CHAPITRE 6 La chromatographie liquide haute g p q p performance (HPLC) ( )
0.1
1. Introduction
5 7
0.09
2. Pompes 3 Injecteurs 3. 4. Colonnes et Phases 5. Détecteurs
Absorbance at 273nm
0.08
8
0.07
10
0.06
2 4 3 6
0.05 0.04
15
12 13 11
14
9
0.03 0.02
6 Applications 6.
0 01 0.01 0 0
10
20
30 40 Retention Time (min)
Analysis of photodegradation products of metoclopramide solutions A Maquille B Tilquin and J ‐LL. Habib Jiwan A. Maquille, B. Tilquin and J. Habib Jiwan
50
60
1 INTRODUCTION 1. INTRODUCTION HPLC : phase mobile liquide phase stationnaire très finement divisée Injection de l’éluant sous des pressions de plusieurs centaines d b de bars pour obtenir un débit suffisant. b i débi ffi Possibilité d’agir de manière très précise sur la sélectivité b l é d’ d è è é l él é entre les composés par le choix de la PS et de la composition de la PM de la PM Î Exploitation des interactions soluté/PM/PS
2 POMPES 2. POMPES Pompes débitmétriques conçues pour maintenir un débit non P débit ét i i t i débit pulsé et stable. Présence de gaz dissous (N2, O Présence de gaz dissous (N O2, CO CO2,…) dans les solvants Î ) dans les solvants Î nécessité de dégazer les solvants par ultrasons ou barbotage d’hélium. Eluant de composition fixe : mode isocratique Î 1 pompe Eluant de composition variable = gradient d Eluant de composition variable gradient d’élution élution Î Î pompe pompe binaire, ternaire ou quaternaire selon le nombre de solvants qu’elle peut mélanger
solvant A
solvant B
solvant A
solvant B
pompe 1
pompe 2
vanne proportionnelle
chambre de mélange
pompe haute pression i
Gradient basse pression
Contrôleur Contrôleur de débit
colonne
chambre de mélange
Gradient haute pression
Pompe quaternaire
3 INJECTEURS 3. INJECTEURS IInjection rapide d’un volume précis Î j ti id d’ l é i Î vanne haute pression à h t i à plusieurs voies manuelle ou automatique Fonctionnement en 2 temps : •Chargement : communication entre pompe et colonne seulement, i introduction de l’échantillon à pression atmosphérique à l’aide d’une d i d l’é h ill à i hé i à l’ id d’ seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle (nombreux choix de volumes) •Injection : insertion de l’échantillon dans le flux de PM par rotation de la vanne Î inversion du sens de circulation dans la boucle
Bonne reproductibilité des volumes si la boucle a été totalement remplie par l’échantillon (volume prélevé de 5 à 10 fois > volume boucle)
Boucle d’injection
reproductibilité du volume injecté
4 COLONNES ET PHASES 4. COLONNES ET PHASES C l Colonne = tube droit, calibré, en acier t b d it lib é i Phase stationnaire maintenue entre 2 disques poreux situés à ses extrémités dont les volumes morts sont aussi faibles que possible Tendance : réduction de la longueur et du diamètre interne ÎDiminution du débit jusqu’à quelques µL/min ÎC ÎConsommation réduite d’éluant ti éd it d’él t ÎMeilleure résolution ÎPlus grande sensibilité ÎCouplage LC/MS plus facile ÎCouplage LC/MS plus facile
Colonnes : ID (mm)
Type Analytical Solvent saver
Narrowbore
Microbore
Capillary
4.6 3.0
2.1
1.0
0.5 ‐ 0.3
Sample Load (approx.) 0.1 – 1.5 mg 150 ‐ 500 µg
50 – 120 µg
10 ‐ 50 µg
1 ‐ 10 µg
Typical Flow Rate
Relative Sensitivity
Applications
0.5 ‐3 ml/min
Standard separations
0.3 ‐ 1.5 ml/min
+
Save solvent Standard HPLC instruments
++
High sensitivity Limited sample LC/MS
+++
High sensitivity High sensitivity Limited sample LC/MS
++++
Very high sensitivity LC/MS Peptides and proteins
+++++
Very high sensitivity LC/MS Peptides and proteins
0.1 ‐ 0.5 ml/min
10 ‐ 100 µL/min
1 ‐15 µl/min
Nano
0.1 ‐ 0.075 0.1
100 ‐ 200 ng 100 200 ng
200 ‐ 500 nl/min 200 500 nl/min
Semi‐prep
9.4
1 ‐ 10 mg
5 ‐ 10 ml/min
mg preparative separation
Preparative
21
20 250 mg 20 ‐ 250 mg
20 60 ml/min 20 ‐ 60 ml/min
Hundreds mg up to 1 g Hundreds mg up to 1 g
Phases : • Chromatographie sur phase normale g p p • Chromatographie sur phase inverse • Chromatographie par paires d’ions • Chromatographie par échange d Chromatographie par échange d’ions ions (cf chap 7) (cf chap 7) • Chromatographie par exclusion stérique (cf chap 7) • Chromatographie chirale • Fast HPLC Fast HPLC
Classification des phases : Classification des phases : •Type (monolithique, poreuse, non poreuse) •Matériaux de base (silice, zircone, polymère,…) Géométrie (surface, volume et diamètre des pores, taille (surface, volume et diamètre des pores, taille •Géométrie et forme des particules,…) •Chimie de surface (type de ligands liés ) •Chimie de surface (type de ligands liés, …)
Type yp Majorité : particules poreuses de diamètre entre 3 et 10 µm La porosité augmente la surface nécessaire à la rétention de l’analyte La porosité augmente la surface nécessaire à la rétention de l analyte (de 100 (de 100 à 400 m2/g). L’espace inter‐particule permet des débits de 1 à 3 mL/min avec des pressions acceptables. t bl
≈ 1995 : introduction des particules sphériques non poreuses But : augmenter l’efficacité Mais :
‐ volume inter‐particule important Î p p élargissement des pics g p ‐ ↓ de la surface Î ↓ de la capacité de chargement nécessité d’injecter injecter des microvolumes des microvolumes ‐ nécessité d
≈ 1990‐2000 : Colonnes monolithiques : macropores de 4000 à 6000 Å macropores de 4000 à 6000 Å et mésopores de 20 à 500 Å occupant 80% du volume de la colonne
Matériaux de base de la colonne Matériaux de base de la colonne Matériaux
Gamme de pH Gamme de pH
Silice
2‐8 2 8
Alumine
6‐12
Zircone
7‐13
Polymères (styrène/divinylbenzène) 1‐13 Graphite poreux
1‐13
Géométrie
Diamètre des particules Uniformité des particules Taille des pores Particule sphérique de silice macroporeuse
Chimie de la silice Très polaire par la présence des fonctions silanols Î Î séparation basée sur les coefficients d’adsorption Hydrogen bonded vicinal silanol goups
Siloxane bonds IIsolated l t d silanol goups
Geminal silanol goups
Modifications chimiques de la silice : les silices greffées Fixation de molécules organiques sur les fonctions silanols par des liaisons Fi i d lé l i l f i il l d li i covalentes Î ajustement de la polarité Î séparation basée sur les coefficients de partage
Couche Couche monomérique monochlorosilane
di‐ ou trichlorosilane
Couche Couche polymérique
R = (CH2)17CH3 R = (CH
octadecyl (C18) octadecyl (C18)
R = (CH2) 7CH3
octyl (C8)
R = (CH R (CH2)3C6H5
phenyl propyl phenyl propyl
R = (CH2)6C6H5
phenyl hexyl
R = (CH R (CH2)3NH2
aminopropyl
R = (CH2)3CN
cyanopropyl
R = (CH ( 2)2OCH2CH(OH)CH ( ) 2OH
diol
Bonded phases
End‐capping Silanisation secondaire avec du TMS Î désactivation des sites de silanols restés libres
soluté Si Si O OH
OH
OH
OH
O
Augmentation du taux de couverture Moins d’interactions solutés – silanols
soluté Moins d’interférences dans le processus chromatographique
X Si Si
Si
O
O
Si
O O
Si O
Si O
Moins de tailing Meilleure reproductibilité
Chromatographie sur phase normale g p p ‐ silice poreuse
SiO2
Phase normale : mode d’interaction
Adsorption Interactions polaires – ponts hydrogènes Phase stationnaire polaire
Phase mobile : solvants non ou peu polaires
Chromatographie sur phase inverse g p p
Partage entre PM et PS Phase stationnaire apolaire
SiO2
Phase mobile : solvants polaires
Exemple RP – C18
Source : Thermo Fisher
Reverse – phase avec 100% H2O comme PM ??? MeCN H2O
MeCN H2O
H2O
MeCN
H2O MeCN MeCN
MeCN
MeCN
conditions normales ex: H2O/ACN 50/50
conditions initiales 100% H2O 100% H H2O H2O
H2O H2O
H2O
H2O H2O
après 10 volumes de colonne de PM à 100% H2O
Reverse phase avec 100% H Reverse – phase avec 100% H2O comme PM : solution O comme PM solution « polar shielding »
MeCN
M CN MeCN
H2O
H2O H2O
H2O
P MeCN
MeCN
MeCN MeCN
Phases greffées et interactions hydrophiles HILIC mode Peut être considérée comme une chromatographie en phase normale avec une phase mobile aqueuse‐organique h bil i Colonnes HILIC plus polaires que colonnes RP Î augmentation du % d’eau dans la PM Î diminution de la rétention (inverse de la RP)
Séparation d’oligosaccharides par HILIC, variation du % eau de la PM
Exemples : HILIC mode Phase amino propyl
Mixte : RP, HILIC, échange anion faible suivant PM
Source : Phenomenex
Phase cyano propyl
Accepteur pont H Accepteur pont H CN
Diltiazem N C N O
O O
Verapamil
O
Nicardipine
H N H3CO
Nifedipine p Source : Grace Davison
OCH3 O
O NO2
Phase Zic HILIC
zwitterionic
Source : SeQuant
C18 RP mode
NH2 RP mode S.U. Bajad et al JCA, 1125 (2006) 76‐88
CN HILIC CN HILIC mode d
CH 2 OH O
H HO
SiO2 HILIC mode
OH
H OH
H
H
NH 2
H
O
OH O
N
N
H
H
O H2N
NH2
Amide HILIC mode
NH2 N
NH2 HILIC mode
P
P
P
O
O
O
OH
OH
N
Phase en graphite poreux : Particules sphériques de carbone poreux Ad Adsorption ti Interactions : Interactions : Hydrophobes π – π Dipôles‐dipôles induits
Source Thermo Fisher
Phase en graphite poreux :
Source Thermo Fisher
Phases mobiles Phases mobiles Choix du solvant : Choix du solvant : Qualité HPLC Ö pas de stabilisants, filtrés 0.45 µm, dégazés Mode isocratique : un (mélange de) solvant(s) Mode gradient : variation de la composition durant l’élution Phase normale : solvant peu ou non polaire (Hexane, CH2Cl2) Phase inverse : solvant polaire (H2O, MeOH, ACN) Modification de la polarité de la PM Î modification du coefficient de distribution K (CS/CM) Î modification du facteur de rétention k
4 types d’interactions entre molécules de solvant et de soluté : • ionique (quand soluté et solvant ont des moments dipolaires) ( d l é l d d l ) • de dispersion (due à l’attraction entre elles des molécules voisines) • diélectriques (favorisent la dissolution des solutés ioniques dans les solvants polaires) l t l i ) • par ponts H (entre donneur et accepteur de protons) Solvant l
Indice de d d polarité
Densité é (g/ml)
Limite UV (nm)
Indice de d d réfraction
Pt d’ébullition (°C)
Eau
10
1
190
1.333
100
Méthanol
5.1
0.791
205
1.326
65
Acétonitrile
5.8
0.786
190
1.341
82
Isopropanol
3.9
0.785
210
1.384
82
Tetrahydro furane
4
0 881 0.881
220
1 405 1.405
66
Solvent properties and miscibility
Source Thermo Fisher
Force éluante des solvants et sélectivité Force éluante des solvants et sélectivité
2
Analyse sur RP18 avec différents mélanges CH3CN/H20 Débit : 1 ml/min
100 % ACN
40 % ACN PP + NB
PP + NB
sec.
sec. 80 % ACN
30%%ACN 30 % ACN ACN 30 % ACN 30
PP
PP + NB NB
sec. 60 % ACN
sec. 20 % ACN
PP
NB PP
NB
sec.
sec.
Elution à gradient : Utilisée quand l’élution isocratique ne permet pas une bonne séparation ou que la séparation est trop longue Gradient : changement continu de la phase mobile pendant la séparation
Séparation d’un mélange d’herbicides d herbicides sur RP C18: sur RP C18: a) Isocratique : ACN/H20 50/50 b) Isocratique : ACN/H20 70/30 c) Gradient : 30 à 85 % d’ACN en 7 minutes
Différents profils de gradient
Elution à gradient : effet du profil de gradient
Choix d’une colonne HPLC organic soluble MW < 2000 aqueous q soluble Sample
organic soluble MW 2000 MW > 2000 aqueous soluble l bl
hexane soluble organic soluble
methanol methanol/H2O acetonitrile acetonitrile/H / 2O soluble THF soluble
MW < 2000
non‐ionic aqueous soluble ionic
hexane soluble
normal phase adsorption normal phase p bonded
organic soluble
MW < 2000
methanol methanol/H2O acetonitrile acetonitrile/H2O soluble
reversed phase
reversed phase bonded
THF soluble gel permeation GPC
non‐ionic
reversed phase bonded
MW < 2000 aqueous soluble
reversed phase b d d bonded using ionization control
ionic
reversed phase bonded using i ion‐pairing i ii ion exchange
organic soluble
gel‐permeation
MW > 2000 gel‐filtration l fl
aqueous soluble
ion‐exchange mode with wide pore material
reverse phase mode with wide pore material
Chromatographie par paires d’ions g p p p Objectif : améliorer la séparation de composés ioniques ou très polaires qui ont trop peu d’affinité trop peu d affinité pour une PS apolaire pour une PS apolaire ÎNécessité d’augmenter la rétention Î diminution de leur caractère ionique Solutions : ¾Modifier le pH ¾Ajouter à la PM un composé porteur à la fois d’une chaîne carbonée et d’un groupement de charge opposée à celle du composé à séparer ÎCréation d’une paire d’ions globalement neutre, stable et lipophile qui sera retenue sur la PS retenue sur la PS Soluté ionisé Paire d’ions (acides)
A‐ + R+ ↔ A‐R+ +
‐
+ ‐
(bases) BH + R ↔ BH R Soluté hydrophile Moins retenu en RP
(R (R = agent pairant) t i t)
Paire d’ions hydrophobe Mieux retenue en RP
Base de la rétention : Base de la rétention : Soit un soluté acide ionisé A‐ pairé par R+. La paire d’ions formée en solution est retenue par la colonne, l’équilibre de p p , q rétention du soluté est décrit par : A‐R+ (phase mobile) ↔ A‐R+ (phase stationnaire) La rétention dépend de : 1) la fraction des molécules de soluté A dans la PM (déterminée par le pH de la PM et le pKa du soluté) la PM et le pKa du soluté) 2) la concentration de l’agent pairant et sa tendance à former une paire d’ions 3) la valeur de k (facteur de rétention ou de capacité) de la paire d’ions A‐R+
Agents pairant typiques : •
Alkylsulfonates (R‐SO3‐), acides carboxyliques (TFA,…), BF4‐, ClO4‐, …)
•
Sels de tetraalkylammonium (R4N+)
X : principe actif, base forte X1, X2, X3 : produits de dégradation de X, bases fortes MP, PP : methyl et propylparaben MP, PP : methyl et propylparaben B et HP : acide benzoïque et acide hydroxybenzoïque, produits de dégradation de MP et PP Conditions chromatographiques : a) 30% MeOH/70% acétate, pH = 3.5 ) 30% M OH/70% ét t H 3 5 b) 45% MeOH/55% acétate + 65 mM octane sulfonate
Chromatographie chirale (énantiosélective) g p ( ) Pourquoi? Propriétés pharmacologiques des stéréoisomères parfois très différentes. éé h l d éé è f è d ffé Exemple: stéréosélectivité dans l’action des médicaments.
Principe : Î deux énantiomères R et S conduisent à deux pics dont les aires sont deux énantiomères R et S conduisent à deux pics dont les aires sont proportionnelles à l’abondance de chacune des deux formes. Formation de complexes diastéréomères réversibles entre les 2 énantiomères et un agent complexant chiral (sélecteur chiral, CS) (R)‐X + (R)‐CS ↔ (R)‐X…(R)‐CS Deux méthodes : éh d •PS chirale •PM + additif chiral PM dditif hi l
et
(S)‐X + (S)‐CS ↔ (S)‐X…(S)‐CS
Phase mobile avec sélecteur chiral PS classique en phase inverse ou en phase normale PM contenant un additif chiral en concentration appropriée ÎÉtablissement d’équilibres multiples : Formation de complexes entre sélecteur (R)‐CS et énantiomères (R)‐X et ( ) (S)‐X dans la PM (cst d’association) ( ) Distribution des énantiomères (R)‐X et (S)‐X entre PM et PS (cst de distribution)) Distribution des complexes X…CS entre PM et PS (cst de distribution)
Phase stationnaire chirale Moyen le plus simple et le plus pratique pour les séparations d’énantiomères. Le sélecteur chiral est lié de préférence par liaison covalente (alternativement par forte adsorption physique) au support de la PS, habituellement des particules de silice poreuse. La PM est achirale. La PM est achirale. Pendant la migration de l’échantillon dans la colonne, les énantiomères sont retenus par association avec le sélecteur de la PS. Des complexes di té é i diastéréosisomères se forment dans la PS. Si leur valeur de k est suffisamment è f td l PS Si l l d k t ffi t différente, leur séparation est possible. ÎNécessité d’une PS chirale qui interagisse plus fortement avec un des deux énantiomère.
Mécanismes de la reconnaissance chirale Modèle à « 3 points » : nécessité d’avoir au moins 3 points d’interaction pour qu’un sélecteur chiral puisse distinguer 2 énantiomères (règle de Dagliesh) •Complémentarité de taille et de forme entre analyte et sélecteur chiral •Interactions intermoléculaires non‐covalentes (principalement électrostatiques) : ¾ Interactions ioniques ¾ Ponts hydrogène ¾ Ion‐dipôle, dipôle‐dipôle, … I di ôl di ôl di ôl ¾ Interactions π‐π ¾ … •Si le sélecteur et l’analyte possèdent des régions hydrophobes correspondantes, liaison par interactions hydrophobes
Exemples de phases stationnaires chirales • Sélecteurs macromoléculaires d’origine semi‐synthétique (polysaccharides) • Sélecteurs macromoléculaires d’origine synthétique (poly(met)acrylamide) • Sélecteurs macromoléculaires d’origine naturelle (protéines) • Sélecteurs oligomériques macrocycliques ou de taille intermédiaire ( (cyclodextrines) ) • Entités ioniques synthétiques de faible poids moléculaire pour échange q ionique • Sélecteurs chélatants pour échange de ligand chiral
Les cyclodextrines Les cyclodextrines = enchaînements cycliques de 5 à 7 molécules de glucose greffées par l’intermédiaire d’un « bras » de quelques atomes de carbone sur la PS. De forme cylindrique, elles présentent une cavité hydrophobe tandis que la paroi externe est hydrophile. Î Inclusion sélective de composés qui forment à la surface de la phase chirale des complexes diastéréoisomères réversibles
α‐cyclodextrine
Fast HPLC Tendance : séparations très rapides, de moins d’une minute pour les échantillons simples à quelques minutes pour des mélanges plus complexes. simples à quelques minutes pour des mélanges plus complexes. Une fois optimisées les valeurs de k et de α (optimisation de la capacité et de la sélectivité), la résolution et le temps d’analyse ne dépendent plus que de N. Les conditions qui favorisent les séparations rapides incluent l’utilisation de petites particules, de colonnes plus courtes et de débits plus importants. La diminution du temps d La diminution du temps d ’analyse analyse (sans perte d (sans perte d’efficacité efficacité N) peut être effectuée par N) peut être effectuée par l’utilisation de •Ultra‐haute pression = UPLC ou UHPLC (> 6000 psi ou 400 bar) •Température plus élevée = HT‐HPLC •Particules spéciales
UPLC ‐ UHPLC E l ti d t ill d Evolution des tailles de particules ti l
10 min Late 1960’s 40μm pellicular non‐porous coated 100 500 psi (7 40 bar) 100‐500 psi (7‐40 bar) 10 i 10 min 5,000 plates/meter Early 1970’s 10μm Irregular micro‐porous 1000‐2500 1000 2500 psi (70 psi (70‐180 180 bar) bar) 40,000 plates/meter 10 min 1980’s to present day 3.5 ‐ 5μm spherical micro‐porous 1500‐4000 psi (110‐280 bar) 80,000 ‐ 115,000 plates/meter
Exemples de PS utilisées en UHPLC C18 — Trifunctionally Bonded C18 — Proprietary Endcapping P i t E d i — Widest pH range C8 — Trifunctionally Bonded C8 — Proprietary Endcapping — Widest pH range Widest pH range Shield RP18 Monofunctionally bonded — Monofunctionally bonded — Embedded polar group Phenyl y — Trifunctionally Bonded C6 Phenyl — Proprietary Endcapping
Le challenge de la courbe de Van Deemter g
H
=
A+
B + (CS + C M )u u
Particule = élément central de la séparation Plus petites particules Î meilleures séparations sur de plus grandes plages de vélocités Î augmentation de la vitesse et de la résolution de la séparation la résolution de la séparation
Exemples
Source Thermo Fisher
Séparation en gradient UHPLC d’une digestion à la trypsine d’albumine de serum bovin. Capacité de pics : 500 entre 48 et 168 min Capacité de pics : 500 entre 48 et 168 min
HT ‐ HPLC Augmentation de la température : • Diminution Diminution de la viscosité de la PM Î de la viscosité de la PM Î débit plus élevé à pression égale, débit plus élevé à pression égale équivalent à une augmentation de la pression (cf UHPLC) • Augmentation du coefficient de diffusion du soluté • Î même efficacité à un débit plus élevé et un temps d’analyse plus court • Î efficacité améliorée à temps d’analyse égal
Inconvénients • Dégradation des échantillons à haute t Dégradation des échantillons à haute t° • Possibilité de gradients de t° dans la colonne Î manque d’uniformité de la t° • Instabilité des colonnes • Diminution de la sélectivité Î meilleure Ϋ ill » température = compromis entre N t é t i t Nmax et α t max!
H A Augmentation de la température : t ti d l t é t
=
A+
B + (CS + C M )u u
C Ì quand T Ê
5 Détecteurs 5. Détecteurs L’analyse par chromatographie a principalement pour but de repérer la présence ou de doser un composé présent pour lequel on a choisi un détecteur bien adapté. Q alités d détecte r Qualités du détecteur : •Sensibilité •Bruit négligeable •Large gamme dynamique •Large gamme dynamique •Réponse indépendante des variations des paramètres d’utilisation (pression, température, débit, composition de la phase mobile) •Faible volume mort •Faible volume mort •Non‐destructif •Stable au cours du temps •Sélectivité Sélectivité •Grande vitesse de réponse
Modes de détection les plus courants basés sur les propriétés optiques des composés : absorption, fluorescence, indice de réfraction
Limites de détection et de quantification q LOD = plus petite concentration d’un analyte détectable (pas nécessairement quantifiable) LOQ = plus petite concentration d’un analyte quantifiable avec une précision et une justesse acceptables
Rapport signal sur bruit (S/N)
LOD Î S/N = 3 LOQÎ S/N = 10
Detector
Relative sensitivity
Useful with gradient
T° sensitivity
Yes
IR
Analytes
Presence of Specific IR bands
Refractive Index
+
No
High
Universal
Conductivity
++
No
Moderate
Charged compounds
UV‐Vis
+++
Yes
Presence of chromophores p
ELSD
+++
Yes
Universal
Electrochemical
+++
No
Fluorescence
++++
Yes
Fluorophore
MS
++++
Y Yes
Universal with U i l ith selective detection possible
Moderate
Electro‐active compounds Electro‐active compounds
Détecteur à indice de réfraction Un faisceau lumineux (mono‐ ou polychromatique) passe à travers une cellule à deux compartiments dont l’un est rempli avec la PM seule et l’autre avec la PM sortant de la colonne. La différence d’indice de réfraction entre les deux liquides q qui apparaît lorsqu’un analyte est mélangé à la PM provoque un déplacement angulaire du rayon diffracté.
Le RI est utile dans le cas de composés qui ne possèdent pas de chromophores (UV) fluorophores (F) de potentiel redox (électrochimique) ou d’activité (UV), fluorophores (F), de potentiel redox (électrochimique), ou d activité ionique ionique (conductimètre) Généralement utilisé en conjonction avec une autre technique de détection Applications : Sucres, Alcools, Lipides, Polymères,…
Avantages •Réponse « universelle » ¾Détecte tout ce qui se trouve en solution. ¾Sauf si l’analyte a exactement le même RI que la phase mobile •Utilisation facile •Peu de paramètres •Très robuste •Peu sensible à l’encrassement et aux “bulles” Désavantages •Faible sensibilité •Absence de sélectivité •Sensible aux changements de débit, température et viscosité S ibl h t d débit t é t t i ité •Pas d’utilisation de gradients
Détecteur spectrophotométrique UV‐Visible : Mesure la perte d’intensité de lumière UV ou Vis. lors du passage dans une solution Détection basée sur la loi de Lambert‐Beer (A = εlC) : l’absorbance A de la phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde λ ou plusieurs longueurs d’onde plusieurs longueurs d onde dans l dans l’UV UV ou le visible. ou le visible
La PM ne doit pas ou très peu absorber par elle‐même La PM ne doit pas, ou très peu, absorber par elle même. La sensibilité optimale est obtenue en utilisant le détecteur à la longueur d’onde où l’absorbance du composé d’intérêt est la plus grande (λmax) Le détecteur UV/Vis est le plus répandu en HPLC Bien qu Bien qu’ayant ayant des limitations (particulièrement pour les composés qui ne des limitations (particulièrement pour les composés qui ne possèdent pas de chromophore UV), il possède la meilleure combinaison de : •Sensibilité •Linéarité •Gamme dynamique •Robustesse R b t •Facilité d’utilisation Si pas de spectre d Si pas de spectre d’absorption absorption exploitable Î exploitable Î nécessité de dérivatiser les nécessité de dérivatiser les composés.
Avantages • Très robuste • Facilité d’utilisation • Compatible avec les gradients • Non‐destructif • Haute sensibilité Haute sensibilité • ~70% des publications HPLC utilisent un UV/Vis.
Désavantages • Pas universel • Pas aussi sélectif que d’autres techniques (Fluo, MS, ECD) • Détection affectée par la composition de la phase mobile
Détecteur à barrette de diodes (PDA ou DAD)
Soit : Soit : ‐Changement de longueur d’onde en cours d’analyse ‐Enregistrement de l ‐Enregistrement de l’absorbance absorbance à plusieurs longueurs d à plusieurs longueurs d’onde onde simultanément ‐Enregistrement de l’absorbance sur tout un domaine de longueurs g g d’onde
Absorbance en 3D Enregistre l’absorbance sur tout le spectre UV‐Vis Permet la création de bibliothèques spectrales
Le PDA acquiert un spectre par unité de temps en fonction de la vitesse d’acquisition du détecteur Le spectre acquis au sommet du pic est considéré comme référence L’algorithme de pureté de pic analyse tous les spectres d’un pic par rapport au spectre de référence p
Avantages • Détection “universelle” UV‐Vis • Bonne Sélectivité • Gamme dynamique • Spectres UV‐Vis des pics ¾ Confirmation ¾ Bibliothèques • Estimation de la pureté d’un pic
Désavantages • Moins sensible que l’UV classique M i ibl l’UV l i • Complexe • Plus de bruit qu’un détecteur UV classique • Composés de même famille possèdent le même spectre
Caractéristiques de quelques chromophores :
Source Thermo Fisher
Source Thermo Fisher
Détecteur spectrofluorimétrique Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou une partie du rayonnement de la source lumineuse auquel ils sont soumis. L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’analyte.
Lampe au deuterium ou au xenon λ d’excitation sélectionnée par un filtre ou un monochromateur Isolement de la λ d Isolement de la λ d’émission émission par un second filtre ou monochromateur par un second filtre ou monochromateur λ d’émission dirigée vers le photodétecteur
La détection par fluorescence a lieu quand une molécule absorbe de la La détection par fluorescence a lieu quand une molécule absorbe de la lumière, atteignant ainsi un niveau d’énergie plus élevé (excitation). Quand la molécule retourne à son état énergétique initial, l Quand la molécule retourne à son état énergétique initial, l’énergie énergie perdue est émise sous forme de lumière (émission) – La molécule fluoresce. Le FL enregistre à la fois les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, ce qui donne lieu à de très grandes sélectivité et sensibilité . C l Ces longueurs d’onde sont spécifiques à chaque composé fluorescent. d’ d t é ifi à h é fl t
Avantages • Sensibilité ¾ 10 à 1000x plus sensible qu 10 à 1000x plus sensible qu’un un UV UV ¾ Recherche de « traces » • Sélectivité • Faible bruit de fond • Technique simple et nondestructive Désavantages • Peu de composés fluorescents • Besoin de dérivatiser les analytes • Reproductibilité inter‐labo • Réponse dépend de T°, pH, viscosité, polarité solvant • Les λEx et λEm peuvent varier • Nécessite plusieurs scans pour trouver les valeurs optimales Né i l i l l i l
Détecteur électrochimique (ampérométrique) Les composés pouvant être réduits ou oxydés en présence d’un potentiel électrique peuvent être détectés à de très faibles concentrations par des mesures électrochimiques sélectives. q Potentiel constant Î variation du courant La PM doit être électriquement conductrice La PM doit être électriquement conductrice
Détecteur conductimétrique q Mesure le changement de conductivité électrique due à la présence d'un soluté dans la phase mobile (de façon absolue ou différentielle). Avantage: détecteur utilisé pour solutés ioniques. Inconvénient: sensibilité très grande à la température.
Détecteur ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) ( p g g ) Evaporation de la PM suivie de la mesure de la lumière diffusée par les particules d’analyte non volatile. Utile pour tous les solutés ayant une volatilité plus faible que la PM. L’intensité de la lumière diffusée dépend de la taille des particules d’analyte.
3 étapes : • Nébulisation : effluent transformé en aérosol éb l ffl f é é l • Évaporation : la partie volatile de l’effluent est éliminée (solvants), les composés non volatiles restent sous forme de particules solides composés non‐volatiles restent sous forme de particules solides • Détection : les particules interceptent un rayon de lumière, l’intensité de lumière diffractée est proportionnelle à la quantité de particules p p q p détectées
Source : Grace
Avantages • Détecte les composés qui n’absorbent pas en UV‐Vis. • Peut être utilisé avec des solvants qui absorbent beaucoup en UV. Pe t être tilisé a ec des sol ants q i absorbent bea co p en UV • Utilisation de gradients (avantage sur RI). • Possibilité de varier la T° de nébulisation pour optimiser la détection. • Applications : Sucres, Polymères, Triglycérides Désavantages • Pas de tampons/additifs non‐volatils • Technique destructive. q • Besoin de gaz de nébulisation (habituellement N2). • TOUS les ELSD sont non‐linéaires. • Moins sensible que d Moins sensible que d’autres autres détecteurs (UV par exemple). détecteurs (UV par exemple)
Détecteur de masse Optimisation des détecteurs de masse pour travailler avec l’UPLC Vitesses d’acquisition Vitesses d acquisition de 10000 da/s de 10000 da/s Vitesses de changement de mode d’ionisation minimisés • ESI ESI + • ESI – • APCI + • APCI ‐ Dwell times minimisés Simple et triple quadrupôle Temps de vol (TOF, QTOF)
Pi i Principaux détecteurs utilisés dét t tili é
6 Applications en pharmacie 6. Applications en pharmacie D Drug discovery di Préformulation Pharmacocinétique et métabolisme Développement process Développement formulation …
