión umbilical en cada cara; animales con tentáculos cil cilíndr índric icoos, lar largos gos y fi finos nos (Fig. Nº 60). En cuanto a su mo fología interna, pre present sentan an apar aparat atoo dij dijest estivo, respiratorio, cir circula culattorio orio y una una enor enorme glándula, el hepato-páncreas, donde ocurre la mayor parte del ciclo de Schist  soma. El aparato  genital es hermafrodita, con una porción poster posterior ior común común (ovot (ovotest estiis) y una porción anterior propia para cada sexo, que se abre en orificios separados.

Fig. Nº 60: Biomphalaria labrata. Hospedador intermediario de S. mansoni

Filarias: las filarias onstituyen un  grupo de enfermedades en el humano y en los animales, provocadas por parásitos nemátodes de la super-familia super-familia Filarioidea , a los cual s se les llama comúnmente comúnmente filarias. filarias Onchocerca volvulus: volvulus: 

Adul Ad ulto to:: Son Son gusa gusano noss bla blanc ncos, opalescentes y Adulto: trasnparent trasnparentes es (Fig. Nº 61), con estriaciones circ circul ular ares es en en su cut cutíc ícul ul . Se encuentran fuertemente entrelazados en el interior del nód nódulo ulo de tejido conjun ivo del humano infestado (huésped defini ivo). Los machos miden de 2 a 4 cm de lo  gitud por 150 a 200 µm de ancho. La extr midad del macho presenta una fu fuerte cu curv tura ventral. Las hembras miden 30-50 m por 250-400 µm. Dentro de la cav dad de este microorganismo se encuentran numerosas microfilarias, que fi almente serán liberadas a los tejidos ircundantes. Las microfilarias de O. olvulus   no se encuentran en en sangre periférica circulante.

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MICROBIOLOGIA I

Fig. Nº 61: Adultos macho y hembra de O. volvulus . Disponible en: www.facmed.unam.mx/.../onchoc rcaadultsWHO.jp g

Fig. N 2: Corte Histopatológico de Fig. Nºº 6 62: Oncoce Oncocerco rcoma. ma. TTeñido Teñ eñ do co con HE. 50X Oncocercoma. ñid ñiiido H--E.

PRACTICA Nº7 PP RACTICA   Nº7: 7: BIOHELMINTOS BIOHELMINTOS BIOHELMINTIASIS BIOHELMINTIASIS. HELMINTIASIS.

morfológicas. La muestra se debe tomar de piel piel cerc cercana ana a los los nódul nóduloo , si estos existen. En caso caso de no no habe habe nódulos debe preferirse la región e capular, cuello, prom promin inen enccias ias óse óseas as,, co co o la piel de la cresta iliaca y piel de musl os. b) B Biop Biioopsi pssia ia ddee n nódu nó óddu ulo: El estudio anotomo anotomopat patoló ológic gico, o, tant macro como micr micros oscó cópi pico co pue puede de rev revel el r la presencia de parásitos adultos. c) Reacciones inmu inmunológicas: Las nológicas: reacciones inmunológicas para identificar anticuerpos son poco specíficas, pues existe existe una una gran gran homolog homologíí antigénica entre O. volvulus , las otras filarias y varios helmintos. Por esta razón no se usan para diagnostico diagnostico.. Cada Cada vez más se perfeccionan pruebas para demo trar antígenos parasitarios, usando anticuerpos mono monocclona lonalles o pol polic icllonales, aunque en la actualidad la sensibilidad  y la especificidad no son muy buenas. d) Observación de micro ilarias en el ojo: Utilizando aparatos o talmológicos se pued puedeen detec etecta tarr micro icrofi fila la ias móviles en la cámara anterior. MORFOLOGIA EXTERNA DE DE SIMULIDOS Adultos: los simúlidos o je enes son insectos Adultos: pequeñ pequeños, os, robust robustos os de de 1- mm de tamaño, que que se se re reconoc onoceen fác fácil ilm mente por su tórax fuertemente jorobado, de ntenas pequeñas en forma forma de cuer cuernos nos,, de patas cortas y fuertes que le dan el asp cto característico de un pequeño pequeño búfalo búfalo (Fig. Nº 63 y 64).

Metodología de Análisis copro--parasitoló copro -parasitoló ico a) Biopsia de piel: Es un étodo sencillo que toma la parte sup rficial de la epidermis, lo cual puede realizarse sin ane anestesia, ut utilizando una una cuchilla de afeitar, tije tijera rass cur curva vass o un quer querat atootómo. El material debe partirse en pequeños fragmentos por medio de agujas. También se utiliza la aplicación directa del porta-objetos a la epidermis expuesta, después del corte. Las preparaciones se observan con solución sali salina na entr entree lámi lámina na y lam lamin iniilla, empleando objetivo de 10X, para buscar las micr microfi ofila lari rias as móv móvil iles es.. Est s preparados también también se pueden pueden colorea colorear con Wright, Giemsa y hematoxilina, lo cual permite identificar la especie por las características

Fig. Nº 63: Adulto de Simulium sp. Disponible en: n: www.monmsci.net/~kb ldwin/DipteraImages/1.j g

La cabeza es bastante li re, aparentando nacer de la parte antero entral del tórax. Los ojos compuestos, u iformes, en las hembras están separados por delante en la línea media y en los mac os se unen sobre

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Realizado por: Realizado po porr:: L Lic Yotsa Yootsa eth García Microbiol Mic robiologí biología. gía. Programa Prog Program ograma Medici Medic Medici 2009 R ealizado por: ic Y eth Saúl Saúl García. arcía arc arcía. ía.. U.C. U. U.C.: C.:: Micr Mi Microbiolo Micro crob obio biolo iolo loogía. ía. íaa.. Pro Pr Pro  o rama ra rama ma Medi Me edici dici cina UNEFM. 2009 

el vér vérte tex. x. Est Estaa cara caract cter erís ísti tica sirve para separar fácilmente los dos se os. El tórax es arqueado, con apariencia de oroba. Las alas son a chas, cortas, transparentes, en general incoloras, de forma ac acorazonada o triang lar, sin pelos o escamas visibles. Las patas son cortas y fuertes, fuertes, tarsos tarsos de 5 segmen segmento tos que terminan en un par de uñas, provistas o no de dientes basales. El abdomen es corto y o alado, con 9 segm segmen ento tos. s. En En los los seg segme ment nt s III a VII se observa los espiráculos abiertos, bien quitinizados.

Fig. N 64: Esquema repres ntativo de un Adulto de Simulium sp. Nótese forma  jorobada del tórax. Tomado de: www.bumblee.o  g. g.

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Realizado por: Realizado po por: Liic Yot Yotsa Saú Saúl Garc García. U.C.: Microb Mic robiol iologí Prog ogram Med 2009 R eali alizado ado por: r: Lic L Yo Y otsa eth eth Saúl Sa úll García. arcía. U.C. U. U.C.: C.:: Micr Mi Microbiol crob obio obiolo iolo loogía. o ía. íaa.. Pro Pr Pro  o rama ra rama ma Medic Medi Me Medic dic ic na UNEFM. 2009 

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Microbiologí a. Programa 2009  Realizado Realizado por: or: Lic Yotsabeth Yotsabeth Saúl García. arcía. U.C.: U.C.: Microbiología. Microbiol Mic Microbiolo robioloo ía. Pro Pro  rama Medicina Medi Medicina cina UNEFM. UNEF UNEFM. M. 2009