DETERMINACION DE ACETAMINOFEN EN UN JARABE POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) Escobar C., 0747075; Giraldo C., 0740526 Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Química, Tecnología Química, Universidad del Valle, Cali, Colombia 2 de Mayo de 2010 RESUMEN La práctica realizada consistió en la determinación por cromatografía (HPLC) del contenido de acetaminofen en un jarabe. Para ello se utilizo una solución stock de 400 ppm de acetaminofen preparada por disolución del reactivo grado analítico, de esta se tomaron tomaron alícuotas que posteriormente fueron disueltas quedando estas con concentraciones de 20, 40, 60 y 80 ppm. A estas estas soluciones se les determino el contenido de acetaminofen por cromatografía obteniendo picos de concentración de acetaminofen (áreas bajo la curva), con estas se realizo una curva de calibración y por interpolación de la señal obtenida para la muestra problema se determina la concentración de esta, luego por cálculos de dilución obtenemos la concentración de acetaminofen en el jarabe siendo esta de 23014.6253±0.0032 ppm para la primera muestra y 16894.2153±0.0032 ppm para la segunda. Como fase móvil para la cromatografía fue utilizada una solución 50:50 de agua-metanol.
CÁLCULOS Y RESULTADOS A partir de acetaminofen grado analítico se preparo una solución estándar para posteriormente diluirla y construir la curva de calibración
Luego se tomaron alícuotas que fueron diluidas para preparar estándares a los cuales se les determino el contenido de acetaminofen por HPLC, obteniendo los siguientes resultados
] ppm Área mAU *s (±0.005) (±0.0001) 20 2914.5347 40 5535.6421 60 8481.2998 80 1.00529 x 104 [
Tabla 1. Datos de [ ] y Área bajo la curva
Con los datos anteriores se realizo una grafica para por extrapolación determinar la concentración de la muestra problema 12000 9000
] s * 6000 U A m 3000 [ a e r Á 0 0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
Acetaminofen (ppm)
Grafica 1. Curva de calibración para el acetaminofen
Por método de mínimos cuadrados se determino la siguiente ecuación de la recta
y
Concentración de acetaminofen en el jarabe Muestra Área mAU *s (±0.0001) 1 6262.4419 2 4771.4639
Tabla 2. Áreas obtenidas para las muestras problema
Con los datos obtenidos de área bajo la curva para las muestras problemas obtenemos la concentración de acetaminofen en las disoluciones, luego multiplican las concentraciones obtenidas por el factor de dilución y así hallamos la concentración de acetaminofen en el jarabe original
Ahora utilizamos el factor de dilución
Realizando el mismo calculo para la segunda absorbancia obtenida
Podemos observar que ninguna de estas concentraciones se asemeja a la real del producto, ahora calcularemos
los porcentajes de error, para así tener una medida de que tan errónea se realizo la práctica.
El error para el segundo seria
Como podemos inferir de los porcentajes de error la práctica no fue llevada a cabo de la mejor manera.
DISCUSIÓN La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. En la práctica se llevó a cabo la determinación del contenido de
acetaminofen en una muestra de jarabe por medio de la cromatografía liquida de alta resolución, para la preparación de esa muestra se utilizo un jarabe con una concentración 30000 ppm del cual debimos tomar una alícuota de 0.5 mL para diluirla 10 mL y así obtener una concentración 1500 ppm; de esta se tomo una alícuota 1.0 mL y se diluyo 25 mL para así obtener una concentración final de 60 ppm de acetaminofen. Los errores en los resultados se deben principalmente al mal uso que se le puede dar las pipetas, a la dificulta que se tenga en el manejo de la muestra, para que a la hora de diluirla muestra tomada sean las muestras exactas las que se necesita y no más ni menos porque al final las diferencias se notaron en los resultados obtenidos por arrojaron resultados muy diferentes entre sí; llevando así a distintos resultados en cuanto a la concentración real del acetaminofen, de lo cual podríamos inferir que el análisis realizado fue muy mal manejado. La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada, esto se debe a su alta sensibilidad, y sus determinaciones cuantitativas exactas, su capacidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria , salud, medioambiente. Algunos ejemplos de estas sustancias incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad
de sustancias inorgánicas(I), por lo cual es ampliamente usada en el control de calidad de medicamentos y en determinación de ingredientes activos en productos farmacéuticos. Para la determinación de acetaminofen llevada a cabo se tiene en cuenta su polaridad por lo cual, es afín a sustancias polares, razón para realizar la cromatografía de fase inversa en donde se utiliza una fase estacionaria apolar y una fase móvil polar, en nuestro caso una mezcla 50:50 de etanol-agua la cual arrastra a su paso el acetaminofen presente en la muestra, el tiempo de retención de este depende de su afinidad con la fase móvil o la fase estacionaria, observamos un tiempo de retención bajo (1.723 minutos aproximadamente) con lo cual comprobamos la polaridad del acetaminofen. Una representación del equipo puede verse en la figura 1; este equipo tiene cuatro recipientes donde se recopilan los disolventes, cada recipiente posee un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas solidas en suspensión de los disolventes.
Figura 1. Representación esquemática de un equipo de HPLC
Para que la fase móvil se desplace a través de la columna y los demás dispositivos, los equipos emplean un sistema de bombeo. Un limitante en la precisión de las medidas es la reproducibilidad que se puede introducir la muestra en la columna. La dificultad es por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Los volúmenes son muy pequeños (de unas pocas decimas de microlitro a tal vez 500 µL). El cromatógrafo emplea un bucle de muestra (ver figura 2), éste dispositivo nos permite la elección de tamaños de muestra que van desde 5 a 500 µL. La muestra se introduce en el bucle mediante una microjeringa que toma un volumen (en este caso 20 µL) y lo traslada al cromatógrafo.
Figura 2. Representación esquemática de un bucle de muestra.
Las columnas se construyen con un tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme el cual oscila entre 4 y 10 mm, tienen una longitud promedio entre 10 y 30 cm y los tamaños de partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm. Habitualmente las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. La columna empleada fue la de C 18, se llama de esta manera porque se compone de octadecil polisiloxano el cual es absorbido sobre el interior de la columna, este tipo de columnas se caracterizan por ser de naturaleza apolar. Las columnas C 18 son las más ampliamente utilizadas en HPLC de fase reversa, es importante distinguir entre dos formatos de fase con enlace distinto. El formato C18 de tipo monomérico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un único átomo de sílice sobre la estructura del gel de sílice. Las columnas de tipo monomérico C18-MS-II y la serie MS tiene una excelente reproducibilidad de síntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodos de tiempo para la estabilización de la fase móvil. Por otro lado el formato C18 polimérico incorpora un proceso de silanización trifuncional por el que el grupo octadecil se une a 2 ó 3 átomos de sílice sobre la estructura del gel de sílice. Esto aumenta el efecto de la silanización lo que proporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente en condiciones ácidas de la fase
móvil. La capacidad de reconocimiento estérico también es mucho mayor que las de las columnas C 18 del tipo de silanización mono funcional. Los solventes fueron desgacificados por filtrado a gravedad a través de un filtro de poros muy pequeños con el objetivo de eliminar los gases disueltos y las partículas de polvo o partículas solidas en solvente
Figura 3. Representación esquemática de un detector UV El más utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotómetro, que registra sustancias que absorben la radiación ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elución en gradiente
SOLUCIÓN AL CUESTIONARIO 1) Cuál es la composición de la columna C18 usado en la práctica? Explique. R/ Esta pregunta se contesto en el análisis. 2) Si usted posee una opción de realizar un análisis por HPLC o cromatografía de gases, cuál de
los dos métodos porque?
recomienda y
R/ La cromatografía liquida de alta resolución y cromatografía gas, cuando se pueden aplicar ambas técnicas, la cromatografía de gas presenta la ventaja de su rapidez y sencillez de equipo y se aplica a compuestos que son volátiles en forma apreciable y térmicamente estables a temperaturas superiores, a unos cientos de grados Celsius. Por otra parte la cromatografía liquida de alta resolución puede aplicarse a sustancias no volátiles (incluso iones inorgánicos) y a productos térmicamente inestables, lo que no es posible con la cromatografía de gas liquido. Con frecuencia los dos métodos son complementarios. 3) Explique porque en HPLC realizar la cuantificación con curva de calibración es precisa mientras que cromatografía de gases es aconsejable realizada con el uso de un patrón interno R/ en cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue con el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyección de la muestra. En este procedimiento se introduce en cada estándar y en la muestra una cantidad exactamente medida de patrón interno y la relación de las áreas (o alturas) del analito y del patrón interno sirven como parámetro analítico.
Para poder aplicar este método satisfactoriamente es necesario que el pico del patrón interno este bien separado de los picos de los demás componentes de la muestra; por otra parte el pico del patrón debería aparecer cerca del pico del analito. Con un patrón interno adecuado se pueden conseguir precisiones relativas mejores que el 1%.
comunes el UV-Vis y el infrarrojo, la utilización du un tipo de detector en especial depende del analito.
CONCLUSIONES
Es una técnica muy útil y precisa para la separación, identificación y cuantificación de los componentes presentes en una muestra determinada, de especial importancia en la industria farmacéutica al ser de carácter decisorio para determinar la calidad, estabilidad y tiempo de expiración de un producto. Es muy importante filtrar los solventes a utilizar, ya que se pueden encontrar partículas disueltas en ellos que afecten el resultado o dañen el instrumento. Es necesario tener cuidado especial con la fase móvil utilizada, la cual no puedo contener gases, que afectarían seriamente el equipo pudiendo dañarlo, para su eliminación se usa principalmente el filtrado al vacio. Es posible la utilización de distintos tipos de detectores, siendo los más
En una técnica con tan buenos limites de detección es de especial importancia la destreza del analista, ya aunque obtuvimos resultados muy por debajo de lo esperado, es posible obtenerlos sobrepasando los valores reales, para lo cual unos cuantos microlitros de mas bastaría para dar valores erróneos.
BIBLIOGRAFIA I.
SKOOG, HOLLER. LEARY. Principios de Análisis instrumental. 5ed. Madrid: McGraw Hill, 1994. 730-794 pp.
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MILLER, J. N. and MILLER J. Estadística Química Analítica 2ed. Addison-Wesley Iberoamericana; pág. 87- 100.
V.
http://www.scribd.com/doc/17065477/ HPLC-Aplicaciones-en-compuestosorganicos (28/04/2010).
