BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Latar Belakang Performa tinggi kromatografi cairan (HPLC) adalah suatu bentuk kromatografi cair untuk memisahkan senyawa yang terlarut dalam larutan. instrumen HPLC terdiri dari suatu reservoir fase gerak, sebuah pompa, sebuah injektor, kolom pemisahan, dan detektor. Senyawa dipisahkan dengan menyuntikkan plug campuran sampel ke kolom. Berbagai komponen dalam campuran melewati kolom pada tingkat yang berbeda karena perbedaan perilaku partisi mereka antara cairan mobile fase dan fase diam. HPLC (High-performance liquid chromatography atau high-pressure li quid chromatography), merupakan teknik kromatografi yang dapat memisahkan campuran senyawa dan digunakan dalam biokimia dan kimia analitik untuk mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran. HPLC biasanya menggunakan berbagai jenis fase stasioner (hidrofobik) jenuh rantai karbon, pompa yang bergerak fase gerak dan analisa melalui kolom, dan detektor yang menyediakan waktu retensi karakteristik untuk analisa. Detektor dapat juga memberikan informasi karakteristik lainnya (yaitu UV / Vis data spektroskopi untuk analisa jika demikian dilengkapi). Waktu retensi analisa bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut yang digunakan, dan laju alir fase gerak.
1.2. Rumusan Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas maka dapat diambil rumusan masalah sebagai berikut:
Pengoperasiaan
Tipe
Isokratik aliran dan elusi gradien
Parameter
1
BAB II PEMBAHASAN
2.1
Pengenalan HPLC Kromatografi cair kinerja tinggi adalah alat yang ampuh dalam analisis. Bagaimana itu dilakukan dan menunjukkan bagaimana menggunakan prinsip yang sama se perti pada kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC bekerja pada prinsip dasar yang sama. HPLC pada dasarnya adaptasi dari kromatografi kolom - jadi mungkin ide yang baik untuk memiliki tampilan (sangat cepat) pada saat itu juga. Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya yang sangat meningkatkan bentuk kromatografi kolom. Alih-alih pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, terpaksa melalui bawah tekanan tinggi sampai dengan 400 atmosfer. Itu membuatnya lebih cepat. Hal ini juga memungkinkan Anda untuk menggunakan ukuran partikel kecil yang sangat banyak untuk kolom isian materi yang memberikan permukaan yang jauh lebih besar area untuk interaksi antara fasa diam dan molekul yang mengalir melewatinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik komponen campuran. Perbaikan utama la in dari kromatografi kolom kekhawatiran metode pendeteksian yang dapat digunakan. Ini Metode ini sangat otomatis dan sangat sensitif. Kolom dan pelarut, ada dua perbedaan dalam HPLC tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil, dan pelarut non-polar - heksana, misalnya. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari itu), dan panjang 150 s ampai 250 mm. Polar senyawa dalam campuran yang sedang melewati kolom akan menempel lagi ke silika polar daripada non polar senyawa yang non-polar sehingga akan berlalu lebih cepat melalui kolom. HPLC Fase Terbalik dalam hal ini, ukuran kolom sama, tetapi silika adalah dimodifikasi untuk membuatnya non-polar dengan melampirkan hidrokarbon panjang rantai untuk permukaan - biasanya dengan baik 8 atau 18 atom karbon di dalamnya. Sebuah pelarut polar digunakan - misalnya, campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam hal ini, akan ada daya tarik yang kuat antara kutub pelarut dan molekul polar dalam campuran yang sedang melewati kolom. Tidak akan ada sebagai daya tarik jauh antara rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul polar dalam lar utan. Kutub 2
molekul dalam campuran karena itu akan menghabiskan sebagian besar waktu mereka bergerak dengan pelarut. Senyawa non-polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena van der Waals dispersi pasukan. Mereka juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya di antara molekul-molekul air atau metanol, misalnya. Mereka oleh karena itu menghabiskan lebih sedikit waktu dalam larutan dalam pelarut dan ini akan memperlambat mereka dalam perjalanan mereka melalui kolom. Itu berarti bahwa sekarang itu adalah molekul polar yang akan melakukan perjalanan melalui kolom lebih cepat. Fase terbalik HPLC adalah bentuk yang paling umum digunakan HPLC.
2.2
Pengoperasian
A = Wadah Eluent B = Katup elektromagnetik pencampuran dengan Double piston pompa C = 6 cara katup D = Tekanan loop kompensasi untuk menyamakan pulsa pompa pompa E = Mixing ruang F = Rheodyne katup injeksi G = Kolom H = HPLC unit 3
I = detektor unit (misalnya, UV-spektrometer) J = Computer-Interface K = PC L = printer untuk output hasil
Sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil untuk aliran fase gerak. Mosi analit melalui kolom diperlambat oleh kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam karena melintasi panjang kolom. Berapa analit diperlambat t ergantung pada sifat analit dan pada komposisi dari fasa diam dan mobile. Waktu di mana s uatu elutes analit tertentu (yang keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap mengidentifikasi karakteristik yang cukup unik dari analit diberikan. Penggunaan kemasan ukuran partikel yang lebih kecil kolom (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan linear (kecepatan) memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk difusi atau berdifusi dalam kolom, yang mengarah ke resolusi ditingkatkan dalam dihasilkan Kromatografi / kromatogram. Umum pelarut digunakan termasuk kombinasi pelarut dari air (molekul) atau cai ran berbagai organik (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril. Air mungkin mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit, atau senyawa seperti asam trifluoroacetic yang bertindak sebagai agen ion pasangan. Sebuah perbaikan lebih lanjut untuk HPLC telah bervariasi komposisi fase gerak selama analisis tersebut, ini dikenal sebagai elusi gradien. Sebuah gradien normal untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai dari metanol 5% dan kemajuan linear menjadi metanol 50% lebih dari 25 menit, gradien yang dipilih tergantung pada seberapa hidrofobik analit tersebut. Gradien memisahkan campuran analit sebagai fungsi dari afinitas dari analit untuk komposisi fase saat mobile relatif terhadap fase diam. Proses partisi ini mirip dengan yang terjadi selama cair – cair ektraksi, tetapi terus menerus, tidak bijaksana. Dalam contoh ini, dengan menggunakan air / gradien metanol, komponen lebih hidrofobik akan mengelusi (datang dari kolom) ketika fase gerak terdiri sebagian besar dari metanol (pemberian fase gerak relatif hidrofobik). Semakin senyawa hidrofilik akan mengelusi dalam kondisi relatif rendah metanol / air yang tinggi. Pemilihan pelarut, aditif dan gradien ter gantung pada sifat fase diam dan analit. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada analit dan sejumlah uji coba dapat diproses untuk menemukan metode KCKT yang memberikan pemis ahan terbaik dari puncak.
4
2.3
Tipe Partition chromatography
Kromatografi partisi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. Prinsip koefisien partisi telah diterapkan di kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, fasa gas dan aplikasi cair-cair. Tahun 1952 Hadiah Nobel di bidang kimia telah diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino. kromatografi partisi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari sebuah "inert" solid matrik pendukung seperti kromatografi kertas, atau mengambil keuntungan dari beberapa tambahan muatan dan / atau interaksi hidrogen donor dengan dukungan solid. Molekul menyetimbangkan (partisi) antara fas e diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Hidrofilik Interaksi Kromatografi (HILIC) dalam HPLC, metode ini memisahkan analit berdasarkan perbedaan kutub. HILIC paling sering menggunakan fase diam terikat kutub dan air non-polar, larut, fase gerak. HPLC partisi t elah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan dari memisahkan zat terlarut asam, dasar dan netral dalam kromatogram tunggal. Polar analit berdifusi ke lapisan air yang diam yang terkait dengan fase diam polar dan karena itu ditahan. Retensi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup muatan (elektrostatik) interaksi dan kemampuan hidrogen donor. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan pelarut lebih hidrofobik cenderung meningkat kali retensi. Partisi dan NP-HPLC telah jatuh dari kasih karunia di tahun 19700-an dengan perkembangan HPLC fase terbalik karena kurangnya reproduksibilitas kali retensi s ebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi alumima silika atau media kriomatografi. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase HILIC terikat yang meningkatkan reproduktifitas. Kromatografi fase normal ( Kromatografi fase normal berair ). Juga dikenal sebagai fase normal HPLC (NP-HPLC), atau kromatografi adsorpsi, metode ini memisahkan analit berdasarkan adsorpsi ke kimia permukaan stasioner dan polaritas. Itu adalah salah satu jenis 5
pertama KCKT yang dikembangkan kimiawan. NP-HPLC menggunakan fasa diam polar dan fase, non-polar mobile non-air, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. Perusahaan asosiasi analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Adsorpsi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor-faktor sterik. Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan pelarut lebih hidrofobik cenderung meningkat kali retensi. Sangat pelarut polar dalam campuran yang cenderung menonaktifkan fase diam dengan membuat lapisan air yang diam terikat pada permukaan fase diam. Perilaku ini agak aneh bagi fas a normal karena sangat murni mekanisme serap (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan). Pemindahan kromatografi adalah prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk kromatografi matriks (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs yang mengikat, dan dengan demikian menggantikan semua molekul dengan afinitas yang lebih rendah. Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi. Dalam mode elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom dalam sempit, puncak Gaussian. Wide pemisahan puncak, sebaiknya data dasar, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran bergerak ke bawah kolom dalam modus elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk bepergian dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. parameter operasi disesuaikan untuk memaksimalkan pengaruh dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom rendah. Jadi, dua kelemahan untuk kromatografi elusi mode, terutama pada skala preparatif, kompleksitas operasional, karena gradien memompa pelarut, dan throughput yang rendah, karena beban kolom rendah. Kromatografi pemindahan memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikanndalam zona berturut – turut zat murni bukan ”puncak”. Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom yang diberikan dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi yang lebih tinggi secara signifikan. 6
Kromatografi fase terbalik (RPC) adalah sebuah kromatogram dari campuran kompleks (air parfum) yang diperoleh HPLC fasa terbalik untuk detail lebih lanjut t entang topik ini, lihat kromatografi Terbalik-fase. HPLC fasa terbalik (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase stasioner non-polar dan fase, air bergerak agak polar. Satu fase stasioner umum adalah silika yang telah diobati dengan RMe2SiCl, dimana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C18H37 atau C8H17. Dengan fasa diam, waktu retensi lebih lama bagi molekul yang lebih non-polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. Seorang penyidik dapat meningkatkan waktu retensi dengan menambahkan lebih banyak air ke fase bergerak; sehingga membuat afinitas dari analit hidrofobik untuk fase diam hidrofobik kuat relatif terhadap fase bergerak sekarang lebih hidrofilik. Demikian pula, seorang penyelidik dapat menurunkan waktu retensi dengan menambahkan lebih pelarut organik eluen. RPC sangat umum digunakan sehingga sering salah disebut sebagai "HPLC" tanpa spesifikasi lebih lanjut. Industri farmasi secara teratur menggunakan RPC untuk memenuhi syarat obat sebelum rilis mereka. RPC beroperasi pada prinsip kekuatan hidrofobik, yang berasal dari simetri tinggi dalam struktur air dipole dan memainkan peran paling penting dalam semua proses dalam ilmu kehidupan. RPC memungkinkan pengukuran gaya-gaya interaktif. Pengikatan analit ke fase stasioner sebanding dengan luas permukaan kontak sekitar segmen non-polar dari molekul analit pada asosiasi dengan ligan dalam eluen air. Efek ini solvophobic didominasi oleh kekuatan air untuk "-pengurangan rongga" di sekitar analit dan rantai C18-versus kompleks keduanya. Energi yang dilepaskan dalam proses ini adalah sebanding dengan tegangan permukaan eluen (air: 7,3 × 10-6 J / cm ², metanol: 2,2 × 10-6 J / cm ²) dan permukaan hidrofobik dari analit dan ligan masing-masing . retensi ini dapat dikurangi dengan menambahkan sedikit pelarut polar (metanol, asetonitril) ke dalam fase gerak untuk mengurangi tegangan permukaan air. Gradient elusi menggunakan efek ini dengan secara otomatis mengurangi polaritas dan tegangan permukaan fase gerak air selama analisis. sifat struktur pada molekul analit memainkan peran penting dalam karakteristik retensi. Secara umum, sebuah analit dengan luas permukaan yang lebih besar hidrofobik (CH, CC, dan obligasi atom umumnya non-polar, seperti SS dan lain-lain) hasil dalam waktu retensi lebih lama karena meningkatkan permukaan non-polar molekul's area, yang tidak berinteraksi dengan struktur air. Di sisi lain, kelompok polar, seperti-OH,-NH2, COO-atau NH3 + mengurangi retensi seperti yang terintegrasi dengan baik ke dalam air. Sangat molekul besar, bagaimanapun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara 7
permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah pori-pori memasuki fase diam. Retensi waktu meningkat dengan hidrofobik (non-polar) l uas permukaan. senyawa rantai Branched mengelusi lebih cepat dari isomer yang berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Demikian pula senyawa organik dengan satu obligasi CC mengelusi kemudian dibandingkan dengan C = C atau ikatan CC-tiga, sebagai ikatan ganda atau tiga lebih pendek dari ikatan-CC tunggal. Selain dari fase tegangan permukaan mobile (kekuatan organisasi dalam struktur eluen), lain pengubah fase gerak dapat mempengaruhi retensi analit. Misalnya, penambahan garam anorganik menyebabkan kenaikan linier moderat dalam tegangan permukaan larutan mengandung air (sekitar 1,5 × 10-7 J / cm ² per Mol untuk NaCl, 2,5 × 10-7 J / cm ² per Mol untuk (NH4) 2SO4), dan karena entropi dari antarmuka analit-pelarut dikendalikan oleh tegangan permukaan, penambahan garam cenderung meningkatkan waktu retensi. Teknik ini digunakan untuk pemisahan ringan dan pemulihan protein dan perlindungan dari kegiatan biologis mereka dalam analisis protein (kromatografi interaksi hidrofobik, HIC). Komponen penting lainnya adalah pengaruh pH karena ini dapat mengubah sifat hidrofobik analit. Untuk alasan ini metode yang paling menggunakan agen buffering, seperti natrium fosfat, untuk mengendalikan pH. Buffer melayani beberapa tujuan: mereka kontrol pH, menetralkan muatan pada setiap terpapar silika residual pada fase diam dan bertindak sebagai agen pasangan ion untuk menetralkan muatan analit. formate Amonium biasanya ditambahkan dalam spektrometri massa untuk meningkatkan deteksi analit tertentu dengan pembentukan adduct amonium. Suatu asam organik yang mudah menguap seperti asam asetat, atau paling sering asam format, sering ditambahkan ke fase mobile jika spektrometri massa digunakan untuk menganalisis kolom eluen. Trifluoroacetic Asam jarang digunakan dalam aplikasi spektrometri massa karena kegigihan dalam detektor dan sistem pengiriman pelarut, tetapi dapat secara efektif meningkatkan retensi analit seperti asam karboksilat dalam aplikasi menggunakan detektor lainnya, karena merupakan salah satu asam organik kuat. Pengaruh asam dan buffer berbeda-beda oleh aplikasi namun pada umumnya meningkatkan kromatografi. Kolom fase Terbalik cukup sulit untuk kerusakan dibandingkan dengan kolom silika normal, namun banyak kolom fase balik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan dasar air karena ini akan menghancurkan partikel silika yang mendasarinya. Mereka dapat digunakan dengan air asam, tapi kolom tidak boleh terkena asam terlalu lama, karena dapat menimbulkan korosi bagian logam dari peralatan HPLC. 8
RP-HPLC Kolom ini harus dibilas dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk membuang asam sisa atau buffer, dan disimpan dalam komposisi yang sesuai pelarut. Kandungan logam dari kolom HPLC harus disimpan rendah jika kemampuan terbaik untuk zat yang terpisah harus ditahan. Sebuah tes yang baik untuk kandungan logam kolom adalah untuk menyuntikkan sample yang merupakan campuran 2,2’ – 4,4’ – bipiridin. Karena 2,2 ' bipy bisa chelate logam, bentuk dari puncak untuk 2,2'-bipy akan terdistorsi (tailed) ketika ion logam yang hadir pada permukaan silika. Ukuran-kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai permeasi kromatografi gel atau kromatografi filtrasi gel, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. Ini umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk, akhir langkah "polishing" dari suatu pemurnian. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuartener protein dimurnikan. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul besar seperti protein atau polimer. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil di pori-pori partikel. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori. Oleh karena it u molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat dari molekul yang lebih kecil, yaitu semakin kecil molekul, semakin lama waktu retensi. Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida. SEC adalah teknik resmi (disarankan oleh Pharmacopeia Eropa) untuk perbandingan berat molekul yang berbeda heparins tersedia secara komersial berat molekul rendah. Pertukaran ion kromatografi (Kromatografi Ion-exchange), retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Ion dari biaya yang sama tidak termasuk. Jenis penukar ion antara lain: • Polystyrene resin - ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilit as dari rantai. linkage Tinggi lintas mengurangi swerving, yang meningkatkan waktu equilibrium dan akhirnya meningkatkan selektivitas. • Selulosa dan penukar ion dekstran (gel) - ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan biaya rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein. • Terkendali-pori kaca atau silika berpori secara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya yang lebih tinggi dan radius yang lebih kecil. Peningkatan ion counter (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) mengurangi konsentrasi waktu retensi. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sedangkan penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion. 9
Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut : pemurnian air, prakonsentrasi jejak komponen, pertukaran ligan-kromatografi, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi pH kromatografi pertukaran anion karbohidrat dan oligosakarida, dan lain – lain. Bioaffinity kromatografi, proses kromatografi bergantung pada properti dari bahan biologis aktif untuk membentuk kompleks stabil, spesifik, dan reversibel. Pembentukan kompleks ini melibatkan partisi pasukan molekul umum seperti interaksi Van der Waals, interaksi elektrostatik, interaksi dipol-dipol, interaksi hidrofobik, dan ikatan hidrogen. Ikatan efisien biospecific dibentuk oleh tindakan simultan dan terpadu dari beberapa gaya-gaya dalam situs pengikatan pelengkap. Berair kromatografi fase normal (ANP) adalah suat u kromatografi yang meliputi wilayah fase antara kromatografi fase terbalik (RP) dan organik kromatografi fasa normal (ONP). Teknik ini digunakan untuk mencapai selektivitas unik untuk senyawa hidrofil, elusi menunjukkan fasa normal menggunakan pelarut reverse-fase. Isokratik aliran dan elusi gradien adalah sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak tetap konstan selama prosedur ini disebut isokratik (makna komposisi konstan). Kata ini diciptakan oleh Csaba Horvath yang merupakan salah satu pelopor HPLC. Komposisi fase gerak tidak harus tetap konstan. Sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak berubah selama proses pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien. Salah satu contoh adalah gradien mulai 10% metanol dan berakhir di 90 metanol% setelah 20 menit. Dua komponen dari fase gerak biasanya disebut "A" dan "B"; A adalah "lemah" pelar ut yang memungkinkan terlarut ke mengelusi hanya perlahan-lahan, sedangkan B adalah "kuat" pelarut yang cepat elutes yang zat terlarut dari kolom . Pelarut adalah sering air, sedangkan B adalah larut pelarut organik dengan air, seperti asetonitril, metanol, THF, atau isopropanol.
2.4
Elusi isokratik
Dalam elusi isokratik, meningkat lebar puncak dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kelemahan yang memuncak akhir-eluting menjadi sangat datar dan luas. bentuk mereka dan lebar bisa mencegah mereka diakui sebagai puncak. Elusi Gradient menurunkan retensi komponen nanti-eluting sehingga mereka mengelusi cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak. Hal ini juga meningkatkan bentuk puncak puncak tailed, sebagai peningkatan konsentrasi eluen organik mendorong bagian tailing dari puncak ke depan. Hal ini juga 10
meningkatkan tinggi puncak (puncak tampak "lebih tajam"), yang penting dalam analisis jejak. Program gradien mungkin termasuk tiba – tiba langkah peningkatan persentase komponen organik atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda – beda pada waktu yang berbeda semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimal dalam waktu minimum. Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter bagian dalam) perubahan - yaitu, puncak mengelusi dalam urutan yang sama. Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau mengubah laju alir. Kekuatan pendorong dalam kromatografi fase terbalik berasal dalam urutan tinggi struktur air. Peran komponen organik dari fase gerak adalah untuk mengurangi urutan tinggi dan dengan demikian mengurangi kekuatan penghambat dari komponen air.
2.5
Parameter
-
Ukuran partikel Kebanyakan HPLC tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar kecil partikel silika bulat (manik-manik yang sangat kecil). Partikel ini datang dalam berbagai ukuran dengan 5 manik-manik pM yang paling umum. partikel yang lebih kecil pada umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk optimal meningkatkan kecepatan lin ier dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel. [3] [4] [5] Ini berarti bahwa mengubah untuk partikel yang separuh besar, menjaga ukuran kolom yang sama, akan menggandakan kinerja, tetapi meningkatkan tekanan yang dibutuhkan dengan faktor empat. Partikel yang lebih besar digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm samapai dengan >30 cm) dan untuk aplikasu non-HPLC seperti ekstraksi fasa padat.
-
Ukuran pori Fasa diam banyak berpori untuk memberikan luas permukaan yang lebih besar. Pori – pori kecil memebrikan luas permukaan yang lebih besar sedangkan ukuran pori yang lebih besar memiliki kinetika yang lebih baik, terutama untuk analiit yang lebih besar. Sebagai contoh, sebuah protein yang hanya sedikit lebih kecil daripada pori mungkin memasuki pori-pori tetapi tidak mudah meninggalkan begitu dalam.
-
Pompa tekanan Pompa bervariasi dalam kapasitas tekanan, tetapi kinerja mereka diukur pada kemampuan mereka untuk menghasilkan laju alir konsisten dan direproduksi. Tekanan dapat mencapai setinggi 40 MPa (6000 lbf/in2), atau sekitar 400 atmosfer. Modern 11
HPLC sistem telah ditingkatkan untuk bekerja pada tekanan jauh lebih tinggi, dan oleh karena itu dapat menggunakan ukuran partikel jauh lebih kecil di kolom (<2 pM). HPLC atau RSLC / UHPLC (dapat bekerja sampai dengan 100 Mpa (15.000 lbf / in 2), atau sekitar 100 atmosfer. Istilah "UPLC" adalah merek dagang dari Corporation Waters, tetapi kadang-kadang digunakan untuk merujuk pada te knik yang lebih umum.
12
BAB III PENUTUP
3.1
Kesimpulan Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya yang sangat meningkatkan bentuk kromatografi kolom. Alih-alih pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, terpaksa melalui bawah tekanan tinggi sampai dengan 400 atmosfer. Itu membuatnya lebih cepat. Hal ini juga memungkinkan Anda untuk menggunakan ukuran partikel kecil yang sangat banyak untuk kolom isian materi yang memberikan permukaan yang jauh lebih besar area untuk interaksi antara fasa diam dan molekul yang mengalir melewatinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik komponen campuran. Perbaikan utama l ain dari kromatografi kolom kekhawatiran metode pendeteksian yang dapat digunakan. Ini Metode ini sangat otomatis dan sangat sensitif.
Pengoperasian
A = Wadah Eluent B = Katup elektromagnetik pencampuran dengan Double piston pompa C = 6 cara katup 13
D = Tekanan loop kompensasi untuk menyamakan pulsa pompa pompa E = Mixing ruang F = Rheodyne katup injeksi G = Kolom H = HPLC unit I = detektor unit (misalnya, UV-spektrometer) J = Computer-Interface K = PC L = printer untuk output hasil
Sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil untuk aliran fase gerak. Mosi analit melalui kolom diperlambat oleh kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam karena melintasi panjang kolom. Berapa analit diperlambat t ergantung pada sifat analit dan pada komposisi dari fasa diam dan mobile. Waktu di mana suatu elutes analit tertentu (yang keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap mengidentifikasi karakteristik yang cukup unik dari analit diberikan. Penggunaan kemasan ukuran partikel yang lebih kecil kolom (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan linear (kecepatan) memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk difusi atau berdifusi dalam kolom, yang mengarah ke resolusi ditingkatkan dalam dihasilkan Kromatografi / kromatogram. Umum pelarut digunakan termasuk kombinasi pelarut dari air (molekul) atau cai ran berbagai organik (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril. Air mungkin mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit, atau senyawa seperti asam trifluoroacetic yang bertindak sebagai agen ion pasangan.
Tipe Partition chromatography
Kromatografi partisi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. Prinsip koefisien partisi telah diterapkan di kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, fasa gas dan aplikasi cair-cair. Tahun 1952 Hadiah Nobel di bidang kimia telah diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino. kromatografi partisi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari sebuah "inert" solid matrik pendukung seperti kromatografi kertas, atau mengambil keuntungan dari beberapa tambahan muatan dan / atau interaksi 14
hidrogen donor dengan dukungan solid. Molekul menyetimbangkan (partisi) antara fas e diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Hidrofilik Interaksi Kromatografi (HILIC) dalam HPLC, metode ini memisahkan analit berdasarkan perbedaan kutub. HILIC paling sering menggunakan fase diam terikat kutub dan air non-polar, larut, fase gerak. HPLC partisi t elah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan dari memisahkan zat terlarut asam, dasar dan netral dalam kromatogram tunggal.
Elusi isokratik
Dalam elusi isokratik, meningkat lebar puncak dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kelemahan yang memuncak akhir-eluting menjadi sangat datar dan luas. bentuk mereka dan lebar bisa mencegah mereka diakui sebagai puncak. Elusi Gradient menurunkan retensi komponen nanti-eluting sehingga mereka mengelusi cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak.
Parameter -
Ukuran partikel
-
Ukuran pori
-
Pompa tekanan
15
DAFTAR PUSTAKA
Johnson, E. L. and Steven son, R (1978). Basic liquid chromatography. Varian, California Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy.second edition, John Wiley &Sons, Chischer, New York, Brisbane, Toronto, Singapore http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC.gif 14/ http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography
16
