Cromatografia líquida de alta eficiência
O que é cromatografia líquida?
A
cromatografia
fundamenta-se
na
migração
diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma
fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).
Principio da cromatografia líquida AMOSTRA
Coluna contendo fase estacionária.
SOLVENTE
Ação da gravidade!
Tempo
Tipos de cromatografia líquida: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PLANAR
CCD
COLUNA
HPLC
CP
ADOSRÇÃO
PARTIÇÃO
IÔNICA
CONVENCIONAL
EXCLUSÃO
Primeiro, o que é HPLC? •HPLC – É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure) Liquid Cromatography. •Historia da HPLC:
- Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC! - Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da instrumentação, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Década de 80: A partir dessa década houve um “boom” do HPLC - 2006- Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...
Vantagens da HPLC
FE é utilizada inúmeras vezes.
Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM.
Tempo reduzido de análise.
Alta resolução.
Análise qualitativa: tR , espectro de absorção no UV (DAD), MS.
Análise quantitativa: desvios menores do que 5%.
Boa detectabilidade: Absorção de UV-Vis de comprimento de onda variável 10-10 g; Fluorescência: 10-12 g;
Automatização
Limitações da HPLC
Alto custo do instrumento
Alto custo de manutenção
Alto custo de operação
Falta de detector universal sensível Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estável. Espectrômetro de massas: ~US$ 150.000,00
Necessidade de experiência no seu manuseio
Como é um HPLC comercial? Reservatórios dos solventes e sistema de degaseificação.
Bomba. Injetor. Coluna.
Detector.
Instrumentação para HPLC
Instrumentação para HPLC
Reservatório para a fase móvel • Filtro do reservatório : Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba. •
Filtros de 10 a 40 um
Limpeza periódica!!
Características da fase móvel
Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação
Dissolver a amostra sem decompor seus componentes
Não decompor ou dissolver a fase estacionária
Ter baixa viscosidade
Compatível com o tipo de detector
Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.
Degaseificação da FM: Garanti a reprodutibilidade da vazão Estabilidade da linha base.
Métodos de degaseificação •
Ultrassom:
•
Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.
•
Purga com Hélio:
Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o pior método quando usado sozinho
Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a
.
aumento de vazamentos, maior custo operacional
•
Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo)
Instrumentação para HPLC
Sistema de bombeamento “Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o sistema cromatográfico”
REQUISITOS:
Ser de material inerte
Pressões de até 6000 psi (~400 atm)
Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas)
Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %
Sistema de bombeamento Tipos de bombas: Pneumática Deslocamento
Recíproca
Bomba pneumática
Vantagens: Baixo custo Livre de pulsações
Desvantagens: Baixa pressão (até 2000 psi) Baixo volume Não permite gradiente Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel
Bomba de deslocamento Vantagens: Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel Livre de pulsações Desvantagens: Baixo volume
Não permite gradiente
Bomba recíproca
Vantagens: Pressão elevada (até 10 000 psi) Pequeno volume interno (35 a 400 µL) Permite gradiente
Desvantagem: Fluxo pulsado
Alto custo
Sistema de bombeamento Isocrático :
+ A composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise. + Capaz de separa um número limitado de analitos. Gradiente + A composição da fase móvel varia durante a análise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes na amostra , é muito diferente. + Separação de amostras complexas.
Separação isocrática e por gradiente
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Instrumentação para HPLC
Sistema de Injeção
INJEÇÃO MANUAL - As amostras são introduzidas com seringas. - Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início da coluna.
AMOSTRADOR AUTOMÁTICO - As amostras são postas em um frasco localizado dentro do amostrador. - O amostrador automático : 1- Mede o volume correto para injeção. 2- Injeta a amostra. 3 – Prepara o injetor para uma próxima amostra
Sistema de Injeção LOAD
Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo
Bomba
Coluna
Bomba
Coluna
Sobrecarga de Volume da amostra Para aproveitar de todos os pratos que uma colina possui, não se deve injetar um volume maior que 1% do volume da coluna vazia. 𝑉𝑚𝑎𝑥 (µL)=π(raio)2(comprimento)(0,01)
Instrumentação para HPLC
Coluna
Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão) + Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para biomoleculas) + PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com a maioria dos solventes) + Preço: > US$ 200.00 Tipos de colunas + Analíticas : diâmetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250 mm. + Preparativas: i.d ˃ 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm. A escolha de uma coluna apropriada é o ponto crítico para o sucesso da análise.
Pré-coluna
Localizada entre o injetor e a coluna
Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna. Mesma FE da coluna de separação.
Protege a coluna Custo reduzido
Pré-coluna!
Coluna
Fase estacionária. + As colunas são “recheadas” com partículas porosas com diâmetro de 1,8 – 5 μm.
+ Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da amostra para separá-los um do outro.
Condicionamento da Coluna Necessário para que haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE.
Coluna nova: 4- 8 horas Coluna parada há alguns dias: 2 horas Coluna de uso diário: 15 minutos. Lembre-se: a coluna deve ser guardada em solvente orgânico.
LC com fase quimicamente ligada
Síntese da FE.
Modos de HPLC HPLC
Adsorção
Partição
Iônica
Exclusão
Tipos de cromatografia líquida:
Adsorção: O mecanismo de separação: competição entre moléculas da amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária, sólido. (Sílica) Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.
Partição: (CLL ou CFL) CLL: O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária.(sílica purificada) O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel. CFL: A fase estacionária está imobilizada por meio de ligações químicas. (Normal ou Reversa)
Fase normal x Fase reversa
Fase normal: fase estacionária polar; fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila); solutos neutros; polaridade soluto t. retenção; mecanismo retenção: adsorção
Fase reversa: fase estacionária apolar; fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF); solutos apolares, não-iônicos; polaridade f. móvel t. retenção; mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.
Fase Normal Si-OH + R3SiCl
Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
•• OH Si
Ciano (-C2H4CN) R=
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (–C3H6NH2)
Polaridade da fase móvel
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL Polaridade do soluto: a > b > c c
c
b
b
a
a
tempo
•Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal
tempo •Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição
Fase reversa
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Polaridade da fase móvel
Polaridade do soluto: a > b > c
a
b
c
•Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18), e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc)
tempo
a
b
c tempo
•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição
Efeito do comprimento da cadeia na retenção.
Tipos de cromatografia líquida: Iônica: A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo, -SO-3 trocadores fortes de cátion -CO-2 trocadores fracos de cátion -NR+3 trocadores fortes de ânions -NH2R+ trocadores fracos de ânions Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.
Exclusão: A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas. A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado. Onde, as moléculas menores penetram a maioria dos poros.
Instrumentação para HPLC
Características de um detector Sensibilidade e seletividade adequada Ampla faixa linear Baixo volume interno Resposta Rápida Boa estabilidade e reprodutibilidade
Não destruir a amostra
Características de um detector
Baixo volume interno O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde. Grande volume alargamento dos picos registrados.
Resposta Rápida O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector). Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
Características de um detector
Boa estabilidade e reprodutibilidade Alta confiabilidade e facilidade de uso
Não destruir a amostra para: Permite coletar o eluato Utilizar um segundo tipo de detector
Detector por espectrofotometria UVvisível Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor mede a luz que passa através da célula.
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor. Essa alteração da quantidade de energia é amplificada sistema de registro de dados.
e dirigida para um
Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação de alguns compostos.
Detector por espectrofotometria UVvisível
Detector por espectrofotometria UV-visível
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
Detector por espectrofotometria UVvisível Princípio de operação
Absorvância de luz na faixa UV-visível
tipo
Seletivo, depende de propriedades do composto
Min. quanti. detectável (g/mL)
10-9
Sensib. a temperatura
Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos que absorvem no selecionado
Detector por fluorescência Em comparação com detectores de UV-Vis, os detectores de
fluorescência oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes complexas em níveis extremamente baixos.
Os detectores de fluorescência detectam apenas substâncias que apresentam fluorescência.
Detector por fluorescência
Detector por fluorescência Princípio de operação tipo Min. quanti. detetável (g/mL) Sensib. a temperatura
Excitação com luz produz emissão fluorescente Altamente seletivo 10-9 (excitação a laser: 10-12) Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por índice de refração A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma maneira de detectá-lo. O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar a luz em uma fase líquida. A quantidade de deflexão é proporcional à concentração. O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e sofre com a variação da temperatura.
Detector por índice de refração
Detector por índice de refração Princípio de operação tipo
Mudança no índice de refração da fase móvel Universal, depende de propriedade da f. móvel
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-7
Sensib. a temperatura
alta
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Geral
Detector eletroquímico Princípio de operação
Oxidação ou redução em potencial fixo
tipo
Seletivo, depende de propriedades do composto
Min. quanti. detetável (g/mL) Sensib. a temperatura
10-12 Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Espécies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade elétrica
Detector por condutividade elétrica Princípio de operação tipo Min. quanti. detetável (g/mL) Sensib. a temperatura
Condutividade elétrica devida a presença de íons Seletivo, depende de propriedades do composto 10-8 Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Soluções aquosas com compostos iônicos
E aqui termina a aula, !!!!!
Referências bibliográficas
http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html
SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002.
COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles and practice. 1997.
POLARIDADE DO SOLUTO
ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO
insolúvel em água não-polar
•espécies MM>104: cromatografia por exclusão •espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica
•espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos)
iônico
polar não-iônico
102
103 massa molecular
•espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga)
solúvel em água
104 105 106
ADSORÇÃO
PARTIÇÃO fase reversa
fase normal
TROCA IÔNICA
permeação em gel EXCLUSÃO filtração em gel aplicações
Figura 28-1 Skoog p642 vp
HPLC x GC Comparação entre as características de GC e HPLC Fator
GC
HPLC
Requisito p/ amostra
volátil e termicamente estável
solúvel na fase móvel
Tipos de amostra
gases, líquido e sólidos
líquidos e sólidos
Quantidade mínima detectável
10-12 g (ECD)
10-9 g (UV)
Tempo de análise
minutos até poucas horas
minutos até muitas horas
Pratos teóricos por coluna
2.000-300.000
500-25.000
Capacidade analítica
até 200 componentes
até 50 componentes
Tempo de treinamento do operador
cerca de 3 meses
pelo menos 6 meses
(a)
(c)
(b)
(d)
