DAFTAR ISI DAFTAR ISI........................................... ISI................................................................. ............................................ ............................................ .......................................1 .................1 KATA PENGANTAR............................. PENGANTAR................................................... ............................................ ............................................ .......................................3 .................3 BAB I STRUKTUR, PENGGOLONGAN PENGGOLONGAN DAN PENOMORAN TANNIN ........................................ 4 1.1.
Struktur Umum Tanin ........................................................... ............................................................................................................. .................................................. 4
1.2.
Penggolongan Penggolongan Tannin ........................................................... ............................................................................................................. .................................................. 5
1.2.1.
Karakteristik tannin ................................................................... ......................................................................................................... ...................................... 5
1.2.2.
Penggolongan Penggolongan tanin tumbuhan ............................................................. ........................................................................................ ........................... 5
1.3.
Penomoran Golongan Tanin ............................................................. ................................................................................................... ...................................... 6
BAB II PENAMAAN TANNIN .................................................................................. ............................................................................................................. ........................... 7 2.1.
Tanin Terkondensasi Terkondensasi ............................................................. ............................................................................................................... .................................................. 7
2.2.
Tanin Terhidrolisis ................................................................. ................................................................................................................ ............................................... 12
2.2.1.
Gallotanin........................................................... ...................................................................................................................... ........................................................... 12
2.2.2.
Elagitanin ........................................................... ...................................................................................................................... ........................................................... 13
2.3.
Prototanin (Pseudotanin)................................................................... ....................................................................................................... .................................... 15
BAB III CONTOH STRUKTUR GOLONGAN GOLONGAN TANNIN ............................................................... .................................................................. ... 16 3.1. Tanin terhidrolisis ........................................................................................................... ...................................................................................................................... ........... 16 3.1.1.
Gallotannin......................................................... .................................................................................................................... ........................................................... 16
3.1.2.
Ellagitannins .................................................................. ................................................................................................................. ............................................... 17
3.2.
Tanin terkondensasi terkondensasi .............................................................. .............................................................................................................. ................................................ 17
3.3.
Tanin kompleks.......................................................... ..................................................................................................................... ........................................................... 18
BAB IV SUMBER TANNIN ............................................................................................................... 19 4.1.
Lokasi Tannin di Jaringan Tumbuhan ......................................................... .................................................................................. ......................... 19
4.2.
Sumber Tannin pada Tanaman Tanaman ......................................................... ............................................................................................. .................................... 19
4.2.1.
Tannin Terkondensasi Terkondensasi ............................................................... ................................................................................................... .................................... 19
4.2.2.
Tannin Terhidrolisis .................................................................. ...................................................................................................... .................................... 21
ii.
Prototanin (Pseudotanin)................................................................... ....................................................................................................... .................................... 23
BAB V SIFAT FISIKA KIMIA TANNIN ........................................................................................... ........................................................................................... 24 5.1.
Pemerian Tannin ........................................................ ................................................................................................................... ........................................................... 24
5.2.
Tanin Terkondensasi Terkondensasi ............................................................. ............................................................................................................. ................................................ 25
5.3.
Tanin Terhidrolisis ................................................................. ................................................................................................................ ............................................... 25
BAB VI BIOAKTIVITAS BIOAKTIVITAS TANNIN TANNIN ................................................................ .................................................................................................... .................................... 26 6.1.
Gallotannins ............................................................... .......................................................................................................................... ........................................................... 27
6.2.
Ellagitannin ................................................................. ........................................................................................................................... .......................................................... 28 1
6.2.1.
Antidibetes ......................................................... .................................................................................................................... ........................................................... 29
6.2.2.
Anti-mikrobia dan virus ............................................................ ................................................................................................ .................................... 31
6.2.3.
Antihipertensi................................................................. ................................................................................................................ ............................................... 31
6.2.4.
Anti-oksidan................................................................... .................................................................................................................. ............................................... 32
6.2.5.
Anti kanker/tumor kanker/tumor ......................................................... ......................................................................................................... ................................................ 33
6.3.
Tanin kompleks.......................................................... ..................................................................................................................... ........................................................... 34
6.4.
Tanin Terkondensasi Terkondensasi ............................................................. ............................................................................................................. ................................................ 35
BAB VII HUBUNGAN HUBUNGAN STRUKTUR AKTIVITAS TANNIN ........................................................... 37 7.1.
Anti-Diabetes ............................................................. ........................................................................................................................ ........................................................... 37
7.2.
Anti-Mikroba dan Anti Virus............................................................ ................................................................................................ .................................... 38
7.3.
Anti-Oksidan.............................................................. ......................................................................................................................... ........................................................... 39
7.4.
Anti Tumor/Kanker Tumor/Kanker ............................................................... ............................................................................................................... ................................................ 39
BAB VIII BIOSINTESA TANNIN ............................................................................. ...................................................................................................... ......................... 40 8.1.
Biosintesa Tanin Terkondensasi Terkondensasi (Proanthocyanidins (Proanthocyanidins (PAs) ................................................. 42
8.2.
Biosintesa Tanin Terhidrolisis .......................................................... .............................................................................................. .................................... 43
8.2.1.
Jalur biosintesa Ellagitanin .................................................................. ........................................................................................... ......................... 43
8.2.2.
Jalur biosintesa Gallotanin ................................................................... ............................................................................................ ......................... 45
BAB IX ISOLASI ISOLASI TANIN ................................................................................................................... ................................................................................................................... 46 46 9.1.
Pemilihan Metoda Ekstraksi Ekstraksi ............................................................. ................................................................................................. .................................... 46
9.2.
Pemilihan Eluen Dan Metode Pemisahan ............................................................... ............................................................................. .............. 48
9.2.1. 9.2.2. 9.2.3.
KLT Analitik.................................................................. ................................................................................................................. ............................................... 48 KLT Preparatif ................................................................... .................................................................................................................. ............................................... 49 Kromatografi Kromatografi kolom.................................................................. ...................................................................................................... .................................... 50
BAB X KARAKTER KARAKTER DAN IDENTIFIKASI ISOLAT TANIN .......................................................... 52 10.1.
Identifikasi Tanin .............................................................. .............................................................................................................. ................................................ 52
10.2.
Identikasi Tanin Terhidrolisis .................................................................. ........................................................................................... ......................... 52
10.3.
Identifikasi Elagitanin ................................................................... ....................................................................................................... .................................... 52
10.4.
Identikasi Tanin Tanin Tekondensasi Tekondensasi................................................................... ......................................................................................... ...................... 53
10.5.
Identikasi untuk Membedakan Membedakan Tanin Terhidrolisis dan Tanin Terkondensasi Terkondensasi ................. 53
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................................ ........................................................................................................................... ... 54
2
KATA PENGANTAR Kami panjatkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga Makalah Mata Kuliah Fitokimia mengenai Tannin dapat diselesaikan. Makalah ini disusun untuk melengkapi tugas dalam mata kuliah Fitokimia Pada kesempatan ini, kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dra. Rakhmawati, M.Si yang telah membiming kami dalam menyusun makalah ini. Kami menyadari bahwa makalah ini masih banyak kekurangan. Oleh sebab itu, saran dan kritik sangat kami harapkan. Kami berharap makalah ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
3
BAB I STRUKTUR, PENGGOLONGAN PENGGOLONGAN DAN PENOMORAN PENOMORAN TANNIN Tanin merupakan polifenol dan sering disebut sebagai polifenol tanaman. Hal yang membedakan tanin dengan tanaman polifenol lainnya adalah ikatan dengan protein, senyawa dasarnya, besarnya ukuran senyawa,aktivitas antioksidannya, dan lain-lain (Okuda & Ito, 2011). Bate-Smith mendefinisikan tanin sebagai senyawa fenolik yang memiliki bobot molekul antara 500-3000 yang memilki reaksi fenolik dan mempunyai sifat spesial seperti kemampuan untuk menegndapkan alkaloid, gelatin dan protein lainnya (Hagerman, 2002). 1.1.Struktur Umum Tanin
Inti utama tanin ada 2 golongan yakni tanin terkondensasi adalah flavan, pada umumnya flavan 3-ol. Flavan merupakan grup metabolit yang terdiri dari sistem cincin heterosiklik yang merupakan turunan dari fenilalanin (cincin B), dan poliketida (cincin A), dan yang kedua adalah Tanin terhidrolisis dimana merupakan tannin yang memiliki gugus poli-ol dimana D-Glukosa bertindak sebagai inti dari struktur tannin tersebut. Grup hidroksil dari tannin tersebut teresterifikasi seluruhnya atau sebagaian dengan grup fenolik seperti asam galat dan asam elagit. Jika berikatan dengan asam galat disebut Gallotanin sedangkan bila berikatan dengan asam elagit disebut ellagittanin. Jika tannin terhidrolisis tersebut dihidrolisis dengan asam atau basa lemah dapat terbentuk asam fenolik dan karbohidrat.(Hagerman, 2002).
4
1.2.Penggolongan 1.2.Penggolongan Tannin
1.2.1. Karakteristik tannin a. Komponen oligomerik dengan struktur yang multiple dengan gugus fenol bebas. b. Larut air dengan berat molekul antara 500 – 500 – 20.000 20.000 c. Mengandung gugus hidroksi dan gugus lain karboksilat sehingga membentuk komplek kuat dengan protein dan makromolekul lain. d. Merupakan senyawa kompleks dalam bentuk campuran polifenol yang sukar dipisahkan sehingga sukar mengkristal. 1.2.2. Penggolongan tanin tumbuhan 1. Tanin terkondensasi (Condensed tannin/ proantosianidin) 2. Tanin terhidrolisis (Hidrolysable tannin/ pyrogallol) 3. Prototanin (Pseudotanin)
5
Tata Nama
Struktur
BM
Endapan Protein
Tanin
Oligomer katekin dan flavan-
1000-3000
++++
terkondensasi
3,4-diol
Tanin
terhidrolisis
Ester asam galat dan
1000-1500
+++++
1000-3000
+++++
glukosa
Ester
asam
heksahidroksidifenat dan glukosa Prototanin
Katekin (dan galokatekin)
200-600
±
Flavan-3,4-diol
1.3.Penomoran Golongan Tanin
Inti utama tannin adalah flavan, pada umumnya flavan 3-ol. Flavan merupakan grup metabolit yang terdiri dari sistem cincin heterosiklik yang merupakan turunan dari fenilalanin (cincin B), dan poliketida (cincin A). Penomoran tannin dimulai dari atom oksigen yang berada pada cincin C dan berlanjut searah jarum jam menuju cincin A. Pada cincin B, penomoran dimulai dari atom karbon yang berikatan dengan cincin C (atom karbon nomor 2) searah jarum jam dan penomorannya diberi tanda baca aksen (‘) (Hagerman, 2002).
6
BAB II PENAMAAN TANNIN Penamaan golongan tanin dilakukan berdasarkan reaksi hidrolitik dan sifat inti fenolik yang terlibat dalam struktur tanin. Sebagian besar golongan tanin merupakan senyawa dengan berat molekul tinggi yang terbentuk dari polimeris asi polifenol sederhana (memiliki 2 sampai 3 gugus hidroksil fenolik pada cincin fenil). 2.1.Tanin Terkondensasi Tanin terkondensasi atau flavolan secara biosintesis dapat dianggap terbentuk dengan
cara kondensasi katekin tunggal (atau galokatekin) yang membentuk senyawa dimer dan kemudian oligomer yang lebih tinggi. Nama lain tannin terkondensasi adalah proantosianidin, karena bila direaksikan dengan asam dan dipanaskan, beberapa ikatan karbon-karbon penghubung satuan terputus dan menghasilkan monomer antosianidin. Tanin terkondensasi merupakan kondensasi dari flavanol (flavan-3-ol). Yang mana terbagi menjadi dua : a. Dalam bentuk cis disebut (-)-epicatechin b. Dalam bentuk trans disebut (+)-catechin.
(sumber: Tanin Chemistry hal.3) Tanin terkondensasi ditandai dengan adanya ikatan karbon-karbon (C-C) antara atom C8 dan C4 pada cincin A, namun ada yang ditemukan pada ikatan rangkap antara C6 dan C4. Empat mode umum dari pasangan itu diilustrasikan sebagai dimer terisolasi oleh Haslam, dan awalnya bernama B-1, B-2, B-3 dan B-4. Selain itu terkait dimer yang dihubungkan oleh C6 unit terminal dan C4 dari perpanjangan telah diisolasi. Terdapat empat pola polimerisasi menurut Ann Hagermann yaitu:
7
dengan struktur lainnya sebagai berikut:
B-5
B-6
A-1
A-2
B-7
C-1
B-8
C-2
8
Tanin terkondensasi dapat terbentuk hasil polimerisasi yang terjadi pada ikatan 4,8 seperti pada Sorghum procyanidin. Polimer yang memiliki ikatan 4,6 atau bercabang pada ikatan 4,6 dan 4,8 sekaligus jarang ditemukan.
Sorghum procyanidin epicatechin- [(4β ->8)-epicatechin]15-(4β ->8)-catechin Proanthocyanidin adalah kelas khusus fitonutrien flavonoid yang disintesis ketika epicatechin dan cathecin molekul yang dipotong. Proanthocyanidin dapat terdiri dari 2-50 unit flavonoid dan Proanthocyanidin mempunyai struktur kompleks karena unit flavonoid yang menyusunnya dapat berbeda pada beberapa substituen dan letak dari ikatan antar flavannya.
9
Polimer dari katekin dan epikatekin menghasilkan sianidin sehingga dinamakan dengan prosianidin. Polimer dari galokatekin dan epigalokatekin menghasilkan delfinidin. Polimer dari flavan-3-ol yang mempunyai monosubtitusi yang biasanya jarang menghasilkan pelargonidin. Kelompok yang penting pada tanin terkondensasi adalah polimer dari 5-deoksi-flavan-3-ols, percabangan biasanya umum pada tanin ini disebabkan oleh reaktivitas dari cincin 5-deoksi. Terkadang
flavan-3,4-diols
proanthocyanidins.
atau
Flavan-3,4-diols
luecoanthocyanidins merupakan
dibingungkan
falvonoid
monomerik
dengan yang
menghasilkan anthocyanidins dengan cara pemanasan dan penambahan asam. Reaksi tersebut memiliki kesamaan dengan tannin terkondensasi, namun tidak bereaksi dengan protein membentuk kompleks precipitasi. Sedangkan pada Flavan-4-ols unik dengan kelabilannya yaitu menghasilkan anthocyanidins dengan penambahan asam alkohol pada suhu kamar.
10
11
2.2.Tanin Terhidrolisis Tanin terhidrolisis adalah turunan dari asam galat (3,4,5-trohidroksi asam benzoat).
Asam galat diesterifikasi menjadi inti polyol dan gugus galoyl dapat diesterifikasi atau dioksidasi lebih lanjut secara silang menjadi tanin terhidrolisis yang lebih kompleks. Tannin terhidrolisa dibedakan menjadi dua yaitu: 2.2.1. Gallotanin
Merupakan bentuk paling sederhana dari tanin terhidrolisis yang merupakan ester polygalloyl sederhana dari glukosa dan memiliki berat molekul antara 10001500. Bentuk awal dari gallotanin adalah glukosa pentagalloyl (β-1,2,3,4,6 pentagalloyl-O-D-glucose). Pentagalloyl glukosa (PGG) memiliki 5 cincin ester yang identik dan melibatkan kelompok hidroksil alifatis dari inti gula.
12
PGG dapat dibuat dari beberapa asam tannin komersial melalui metanolisis dalam dapar asetat. Supaya preparasi berhasil, asam tannat harus mempunyai PGG sebagai inti ester, seperti pada preparasi Chinese atau Sumac gallotannin. Kebanyakan glukosa gallotanin berupa alkohol, polyol lainnya termasuk glucitol, hammamelose, asam shikimat, asam quinat dan quercitol.
2.2.2. Elagitanin
Kopling oksidatif dari gugus gallol dapat merubah gallotannins menjadi ellagitannins. ellagitannins sederhana adalah ester dari asam hexahydroxydiphenat (HHDP). HHDP secara spontan mengalami laktonisasi menjadi asam ellagat dalam larutan yang encer.
13
Ellagitanin juga dapat terbentuk melalui cincin pembukaan. Contohnya terjadi pada family asuarin, casuarinin, castalgin, castlin, stachyurin, vescalagin dan bentuk vescalin.
Ellagitannin dapat mengalami oksidasi berpasangan intermolecular dengan tannin terhidrolisa yang lain dan membentuk dimer. Misalnya, pada beberapa tanaman euforbs (contohnya Euphorbia watanabei) geraniin terkondensasi oksidasi dengan PGG membentuk euphrobins yang bervariasi, terkarakterisasi oleh gugus valoneoyl.
14
2.3.Prototanin (Pseudotanin) Pseudotannin termasuk golongan senyawa fenolik sederhana. Berat molekul
prototanin lebih rendah daripada tanin pada umumnya dan perbedaannya hanya pada struktur Pseudotanin banyak ditemukan dalam tanaman terutama pada jaringan dan selsel mati.
15
BAB III CONTOH STRUKTUR GOLONGAN TANNIN Berdasarkan karateristik struktur tannin dapat di klasifikan menjadi tiga macam : Tannin terhidrolisis (Gallotannins, ellagitannins), Tannin terkondensasi dan tannin kompleks . 3.1. Tanin terhidrolisis
Tanin terhidrolisis adalah : ester asam gula dan fenolat atau turunannya. 3.1.1. Gallotannin Gallotannin adalah : polyester asam galat, karena hasil hidrolisisnya adalah asam galat. atau semua tannin yang memiliki unit galoil atau turunan metadepsidik dan dipantulkan menjadi kebalikan poliol, katekin- atau unit triterpen. Contoh : Myrobalan, galls Cina ( Rhus chinensis), galls Turki (Quercus infectoria) Dhava (axelwood), Teri-pods (Caesalpinia digyna), beberapa daun maple (Acer), kulit penyihir Hazel ( Hamamelis virginiana), Oak (Quercus rubra), beberapa spesies Chestnut (Castanea spp.)
16
3.1.2. Ellagitannins Ellagitannins adalah grup ester hexahidroksildifenil, meghasilkan asam ellagic dari hidrolisisnya atau tannin yang memiliki 2 unit galoil yang ikatan C-C digabungkan satu sama lain dan tidak mengandung unit katekin yang terhubung secara glikosidik. Contoh : myrobalan (Terminalia chebula), kulit buah delima ( Punica granatum), rose-apple (Syzygium aqueum) etc.
3.2. Tanin terkondensasi Tanin terkondensasi adalah semua oligomerik dan polimerik proantosianidin yang
terbentuk dari ikatan C-4 dari salah satu katekin dengan C-8 atau C-6 monomer katekin selanjutnya.
17
3.3. Tanin kompleks Tanin Kompleks adalah tannin yang memiliki unit katekin yang terikat secara
glikosidik dengan unit gallotanin atau ellagitanin. Contoh : acutissimin. Memiliki unit flavogallonil (unit non-anhidroksitrifenol) yang terikat secara glukosidik .
18
BAB IV SUMBER TANNIN 4.1. Lokasi Tannin di Jaringan Tumbuhan Lokasi Tannin di Jaringan Tumbuhan sebagai berikut:
1. Bud tissues – umumnya terletak di bagian luar dari jaringan tunas, sebagai proteksi terhadap dingin. 2. Leaf tissues – umumnya terletak di bagian atas epidermis. Namun pada tamanan hijau, tannin tersebar merata di seluruh jaringan daun. Tannin ini berfungsi untuk mengurangi palatabilitas sehingga sebagai proteksi dari predator. 3. Root tissues – umumnya terletak di hypodermis (bagian bawah epidermis), berfungsi sebagai penghambat kimiawi terhadap penetrasi dan kolonisasi akar oleh tanaman pathogen. 4. Seed tissues – terletak di lapisan antara integumen luar dan lapisan aleuronic,memiliki sifat allophatic dan bactericidal properties. 5. Stem tissues – sering ditemukan di area pertumbuhan aktif dari pohon, seperti floem sekunder dan xylem, dan lapisan antara epidermis dan korteks. Tannin ini berperan dalam regulasi pertumbuhan jaringan, serta dapat berkontribusi dalam sistem pertahanan (daya tahan) dari kayu dengan menghambat aktivitas mikroba (Ashok, 2012). 4.2. Sumber Tannin pada Tanaman
4.2.1. Tannin Terkondensasi a. Vitisvinifera L.(Vitaceae) Bagianbijibuah mengandung Procyanidin B1 (Sano, 2003)
19
b. Cinnamomum cassia(Lauraceae) Bagiankulitkayu mengandung Procyanidin B2 (Morimoto, Nonaka, & Nishioka, 1986)
c. Theobroma cacao (Malvaceae) Bagianbijibuahmengandung Proanthocyanidin C1 (Natsume & dkk)
d. Guazumaulmifolia(Malvaceae) Bagiankulitkayu mengandung Proanthocyanin C2 (Hor, Henrich, & Rimpler)
e. Camellia sinensis( Theaceae) BagiandauntehmengandungCatechin (C), Gallo-catechin (GC), Epicatechin(EC), Epigallo-catechin(EGC),
Epicatechin-
gallate(ECG),
Epigallo-catechin-
gallate(EGCG) (Shahat & Marzouk, 2013)
20
4.2.2. Tannin Terhidrolisis 1. Gallotannin a. Acer ginnala (Lauraceae) Bagian daun tanaman maple mengandung acertannin (E. & T., 2017) b. Hamamelis virginiana(Hamamelidaceae) Bagian daun dan korteks dari tanaman witch hazel mengandung hamamellitannin (Habtemarian, 2001)
c. Phyllanthus emblica(Phyllanthaceae) Bagian buah dari tanaman malaka ini mengandung asam chebulinat (Saijo, Nonaka, & Itsuo, 1998)
21
2. Ellagitannin a. Punica granatum(Punicaceae) Pada buah tanaman delima mengandung punicalagin (Satomi & dkk, 1993)
b. Casuarina strictaAit. (Casuarinaceae) Bagiandaun tanaman mengandung pedunculagin (Bao & dkk, 2012)
c. Syzyngiumaromaticum(Myrtaceae) Bagiankuncupbunga mengandung Tellimagrandin II (Okuda & dkk, 1982)
22
ii. Prototanin (Pseudotanin) a. Phyllostachys edulis(Poaceae) Pada bagian tunas tanamanmengandungAsam Kloregenic
Chlorogenic Acid (1S,3R,4R,5R)-3-{[(2Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2enoyl]oxy}-1,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid
b. Areca catechu(Araucariaceae) Pada bagian biji tanaman mengandung catechin
23
BAB V SIFAT FISIKA KIMIA TANNIN 5.1. Pemerian Tannin
Massa ringan mengkilap atau serbuk halus atau berlapis-lapis seperti kulit kerang; putih; kekuning-kuningan atau kecoklatan muda tergantung dari sumber tannin tersebut.; bau khas; rasa astringen kuat. Warna tannin akan menjadi gelap apabila terkena cahaya langsung atau dibiarkan di udara terbuka.. Tanin larut dalam tidak kurang dari 1 bagian air dan alkohol (etanol 95 % ) P, sangat sukar larut dalam kloroform P dan dalam ether P: Sangat mudah larut dalam aseton, larut perlahan – lahan dalam 1 bagian gliserol P. Tanin tidak bisa bercampur dengan asam, basa, garam-garam besi, perak, albumin putih, gelatin, oksidator. Protein-protein dapat diendapkan oleh tanin dan berkombinasi dengan protein yang mengakibatkan tanin tahan terhadap enzim-enzim pemecah protein. Dengan senyawa garam-garam besi (III) memberikan endapan yang berwarna hijau kecoklatan atau biru hitam. Sedangkan dengan kalium feri sianida atau ammonium memberikan warna merah tua. Senyawa tannin mempunyai sifat umum sebagai berikut : Sifat fisika dari tannin adalah sebagai berikut : b.
Umumnya tannin mempunyai berat molekul tinggi dan cenderung mudah dioksidasi menjadi suatu polimer, sebagian besar tannin bentuknya amorf dan tidak mempunyai titik leleh.
c.
Jika dilarutkan kedalam air akan membentuk koloid dan memiliki rasa asam dan sepat
d.
Jika dicampur dengan alkaloid dan gelatin akan terjadi endapan
e.
Mengendapkan protein dari larutannya dan bersenyawa dengan protein tersebut sehingga tidak dipengaruhi oleh enzim protiolitik. Sifat kimia dari tannin adalah sebagai berikut :
a.
Merupakan senyawa kompleks dalam bentuk campuran polifenol yang sukar dipisahkan sehingga suka rmengkristal.
b.
Tanin dapat diidentifikasikan dengan kromotografi.
c.
Senyawa fenol dari tannin mempunyai aksi adstrigensia, antiseptic dan pemberi warna.
d.
Tannin memiliki sifat umum, yaitu memiliki gugus phenol dan bersifat koloid, sehingga jika terlarut dalam air bersifat koloid dan asam lemah.
24
e.
Umumnya tannin dapat larut dalam air. Kelarutannya besar dan akan meningkat apabila dilarutkan dalam air panas. Begitu juga tannin akan larut dalam pelarut organic seperti metanol, etanol, aseton dan pelarut organic lainnya.
f.
Tannin akan terurai menjadi pyrogallol, pyrocatechol dan phloroglucinol bila dipanaskan sampai suhu 210 0F-2150F (98,890C-101,670C)
g.
Tannin dapat dihidrolisa oleh asam, basa, dan enzim.
h.
Ikatan kimia yang terjadi antara tannin-protein atau polimer-polimer lainnya terdiri dari ikatan hidrogen, ikatan ionik, dan ikatan kovalen.
5.2. Tanin Terkondensasi
Polaritas : Polar. Kelarutan : Larut dalam air, basa encer, alkohol, gliserol dan aseton, mengendap dengan penambahan logam berat, alkaloid, glikosida, dan gelatin. Kelarutan dalam pelarut organik tergantung strukturnya. Pengaruh asam dan basa : a. Tidak terhidrolisis dalam suasana asam lemah atau basa lemah. b. Pemberian asam atau enzim dapat mengubah tanin terkondensasi menjadi bentuk tak larut yang disebut Phlobapenes (memberikan karakteristik warna merah pada banyak obat ) 5.3. Tanin Terhidrolisis
Bentuk Kristalnya amorf, higroskopik, berwarna coklat kekuningan. Polaritas
: Polar.
Kelarutan : Larut dalam air (terutama dalam air panas) untuk membentuk koloidal yang lebih baik daripada bentuk terlarut, basa encer, alkohol, gliserol, dan aseton, mengendap dengan penambahan logam berat, alkaloid, glikosida, dan gelatin. Tanin terhidrolisa larut dalam pelarut organik, tetapi tidak larut dalam pelarut non-organik. Pengaruh asam dan basah: Terhidrolisis dalam asam lemah atau basa lemah menghasilkan karbohidrat dan asam fenol. Pada kondisi yang sama, proanthocyanidins (tannin terkodensasi) tidak terhidrolisa. Tanin terhidrolisa juga terhidrolisa dengan air panas dan enzim (Hagerman & Butler, 1989).
25
BAB VI BIOAKTIVITAS TANNIN
(Karamali & Ree b., 2001)
26
Tanin secara umum didefinisikan sebagai senyawa polifenol yang memiliki berat molekul cukup tinggi (lebih dari 1000) dan dapat membentuk kompleks dengan protein. Berdasarkan strukturnya, tanin dibedakan menjadi dua kelas yaitu taninterkondensasi (condensed tannins) dan tanin-terhidrolisiskan (hydrolysable tannins).Tanin-terhidrolisiskan merupakan derivat dari asam galat yang teresterkan. Berdasarkan strukturnya, tanin ini dibedakan menjadi dua kelas yaitu, gallotanin dan ellagitanin (Eko, Udhi, & Ahmad, 2003). 6.1. Gallotannins
Gallotannins adalah tanin terhidrolisis yang paling sederhana, mengandung polifenol dan residu poliol.
(Karamali & Ree b., 2001) Peneliti telah melaporkan beberapa jenis spesies dari gallotanins, seperti Acertannin dalam daun dari spesies Maple (Acer), dan hamamelitannin yang ditemukan di kulit kayu hazel ( Hamamelis virgiana), oak (Quercus rubra), dan beberapa spesies chestnut (Castanea sp.)
27
(Hagerman A. E., 2002) Astringen merupakan jenis toner paling kuat, yang ditujukan untuk kulit yang sangat berminyak atau berjerawat. Astringen mengandung 20-60% alkohol, air, dan humektan. Biasanya mengandung witch hazel. Astringen mempunyai sifat yang sangat mengeringkan sehingga tidak dianjurkan digunakan setiap hari. (Berita Terkini: Manfaat dan Jenis Toner Kulit. 2018) Chestnut, tumbuhan dengan ciri batangnya tumbuh sangat lurus dan batangnya besar, serta berdaun kekuningan juga mempunyai khasiat pencegahan dan perawatan penyakit manusia serta obat hewan ternak. Berangan termasuk dalam tanaman hutan. Di wilayah Indonesia berkembang di hutan primer, skunder maupun semak belukar. Sedangkan daunnya terkandung zat samak yang disebut astringent, berguna untuk menghentikan darah pada jaringan yang terluka, anti diare, dan dapat digunakan sebagai pembalut bagian tubuh manusia yang terkilir. Selain itu daunnya juga berkhasiat untuk mengobati demam, batuk rejan, sesak nafas. Caranya bisa dilakukan dengan merebus daun. Sementara pemanfaatan kayu Berangan, jelasnya,
digunakan untuk bahan
bangunan karena kuat dan memiliki sifat tahan dari pengaruh iklim dan cuaca panas maupun hujan. Sususnan jaringan batang yang begitu tersusun tegak lurus menjadikan kayu ini untuk keperluan bahan bangunan, perabotan rumah tangga, dan peralatan permainan anggar. (Riau Pos: Berangan, Si Kacang Keju yang Langka. 2011) 6.2. Ellagitannin
Aktivitas biologi ellagitanin merupakan implikasi dari ikatan antara ellagitanin dengan protein, senyawa dengan berat molekul tinggi, senyawa sederhana, dan ion logam berat. Ikatan tersebut membentuk kompleks senyawa yang dapat menyebabkan 28
perubahan fisiologis dalam sel atau jaringan mahluk hidup. Berbagai penelitian telah dikembangkan untuk mengeksplorasi ellagitanin dan aktivitas biologinya. Pada tahun 1992, baru sekitar 90 senyawa ellagitanin yang diketahui memiliki aktivitas biologi dan diperkirakan masih banyak yang belum terungkap. Aktivitas biologi ellagitanin yang telah diketahui antara lain sebagai anti- diabetes, anti-mikrobia, anti-virus, antihipertensi, anti-oksidan, dan anti-kanker/tumor. Dari sekian banyak penelitian yang telah dilakukan, belum ada yang menunjukkan efek toksik ell agitanin. 6.2.1. Antidibetes Banyak penelitian telah sampai pada isolasi senyawa aktif tumbuhan yang mampu memberikan efek hipoglikemik atau anti-diabetes. Hayashi et al. (2002) berhasil mengisolasi lagerstroemin (5), flosin B (18), dan reginin A (19) dari daun kering bungur (L. speciosa) untuk uji anti-diabetes secara in vitro. Sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak daun bungur memiliki aktifitas hipoglikemik, yang mana ketiga senyawa ellagitanin tersebut diketahui berkaitan dengan efek hipoglikemik ekstrak daun bungur. Efek hipoglikemik yang diberikan oleh ellagitanin daun bungur berupa peningkatan aktifitas transpor glukosa pada jaringan adiposa. Kemampuan lagerstroemin (5) dan flosin B (18) hampir setengah kali kemampuan insulin dalam meningkatkan kecepatan transpor glukosa. Bahkan reginin A (19) menunjukkan aktifitas yang hampir sama dengan insulin. Pada konsentrasi 0,04 mM, kecepatan transpor glukosa meningkat menjadi hampir 0,5 nmol/5 menit, padahal pada kontrol hanya 0,1 nmol/5 menit. Insulin sendiri meningkatkan transpor glukosa sampai 0,48 nmol/5 menit. Ini menunjukkan bahwa ellagitanin khususnya reginin A, dalam daun bungur cukup berpotensi untuk mengantikan peran hormon insulin.
29
30
6.2.2. Anti-mikrobia dan virus Pengujian aktifitas anti-mikrobia terhadap Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Tricophyton mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, T. terreste, Penicillium italicum, Aspergillus fumigatus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Candida albicans, C. glabrata, Candidata krussei, dan Cryptococcus neofarmans, menunjukkan bahwa senyawa-senyawa taninterhidrolisiskan dan flavonoid memiliki variasi aktifitas yang berbeda-beda tergantung jenis senyawa dan jenis mikrobia sasaran. Ellagitanin, corilagin (25), memiliki aktifitas yang sama dengan amfotericin B dan conazole terhadap C. glabrata.
6.2.3. Antihipertensi Geraniin (7), yang dapat ditemukan dalam familia Euphorbiaceae, dapat memberikan efek hipotensif (penurunan tekanan darah) secara signifikan. Tekanan sistolik penderita hipertensi dapat turun kembali normal setelah diberi ekstrak daun kemloko yang mengandung geraniin (7). Efek anti-hipertensi melalui vasodilatasi (pelebaran pembuluh darah) juga ditunjukkan oleh ellagitanin, lambertianin C dan sanguiin H-6 (29) dalam ekstrak Rubus idaeus.
31
6.2.4. Anti-oksidan Anti-oksidan merupakan senyawa yang jika berada pada konsentrasi yang relatif lebih rendah dibandingkan konsentrasi suatu subtrat, maka akan teroksidasi lebih hulu, sehingga dapat mencegah terjadinya oksidasi subtrat tersebut. Tanin dapat menghambat pembentukan oksigen aktif yang dapat menyebabkan oksidasi. Baik gallotanin mau pun ellagitanin, merupakan senyawa anti -oksidan yang cukup berpotensi. Aktifitas anti-oksidatif ellagitanin tersebut berkaitan dengan strukutur kimianya. Naiknya jumlah gugus galloil, berat molekul, dan struktur ortohidroksil meningkatkan aktifitas anti- oksidatif tanin. Lambertianin C dan sanguiin H-6 (29) selain mempengaruhi kesetimbangan ion Ca2+, juga memiliki aktifitas antioksidatif. Aktifitas tersebut akan semakin meningkat jika dua ellagitanin di atas bersama dengan asam askorbat (vitamin C). Metil (S)-flavolgallonat, bersama dengan asam gallat (1), asam elagat (3), punicalagin (20 – 21), dan sebelas senyawa fenol lainnya dalam ekstrak Terminalia myriocarpa mampu menghambat peroksidasi lipid dan pembentukan nitrogen oksida pada hepar tikus.
32
6.2.5.
Anti kanker/tumor Ekstrak air buah Phyllantus emblica dapat mencegah kerusakan kromosom akibat oksigen radikal yang dapat menimbulkan kanker pada tikus. Efek pencegahan ini berkaitan dengan aktifitas anti- oksidatif embli-canin A dan B dan pyrogallol dalam buah Phyllantus. Agrimoniin (33) dari ekstrak Agrimonia pilosa diketahui memiliki aktifitas anti-tumor yang kuat.
Aktivitas biologi ellagitanin merupakan implikasi dari terbentuknya ikatan molekuler antara ellagitanin dengan senyawa lain terutama protein. Adanya ikatan tersebut membentuk kompleks senyawa yang menyebabkan perubahan fisiologis dalam sel atau jaringan mahluk hidup. Beragam penelitian telah dilakukan untuk mempelajari aktivitas biologi ellagitanin, namun diperkirakan masih banyak hal yang belum terungkap. Aktiftas biologis ellagitanin yang telah diketahui antara lain sebagai anti-diabetes, anti-mikrobia dan virus, antihipertensi, anti-oksidan, dan anti-kanker/tumor ( Eko, Udhi, & Ahmad, 2003).
33
6.3. Tanin kompleks Struktur tanin kompleks dibangun dari Unit gallotannin atau unit ellagitannin, dan
unti catechin. Salah satu contoh dari kelas zat ini adalah acutissimin.
(Karamali & Ree b., 2001)
Kingdom:
Plantae
(unranked):
Angiosperms
(unranked):
Eudicots
(unranked):
Rosids
Order:
Fagales
Family:
Fagaceae
Genus:
Quercus
Section:
Cerris
Species:
Q. acutiss ima Binomial name
Quercus acutissima
34
Sawtooth Oak banyak ditanam di bagian timur Amerika Utara dan dinaturalisasi di lokasi yang tersebar. Sebagian besar penanaman di Amerika Utara dilakukan untuk penyediaan makanan satwa liar, karena spesies ini cenderung menghasilkan tanaman biji-bijian yang lebih berat daripada spesies asli Amerika lainnya; Namun kepahitan biji pohon Sawtooth Oak membuatnya kurang sesuai untuk tujuan ini dan sawtooth oak menjadi spesies invasif bermasalah di beberapa daerah dan negara bagian, seperti Wisconsin. Pohon Sawtooth Oak juga tumbuh pada tingkat yang lebih cepat yang membantu bersaing dengan pohon asli lainnya. Kayu ini memiliki banyak karakteristik Sawtooth Oak lainnya, namun sangat rentan untuk retak dan terbelah dan karenanya terdegradasi ke kegunaan seperti pagar.(Wikipedia. 2018) Saat ini kayu Oak masih umum digunakan untuk pembuatan dan pembuatan furnitur, bangunan rangka kayu, dan produksi veneer. Barel di mana anggur, sherry, dan roh seperti brendi, wiski Irlandia, wiski Scotch dan wiski Bourbon berusia terbuat dari pohon Oak Eropa dan Amerika.(Wikipedia. 2018) 6.4. Tanin Terkondensasi Tannin ditemukan di anggur merah (dan ke Tingkat yang lebih rendah pada anggur
putih) adalah jenis tanin kental. Sifat-sifat tannin ini, dan terutama kepentingannya untuk pembuatan anggur, tergantung pada reaksi spesifik mereka dengan protein, yang pada gilirannya berhubungan langsung dengan tingkat polimerisasi mereka.
35
(Karamali & Ree b., 2001) Procyanidin B2 (epicatechin- (4β-8) -epicatechin; PB2) adalah antioksidan kuat yang ditemukan secara alami dalam konsentrasi tinggi pada kakao, anggur merah, apel, dan kayu manis. Ditunjukkan oleh gambar (77) bahwa PB2 melindungi PC12 sel dari stres oksidatif dan apoptosis berikutnya; Kemampuan neuroprotektif terhadap stres nitrosatif, eksitotoksisitas, dan apoptosis intrinsik yang sebelumnya sudah diperiksa (Sutcliffe & dkk, 2017)
36
BAB VII HUBUNGAN STRUKTUR AKTIVITAS TANNIN Tannin memiliki beragam efek pada system biologis karena tannin adalah chelators ion logam potential, protein agen pengendap, dan antioksidan biologis. Tannin diketahui dapat digunakan sebagai anti diabetes, anti-oksidan, antivirus, antibakteria, dan antitumor. Tannin tertentu dapat menghambat selektivitas replikasi HIV dan juga digunakan sebagai diuretic (Heslem, 1989). 7.1. Anti-Diabetes
Diabetes militus (DM) adalah penyakit berupa perubahan hemoistasis glukosa sehingga kadar glukosa dalam plasma darah mengalami kenaikan di atas normal. Kondisi ini sering disebut hiperglikemik (Maher, 2000). Banyak penelitian telah sampai pada isolasi senyawa aktif tumbuhan yang mampu memberikan efek hipoglikemik atau anti-diabetes. (Hayashi et al. 2002) berhasil mengisolasi lagerstroemin (5), flosin B (18), dan reginin A (19) dari daun kering bungur (L. speciosa) untuk uji anti-diabetes secara in vitro. Sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak daun bungur memiliki aktifitas hipoglikemik (Mishra et al.1990; Kakuda et al.,1996; Liu et al., 2001), yang mana ketiga senyawa ellagitanin tersebut diketahui berkaitan dengan efek hipoglikemik ekstrak daun bungur. Efek dari ellagitanin di atas dapat meningkatkan aktifitas dari transport glukosa ke jaringan adipose, dan hampir setengah kemampuannya untuk dapat meningkatkan hormone insulin itu sendiri . Asam elagat (3) dalam daun meniran ( Phyllantusniruri; Euphorbiaceae) juga diketahui memiliki aktifitas hipoglikemik, baik pada hewan percobaan maupun penderita diabetes. Kandungan asam elagat (3) dalam tumbuhan tersebut menghambat kerja enzim aldose reduktase. Enzim ini bekerja pada jalur poliol (pembentukan sorbitol dan fruktosa dari glukosa). Pada penderita DM, proses pengubahan glukosa menjadi fruktosa terganggu. Untuk mengembalikan keseimbangan metabolism glukosa harus ada penghambatan kerja enzimal dose redukstase (Trueblood dan Ramasamy,1998). Karena kerja enzim aldose reduktase dihambat oleh asam elagat (3) maka proses peningkatan kadar glukosa darah dapat menurun dan metabolisme glukosa menuju ke arah keseimbangan (Taylor, 2003; Shimizu et al., 1989). Selain ekstrak daun bungur, Rubus imperialis (Rosaceae) merupakan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bahan untuk terapi DM oleh penduduk Brazil (Kanegusuku et al., 2002). Kandungan ellagitanin, 3-O-metilelagat-4-O-rhamnose (24), dalam
37
tumbuhan tersebut diperkirakan berkaitan dengan efek hipoglikemik yang diberikan oleh tumbuhan tersebut pada penderita diabetes. Kondisi hiperglikemia ini dapat menyebabkan aktivasi PKC (protein kinase C). Aktifnya PKC akan menginduksi berbagai penyakit kardiovaskuler dan komplikasi turunan diabetes lainnya (Koya dan King, 1998). Ellagitanin merupakan inhibitor PKC yang lebih kuat dibandingkan dengan gallotanin (Bruyne et al., 1999). Oleh karena itu, ellagitanin juga dapat menurunkan resiko komplikasi yang di akibatkan oleh DM. 7.2. Anti-Mikroba dan Anti Virus
Tanin merupakan senyawa yang berpotensi besar sebagai agen anti-mikrobia. (Scalbert, 1991) Mekanisme anti-mikrobia tanin antara lain terjadi melalui inaktivasi adhesin mikrobia, penghambatan kinerja enzim, dan penghambatan transpor protein. (Cowan, 1999). Dimana tanin akan membentuk ikatan hydrogen dengan protein, kemudian protein kemungkinan akan terdenaturasi sehingga metabolism dari kuman akan terganggu (Markkar, 1991). Pengujian aktifitas anti-mikrobia terhadap Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Tricophyton mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, T. terreste, Penicillium italicum, Aspergillus fumigatus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Candida albicans, C. glabrata, Candidata krussei, dan Cryptococcus neofarmans, menunjukkan bahwa senyawa-senyawa tannin terhidrolisis dapat mempengaruhi aktivitas mikroba tengantung senyawa dan jenis mikroba sasaran. (Latte dan Kolodziej, 2000) Salah satu contoh adalah, Punicalagin dari delima dapat menghambat pertumbuhan mikroba beberapa strain Staphylaococcus aureus yang telah resisten terhadap antibiotik. Serta Punicalagin dari Combretum molle (Combretaceae) dapat menghabat mikroba jenis Mycobacterium tuberculosis. Untuk anti virus sendiri senyawa ellagitanin dapat menghambat pertumbuhan virus HIV-1. (Kandil dan Nassar, 1998). Salah satunya adalah Nobotanin B, C, Oenothein B, Agrimonin, dll (Okuda et al, 1992). Ellagitanin lain dari tumbuhan kemloko diprkirakan mampu menghambat virus hepatitis B (Taylor, 2003). Ekstrak daun Geranium dapat pula menghambat aktifitas reproduksi virus influenza dan herpes (Serkedjiva dan Manolova, 1992). Dimana ada aktifitas dari Galoillasi (penambahan gugus galloil), perbedaan ikataninterflavan, dan sifat tereokimia dari gugus hidroksilberpengaruh secara kuat terhadap aktifitas penghambatan pertumbuhan virus. Efek penghambatanini berkaitan dengan pencegahan terbentuknyakomplek enzim-asam nukleat (Bruyne et al., 1999). 38
7.3. Anti-Oksidan Anti-oksidan merupakan senyawa yang jika berada pada konsentrasi yang relatif lebih
rendah dibandingkan konsentrasi suatu subtrat, maka akan teroksidasi lebih dulu, sehingga dapat mencegah terjadinya oksidasi subtrat tersebut. Tanin dapat menghambat pembentukan oksigen aktif yang dapat menyebabkan oksidasi, serta cukup berpotensi. (Rauha, 2001; Okuda et al., 1992) Hasil review dari, (Okuda et al. 1992) menyebutkan aktifitas anti-oksidatif tanin, termasuk ellagitanin, antara lain penghambatan autooksidasi asam askorbat yang dikatalissi oleh ion Cu2+. Aktifitas anti-oksidatif ellagitanin tersebut berkaitan dengan strukutur kimianya. Naiknya jumlah gugus galloil, berat molekul, dan struktur ortohidroksil meningkatkan aktifitas antioksidatif tanin (Yokozawa etal., 1998).
7.4. Anti Tumor/Kanker Kanker adalah sekumpulan sel yang mengalami pertumbuhan tak terkendali dan tak
terorganisir. Di dalam tubuh sel kanker membentuk suatu badan yang disebut tumor. Kanker dapat timbul karena terjadinya kerusakan gen dalam sel (Snustad dan Simmon, 2000). Aktifitas anti-kanker suatu tanin terjadi melalui mekanisme penghambatan kerja enzim sel, pencegahan proses mutagenesis yang dapat menimbulkan kanker, dan pengaktifan makrofag sel kanker. Ellagitanin tersebut menginduksi kematian sel karena apoptosis melalui fragmentasi DNA dan pembelahan sitokeratin 18 (Sakagumi, 2000). Studi yang mendalam tentang ellagitanin dimer makrosirkuler, menunjukkan bahwa oenothein
B
(33)
berpotensi
dalam
menghambat
kinerja
poly(ADP-ribosa)
glycohydrolase (PARG). Penghambatan tersebut dapat menyebabkan ekspresi gen MMTV (mouse mammary tumor virus) pada kultur sel 34I mengalami gangguan (Aoki et al., 1995). Penghambatan PARG akan diikuti dengan penghambatan aktivitas poly(ADPribose) polymerase (PARP) dimana telah diketahui aktifitas PARP dapat menyebabkan kematian sel karena nekrosis. Penghambatan PARP dapat melindungi sel dari hidrogen peroksida (Virag dan Szabo, 2002). Salah satu contoh adalah, ekstrak air buah Phyllantus emblica dapat mencegah kerusakan kromosom akibat oksigen radikal yang dapat menimbulkan kanker pada tikus. Efek pencegahan ini berkaitan dengan aktifitas antioksidatif embli-canin A dan B dan pyrogallol dalam buah Phyllantus (Wohlmuth, 2003). Alienanin B dan stenophyllanin A dari Coleogyne ramosisima dan Cowania mexicana mampu menghambat aktivasi EBVEA ( Epstein-Barr virus – early antigen) yang dapat menginduksi kanker. 39
BAB VIII BIOSINTESA TANNIN Pada umumnya, suatu penelitian biosintesa tanin dilakukan pada tumbuhan Oak (Quercus rubra), Rhus sp., dan beberapa tumbuhan tertentu. Reaksi biosintesa berlangsung spesifik sesuai dengan jenis senyawa dan tumbuhannya. (Hernawan & Dwi, 2003) Tanin merupakan salah satu senyawa metabolik sekunder yang berada didalam tumbuhan. Senyawa metabolit sekunder umumnya dibagi dalam empat golongan, yaitu fenolik, alkaloid, terpenoid, dan asam amino non protein. Tanin termasuk ke dalam golongan fenolik. Semua komponen fenolik baik primer maupun sekunder dibentuk dengan cara shikimic acid pathway, atau yang biasa disebut phenylpropanoid pathway . Tanin dibedakan menjadi dua kelas yaitu tanin terkondensasi (condensed tannins) dan tanin terhidrolisis (hydrolyzable tannins). Jalur biosintesis kedua kelas tanin tersesbut akan diawali dari pembentukan asam galat melalui jalur biosintesis asam shikimat. Jalur biosintesis asam shikimat:
Gambar 1. Jalur biosintesis asam siikimat (shikimic acid pathway)
40
Jalur asam shikimat mengubah prekusor karbohidrat sederhana yang merupakan hasil dari glikolisis dan jalur pentosa phosphat menjadi asam amino aromatic Jalur asam shikimat dimulai dari asam shikimat yang dengan adanya Erithrose PO 4 + PEP akan menjadi asam kuinat; asam kuinat inilah yang nantinya menjadi asam gallat. Asam gallat merupakan salah satu asam pembentuk tannin terhidrolisis. Pada tannin terhidrolisis golongan Gallotannin, asam gallat satu dengan yang lain akan dihubungkan dengan adanya ester, lalu bergabung dengan alkoholnya (umumnya glukosa) membentuk Gallotannin. Sedangkan pada tannin terhidrolisis golongan Ellagitannin, asam galat satu dengan yang lain dihubungkan dengan adanya ikatan atom C-C dan ester, lalu bergabung dengan alkoholnya (umumnya glukosa) membentuk Ellagitannin. Asam Shikimat juga akan menjadi Phenilalanin; Phenilalanin akan menjadi Tyrosin dan asam sinamat. Asam sinamat inilah yang nantinya akan menjadi salah satu penyusun pseudotannin. Asam sinamat akan berikatan dengan asam kuinat atau asam shikimat membentuk pseudotannin. Berikut ini merupakan ringkasan dari biosintesis tanin:
Gambar 2. Jalur Asam shikimat
41
8.1.Biosintesa Tanin Terkondensasi (Proanthocyanidins (PAs) Proanthocyanidins (PA), juga dikenal sebagai tanin kental, adalah kelompok
metabolit sekunder polifenolik disintesis pada tanaman sebagai oligomer atau polimer unit flavan-3-ol melalui jalur flavonoid.
Gambar 3. Biosintesis Proanthocyanidins 42
8.2.Biosintesa Tanin Terhidrolisis Tanin terdihrolisis ((hydrolyzable tannins) merupakan molekul dengan polyol
(umunya D-glukosa) sebagai inti. Gugus hidroksil pada karbohidrat tersebut dapat teresterifikasi sebagian atau seluruhnya oleh gugus fenolik seperti asam gallat (menjadi gallotannin) atau asam ellagat (menjadi ellagitannin). 8.2.1. Jalur biosintesa Ellagitanin Jalur biosintesa ellagitanin, terdiri dari tiga tahapan reaksi (Gross, 1992): 1) Pembentukan asam galat, sebagai penyusun primer ellagitanin. Tahap ini diawali dari jalur shikimat yyang membentuk dua arah reaksi sintesis asam galat. Arah pertama melalui pembentukan L-fenilalanin dengan perantara arogenate. Pembentukan asam sinamat dari L-fenilalanin dihalangi oleh enzim L-AOPP (L2-aminooxy-3-phenylpropionic acid), dan reaksi diarahkan pada senyawa kafeat. Arah reaksi kedua melalui pembentukan 3-dehidroshikimat yang mengalami hidrogenasi pada atom C ke-3 sehingga terbentuk asam galat (Gross, 1992). 2) Pembentukan pentagalloilglukosa yang diawali oleh reaksi asam galat dengan uridin 5-difosfat glukosa untuk membentuk β -glukogallin. Dengan penambahan empat
molekul
galloil,
β-glukogallin
diubah
menjadi
1,2,3,4,6-
pentagalloilglukosa. Empat molekul galloil menggantikan atom H pada empat gugus hidroksil. Proses penggantian atom H tersebut dinamakan reaksi galloilasi. Reaksi ini berurutan mulai dari gugus hidroksil ke-1, lalu ke-6, ke-2, ke-3 dan yang terakhir ke-4. Reaksi ini membutuhkan enzim galloiltransferase (Gross, 1992). 3) Pembentukan senyawa-senyawa ellagitanin. Senyawa ellagitanin dihasilkan dari dehidrogenasi
pentagalloilglukosa.
Residu
yang
dihasilkan
dari
proses
dehidrogenasi dua kelompok galloil dari pentagalloilglukosa adalah HHDP. Dehidrogenasi yang terjadi diikuti dengan reaksi perangkaian (coupling) antar atom C dua gugus galloil. Gallotanin yang mengalami oksidasi perangkaian C-C dan C-O pada gugus galloil yang berdekatan menghasilkan ellagitanin (Gross, 1992)
43
Gambar 4. Pembentukan asam gallat (Gross, 1992)
Gambar 5. Jalur biosintesa Ellagitanin (Gross, 1992)
44
8.2.2. Jalur biosintesa Gallotanin
Gambar 6. Jalur biosintesa Gallotanin (Gross, 2000)
45
BAB IX ISOLASI TANIN Isolasi adalah proses pengambilan senyawa bahan alam dari dalam tanaman melalui beberapa tahapan sehingga dihasilkan senyawa kimia murni, biasanya peneliti menggunakan beberapa teknik ekstraksi dan kromatografi. Teknik ekstraksi bahan alam yang biasa digunakan antara lain maserasi, perkolasi, infudasi, dan sokhletasi. Sedangkan teknik kromatografi yang biasa digunakan adalah kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom vakum (KCV), kromatografi kolom grafitasi (KKG) dan kromatotron (Centrifugal Chromatography). Tahapan isolasi meliputi pembuatan simplisia, skrining fitokimia, ekstraksi, fraksinasi, pemantauan fraksi, sub fraksinasi, pemantauan sub fraksi, pemurnian isolat, uji kemurnian dan elusidasi struktur. 9.1. Pemilihan Metoda Ekstraksi
Tanin adalah senyawa yang akan diidentifikasi, ia dapat diekstraksi dari seluruh bagian tumbuhan, meliputi daun, cabang, batang, akar,dan buah (Hernawan & Dwi, 2003). Jenis dan kadar pada setiap bagian ini berbeda- beda, sehingga jumlahnya perlu dipertimbangkan sebelum melakukan pengekstrakan. Selain itu,umur jaringan juga perlu diperhatikan. Umumnya, jaringan tua memiliki kandungan metabolit sekunder lebih banyak daripada jaringan muda. Bagian yang kaya akan tanin bergantung pada jenis tumbuhannya, misal pada Caesalpinia spinosa organ buah memiliki kandungan tanin paling tinggi, sedangkan pada pohon oak (Quercus)kandungan tanin banyak terdapat di batang (Hernawan & Dwi, 2003). Ekstraksi tanin umumnya dilakukan pada daun dan batang tumbuhan yang berupa jaringan segar maupun yang sudah kering. Untuk analisis, sebaiknya digunakan jaringan segar (Hernawan & Dwi, 2003). Namun, seringkali hal itu tidak memungkinkan karena jauhnya jarak pengambilan sampel dengan laboratorium. Oleh sebab itu sampel tumbuhan dapat dibekukan, dikeringbekukan, atau dikeringanginkan. Metode kering beku merupakan cara yang paling aman untuk mencegah perubahan jaringan, yang mengakibatkan perubahan kadar tanin. Metode ini dilakukan dengan menggunakan nitrogen cair. Jika nitrogen cair tidak tersedia, maka alternatif yang mudah adalah dikeringanginkan. Titik uap senyawa ellagitanin sangat tinggi, misalnya pada lagerstroemin di atas 2500C, namun proses pengeringan sebaiknya dilakukan pada suhu kamar atau kurang dari 400C. Pada suhu lebih dari 400Cdapat terjadi penurunan kadar 46
dan ekstrak bilitastanin secara drastis. Jika pengeringan dilakukan dalam ruang yang kelembabannya tinggi, maka penggunaan kipas angin sangat disarankan. Hal ini akan mempercepat proses pengeringan dan mencegah molekul air bereaksi dengan molekul tanin melalui luka- luka pada jaringan. Senyawa polar sampai semipolar umumnya dapat melarutkan tanin. Ekstraksi tanin dari jaringan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan pelarut aseton 70% atau metano l50% dalam air (Hernawan & Dwi, 2003) melakukan ekstraksi ellagitanin dari daun kering Euphorbia tirucalli dengan menggunakan pelarutaseton 60%. Sedangkan Machado et al. (2002) berhasil melakukan ekstraksi ellagitanin dari kulitbuah delima segar ( Punica granatum; Punicaceae) dengan etanol. Seperti yang dilakukan oleh Liu etal. (2001), jika menggunakan air sebagai pelarut, proses ekstraksi harus berlangsung pada kondisi air mendidih. Suhu panas dapat membantu ekstrabilitas tanin terhadap pelarut air. Proses ekstraksi umumnya dilakukan secara berulang dan bertahap. Seringkali, ekstraksi dengan aseton 70% dilakukan berulang sampai tiga kali. Tahapan kerja isolasi: 1. Simplisia diblender sampai diperoleh serbuk. 2. Serbuk ditimbang sebanyak 50 gram kemudian direndam dengan 400 ml pelarut aseton : air (7:3) dengan penambahan 3 ml asam askorbat 10 mM selama 3 x 24 jam dengan bantuan shaker. 3. Ekstrak tanin dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator dan pemanasan di atas waterbath pada suhu 40-500 C. 4. Cairan hasil ekstrak kemudian diektraksi dengan kloroform (4x25 mL) menggunakan corong pisah sehingga terbentuk 2 lapisan. 5. Lapisan kloroform (bawah) dipisahkan dan lapisan air 1 (atas) diekstraksi dengan etil asetat (1x25 ml) dan terbentuk 2 lapisan. 6. Lapisan etil asetat 1 (atas) dipisahkan dan lapisan air 2 (bawah) dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.
47
9.2. Pemilihan Eluen Dan Metode Pemisahan
9.2.1. KLT Analitik 1. Menyiapkan plat silika G 60 F254 yang sudah diaktifkan dengan pemanasan dalam oven pada suhu 100 C selama 10 menit. Masing-masing plat dengan ukuran 1 cm x 10 cm. 2. Ekstrak tanin ditotolkan pada jarak 1 cm dari tepi bawah plat dengan pipa kapiler kemudian dikeringkan dan dielusi dengan beberapa fase gerak untuk dipilih fase gerak yang terbaik.
Toluen : etil asetat (3:1) dengan pendeteksi ferri sulfat.
Forestal (asam asetat glasial :H2O:HCl pekat) (30:10:3) .
Etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) dengan pendeteksi aluminium klorida 5%.
n-butanol : asam asetat : air (4:1:5), metanol : etil asetat (4:1) dengan pendeteksi AlCl3 1% .
Etil asetat : kloroform : asam asetat ( 15 :5 :2)
3. Setelah gerakan larutan pengembang sampai pada garis batas, elusi dihentikan. 4. Noda yang terbentuk masing-masing diukur harga Rf nya. 5. Memperhatikan bentuk noda pada berbagai larutan pengembang yang paling baik untuk keperluan preparatif. Noda yang terbentuk diperiksa dengan lampu UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Tabel. Data penampakan noda fasa air hasil KLT analitik dengan beberapa eluen dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm No.
Eluen
Jumlah Noda
Keterangan
1.
n-butanol : asam asetat : air (4:1:5)
3
Terpisah baik
2.
Etil asetat : kloroform : asam asetat ( 15 :5 :2)
2
Terpisah baik
3.
Forestal (asam asetat glasial : H2O: HCl pekat) (30:10:3)
1
Tidak terpisah
4.
Metanol : etil asetat (4:1)
-
Tidak terpisah
5.
Etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1)
-
Tidak terpisah
6.
Toluen : etil asetat (3:1)
-
Tidak terpisah
48
Tabel 2. Nilai Rf dan warna noda hasil KLTAeluen terbaik n-butanol : asamasetat : air (BAA) (4:1:5) dibawah sinar UV 254 nm dan366 nm Warna Noda Noda
Nilai Rf
1.
254 nm
366 nm
0,53
Coklat kehijauan
Coklat kehijauan
2.
0,61
Hijau
Ungu kemerahan
3.
0,68
-
Ungu kemerahan
KLT merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan distribusi dua fasa. Fasa diam yang digunakan adalah plat silika gel yang bersifat polar, sedangkan eluen yang digunakan bersifat sangat polar karena mengandung air. Kepolaran fasa diam dan fasa gerak hampir sama, tetapi masih lebih polar fasa gerak sehingga senyawa tanin yang dipisahkan terangkat mengikuti aliran eluen, karena senyawa tanin bersifat polar. Dari ketiga noda yang ada maka noda yang kedua adalah noda yang diduga senyawa tanin, yang memiliki nilai Rf sebesar 0,61 dan warna noda saat disinari dengan lampu UV 366 berwarna lembayung. Hal ini diperkuat oleh Harborne (1987) bahwa tanin dapat dideteksi dengan sinar UV pendek berupa noda yang berwarna lembayung, selain itu didukung dengan Rf dari ekstrak tanaman mimosa (memiliki kadar tanin yang tinggi) yang dielusi dengan eluen yang sama dengan nilai Rf sebesar 0,62 9.2.2. KLT Preparatif Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan suatu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar (Townshend, 1995). Hasil pemisahan dengan KLT preparatif hampir sama dengan KLT analitik hanya berbeda pada jumlah ekstrak yang ditotolkan pada plat dan ukuran plat KLT yang
digunakan. Plat yang
digunakan pada KLT preparatif adalah plat KLT silika gel G 60 F254 dengan ukuran yang lebih besar
yaitu 10 cm x 20 cm. Eluen yang digunakan pada
pemisahan KLT preparatif adalah eluen terbaik hasil pemisahan pada KLT analitik yaitu n-butanol : asam asetat : air (BAA) dengan perbandingan (4:1:5). Noda yang dihasilkan pada plat KLT preparatif menghasilkan 3 noda. Pada panjang gelombang 254 nm noda yang terlihat hanya 2 noda, sedangkan dengan lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm terlihat 3 noda dengan nilai Rf seperti pada 49
Tabel 2. Pemisahan dengan KLT analitik menghasilkan harga Rf dari noda pertama sebesar 0,53 yang diduga senyawa antosianidin (Olivina, 2005). Noda kedua dan ketiga dengan nilai Rf 0,61 dan 0,68 diduga senyawa tanin terkondensasi. Senyawa tanin diduga mempunyai nilai Rf 0,61, hal ini didukung dari pengukuran standar tanin dari tanaman mimosa yang memiliki kadar tanin yang besar dengan nilai Rf sebesar 0,62. Noda-noda hasil KLT preparatif yang mendekati harga Rf tanin dari tanaman mimosa dan warna yang menunjukkan tanin dikerok dan dilarutkan dalam pelarut aseton:air (7:3), kemudian diidentifikasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan FTIR 9.2.3. Kromatografi kolom
Isolasi ellagitanin sebagian besar mengharuskan penggunaan kromatografi kolom sebagai salah satu tahapan isolasi. Ellagitanin dapatterpisah dengan baik menggunakan kolom pemisah Sephadex LH-20, MCI-gel CHP 20P, at au ODS-AQ. Metanol dengan konsentrasi bertingkat merupakan eluen yang baik untuk memperoleh ellagitanin.
Isolasi flosin B (18), danreginin A (19) dari bungur ( L. speciosa) pertamakali menggunakan aseton 70% berulang tiga kali.Ekstrak yang diperoleh kemudian disuspensikandalam air dan dipartisikan dengan etil asetat, eter,dan butanol.Fraksi air yang terbentuk dipisahkandengan menggunakan kolom pemisah Diaion HP20dengan eluen metanol. Proses isolasi berakhir denganpenggunaan instrumen HPLC-preparatif (highperformance liquid chromatography). Kolom ODS-A,2 x 15
50
cm, dengan eluen metanol 25%, CH3CN 10mM dan buffer fosfat pH 2 dapat memisahkanellagitanin dengan baik (Hayashi et al., 2002).Pemisahan ellagitanin dari P. granatum dilakukandengan kolom berurutan yaitu XAD-16 danSephadex LH-20 (eluen yang dipakai adalahmetanol dengan konsentrasi bertingkat), setelahsebelumnya ekstrak etanol dipartisikan denganheksana, butanol, etilasetat dan kloroform.Fraksi yang diperoleh dielusikan ke instrumen HPLCpreparatiffase balik, kolom RP-18, 2x25 cmmenghasilkan α-punicalagin, β-punicalagin,α punicalin dan β-punicalin dan asamelagat (Hernawan & Dwi, 2003).
51
BAB X KARAKTER DAN IDENTIFIKASI ISOLAT TANIN 10.1.
Identifikasi Tanin
Dengan menggunakan perekasi : FeCl3, Lar. Gelatin 0.5 % ph 4 dengan (+) Nacl, Ekstrak tanaman (+) NaHPO4. 1.
FeCl3, akan terbentuk warna Hijau-kebiruan (+ Tanin tipe Katekol).
2.
Lar. Gelatin 0.5 % ph 4 dengan (+) Nacl, akan terbentuk Endapan putih (+ Senyawa tanin).
3.
Ekstrak tanaman, tambahkan NaHPO4 dengan pemanasan. Setelah itu diamkan mendingin, dan saring.
Perolehan filtrat (+) 2 % larutan phenazone, akan
terbentuk endapan (+ Senyawa tanin). 10.2.
Identikasi Tanin Terhidrolisis Untuk identifikasi tanin terhidrolis dapat digunakan 2 pereaksi, yakni : KIO3 dan
Rhodanin. 1. Dengan pereaksi KIO3 : Gallotanin (tanin terhidrolisis), dimetanolisis dengan penambahan metanol anhidrous dan H2SO4 18 M pada suhu 85°C, selama 20 jam. Jika bebas air, akan terbentuk Metil Galat lalu tambahkan KIO3 akan terbentuk warna merah. Sedangkan, jika ada air akan terbentuk Asam Galat. 2. Dengan pereaksi Rhodanin : Gallotanin (tanin terhidrolisis), dihidrolisis dengan penambahan H2S04 2N (encer) pada suhu 100°C, selama 26 jam. Kemudian akan terbentuk Asam Galat bebas, menunjukan positif (+) untuk Rhodanin.(Gallotanin merupakan Ester dari Asam Galat dengan poli-ol, gula-glukosa pada umumnya.) 10.3.
Identifikasi Elagitanin Ellagitanin merupakan Asam. Elagat dengan gula. Berikut cara identifikasinya :
Elagitanin, dihidrolisis dengan penambahan H2SO4 2N pada suhu 100°C, selama 10jam. Akan terbentuk As. Elagat, lalu (+) NaNO2 sehingga terbetuk warna Merah Karmin. ( As. Elagat : Ikatan harus karbon dengan karbon. )
52
10.4.
Identikasi Tanin Tekondensasi Untuk identifikasi tanin terkondensasi dapat digunakan 2 pereaksi, yaitu :
Larutan Vanilin 1%, dan dengan pereaksi Asam Butanol. 1. Larutan Vanilin 1% Tanin, tambahkan dengan Larutan Vanilin 1%, akan terbentuk warna Merah yang dapat menunjukan positif (+) untuk tanin terkodensasi, selain itu juga menunjukan monomer flavanol. 2. Pereaksi Asam Butanol Leucoanthocyanidin (flavan-3,4-diols & flavan-4-ols), Proanthocyanidin, 3deoxyproantho Cyanidin, tambahkan dengan Asam Butanol ( Butanol (+) dengan HCL pekat ), dengan adanya reaksi tersebut akan terbentuk Anthocyanidin, muncul warna kemerahan. 10.5.
Identikasi untuk Membedakan Tanin Terhidrolisis dan Tanin Terkondensasi
Tanin 0.4 %, tambahkan 2x volume As. Asetat 10 % dan 1x volume Pb Asetat 10 %, kemudian campuran didiamkan selama ± 5 menit. Apabila terbentuk endapan, maka positif (+) untuk Tanin Terhidrolisis atau Gallotanin. Sedangkan apabila tidak terbentuk endapan, maka positif (+) untuk Tanin Terkondensasi (Hagerman A. E., 2002).
53
DAFTAR PUSTAKA Ashok, P. K. (2012). Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry , 45. Atun, S. (t.thn.). Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam . Bao, L.-M., & dkk. (2012). HYDROLYSABLE TANNINS ISOLATED FROM SYZYGIUM AROMATICUM: STRUCTURE OF A NEW C-GLUCOSIDIC ELLAGITANNIN AND SPECTRAL FEATURES OF TANNINS WITH A TERGALLOYL GROUP., HETEROCYCLES, Vol. 85, No. 2 , 365-381. Berita
Terkini:
Manfaat
dan
Jenis
Toner
Kulit .
2018.
http://www.kalbemed.com/Portals/6/17_211Berita%20TerkiniManfaat%20dan%20Jenis%20Toner%20Kulit.pdf diakses pada tanggal 12 Maret 2018 pukul 10.05 Cannell, R. J. (1998). Natural Products Isolation Methods in Biotechnology. Totowa: Humana press. E., S., & T., B. (2017). Pharmacognosy Fundamentals, Applications and Strategy Chapter 10: Tannins. , 202-203. Eko, H., Udhi, & Ahmad, D. S. (2003). Review : Ellagitannin ; Biosintesis, Isolasi, dan Aktivitas Biologi . Fei, e. a. (2008). . Review : Biosynthesis and Genetic Regulation of Proanthocyanidins in Plants.Center for Viticulture and Enology, College of Food Science & Nutritional Engineering, . Gross, G. G. (1992). Enzimes in the biosynthesis of hydrolyzable tannins. In Hemingway, R.W. and P.E.Laks (ed.). Plant Polyphenols: Synthesis, Properties, and Significance. Gross, G. G. (2000). Biosynthesis and subcellular distribution of hydrolyzable tannins. Molekulare Botanik . Habtemarian, S. (2001). Hamamelitannin from Hamamelisvirgiana inhibits the tumour necrosis factor-alpha (TNF)-induced endothelial cell death in vitro., Toxicon 40 (2002) , 83-88. Hagerman, A. E. (2002). Tannin Chemistry. USA: Department of Chemistry and Biochemistry Miami Univerity Oxford. Hagerman, A., & Butler, L. (1989). Chem Ecol , 15,1795. Hernawan, U. E., & Dwi, A. (2003). Ellagitanin; biosynthesis, isolation, and biological activities , 25-38.
54
Hor, M., Henrich, M., & Rimpler, H. (t.thn.). Proanthocyanidin polymers with antisecretory activity and proanthocyanidin oligomers from Guazumaulmifolia bark. Phytochemistry 1996;42:10919 . Karamali, K., & Ree b., T. v. (2001). Tannins: Classification and Definition . Kurniawan,
Mashuri.
2011.
Riau
Pos:Berangan,
Si
Kacang
Keju
yang
Langkahttp://www.riaupos.co/2221-berita-berangan,-si-kacang-keju-yang-
langka.html#.WqXvIR3FLIU diakses pada tanggal 12 Maret 2018 pukul 10.13 Makkar, H. (2003). Effects and fate of tannins in ruminant animals, adaptation to tannins, and strategies to overcome detrimental effects of feeding tannin-rich feeds, Animal Production and Health Section Joint FOA/IAEA Division . Morimoto, S., Nonaka, G.-I., & Nishioka, I. (1986). Tannins and Related Compounds. XXXVIII. Isolation and Characterization of Flavan-3-ol Glucoides and Procyanidin Oligomers from Cassia Bark (Cinnamomum cassia BLUME)., Chem. Pharm. Bull. 43(2) , 633. Natsume, M., & dkk. (t.thn.). . Analyses of polyphenols in cacao liquor, cocoa, and chocolate by normal-phase and reversed-phase HPLC. BiosciBiotechnolBiochem 2000;64:25817 . Niemetz, R., & Gross, G. G. (2005). Review: Enzymology of gallotannin and ellagitannin biosynthesis.Molekulare Botanik, . Okuda, T., & dkk. (1982). CASUARIN, sTACHYURIN AND STRICTININ, NEW ELLAGITANNINS FROM CASUARINA STRICTA AND STACHYURUS PRAECOX., Chem. Pharm. Bull. 30(2) , 766-769. Okuda, T., & Ito, H. (2011). Tannins of Constant Structure in Medicinal and Food Plants Hydrolyzable Tannins and Polyphenols Related to Tannins . Sa'adah, L. (2010). Isolasi dan Identifikasi Senyawa Tannin dari Daun Belimbing Wuluh . Saijo, R., Nonaka, G.-I., & Itsuo, N. (1998). PHENOL GLUCOSIDE GALLATES FROM MALLOTUS JAPONICUS*., Phytochemistry, Vol. 28, No. 9, , 2443-2446. Sano, A. (2003). Procyanidin B1 is detect in human serum after intake of Proanthocyanidinrich Grape Seed Extract.,Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(5). , 1140-1143. Satomi, H., & dkk. (1993). Carbonic Anhydrase Inhibitors from the Pericarps of PunicaGranatum L., Biol. Pharm. Bull. 16(8) , 787. Shahat, A. l., & Marzouk, M. (2013). Proanthocyanidin polymers with antisecretory activity and proanthocyanidin oligomers from Guazumaulmifolia bark. Phytochemistry 1996;42:10919 , 582.
55
