“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid Chromatography)”
MAKALAH Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Kimia Analisis Instrument Dosen Pengampu : Ib Ibu Sri Ha Haryani Ibu Sri Wardani
Disusun oleh: Kelompok 4 (empat) Fajar Mahda A.S (4301408024) Diah Ika Rusmawati (4301408054) Santi Budiarti (4301408069)
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2010
BAB I PENDAHULUAN
A. LATA LATAR R BEL BELAK AKAN ANG G a. Sejarah Krom Kromat atog ogra rafi fi adal adalah ah isti istila lah h umum umum untu untuk k berb berbag agai ai cara cara pemis pemisaha ahan n berdas berdasark arkan an partis partisii cuplik cuplikan an antara antara fasa yang yang berger bergerak, ak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat zat pada padat. t. Kita Kita bias biasan anya ya meng mengan angg ggap ap Tswe Tswett tt seba sebaga gaii pene penemu mu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemak pemakaia aian n kolom kolom kapur kapur untuk untuk memisa memisahka hkan n pigmen pigmen dalam dalam daun. daun. Istila Istilah h ‘kroma ‘kromatog tografi rafi’’ dipaka dipakaii oleh oleh Tswett Tswett untuk untuk mengga menggamba mbarka rkan n daer daerah ah berw berwarn arnaa yang yang berg berger erak ak ke bagi bagian an bawa bawah h kolo kolom. m. Perl Perlu u diketahui bahwa D.T> Day pada kira-kira saat yang sama memakai kromatografi untuk memisahkan berbagai fraksi minyak bumi tetapi Tswett Tswett-lah -lah yang yang pertam pertamaa kali kali mengen mengenali ali dan menafsi menafsirka rkan n proses proses tersebut. Kromatografi merana selama bertahun-tahun, biasanya dipakai dalam bentuk kromatografi cair-padat (KCP). Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai berkembang. Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov dan Schraiber Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus diperhalus oleh Stahl pada tahu tahun n 1958 1958.. Kary Karyaa Mart Martin in dan dan Syng Synge, e, yang yang pada pada tahu tahun n 1041 1041 membuahkan membuahkan hadian Nobel, Nobel, tidak hanya merevolusi merevolusikan kan kromatograf kromatografii cair, tetapi juga secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952, Martin dan dan Jame Jamess memp mempub ubli lika kasi sika kan n maka makala lah h pert pertam aman anya ya meng mengen enai ai krom kromat atog ogra rafi fi gas. gas. Anta Antara ra tahu tahun n 1952 1952 dan dan akhi akhirr tahu tahun n 1960 1960an an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
M A ZAT I D PADAT E S A ZAT CAIR F
FASE GERAK ZAT CAIR
GAS
Kromat Kromatogr ografi afi cair-pa cair-padat dat (KCKT (KCKT))
Kromat Kromatogr ografi afi gas-pa gas-padat dat (KGP) (KGP)
Krom Kromat atog ogra rafi fi cai cairr-ca cair ir (KC (KCC) C)
Krom Kromat atog ogra rafi fi gas gas-c -cai air( r(KG KGC) C)
KROMATOGRAFI
KROMATOGRAFI CAIR KROMATOGRAFI GAS GAS-CAIR
GAS-PADAT
PERTUKARAN ION
EKSKLUSI
KROMATOGRAFI
PENYERAPAN CAIR-
PARTISI
PADAT
KROMATOGRAFI
KROMATOGRAFI
KERTAS
LAPIS TIPIS
b. Pengerti rtian Kromat Kromatogr ografi afi merupa merupakan kan suatu suatu cara cara pemisa pemisahan han unsur unsur-un -unsur sur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasafasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya lainnya merupakan merupakan cairan yang merembes merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu suatu gas. gas. Maka Maka semua semua jenis jenis kromat kromatogr ografi afi yang yang dikena dikenal, l, terbag terbagii menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair. Pembah Pembahasan asan teknik teknik kromat kromatogr ografi afi modern modern baru baru lengka lengkap p bila bila disebu disebutt kromat kromatogr ografi afi cairan cairan kinerj kinerjaa tinggi tinggi (HPLC) (HPLC).. Kromat Kromatogr ografi afi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. gravitasi. Umumnya Umumnya metode metode itu dicirikan oleh efisiensi efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun tahun 1969, 1969, perhat perhatian ian dalam dalam teknik teknik kolom kolom cairan cairan hidup hidup kembal kembalii dengan dengan sangat sangat menyol menyolok ok karena karena dikemb dikembang angkan kannya nya sistem sistem tekana tekanan n tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdi berdiame ameter ter kecil kecil (1-3 (1-3 mm) dan eluen eluen dipomp dipompaka akan n ke dalamn dalamnya ya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik. Umumnya Umumnya metode metode kromatograf kromatografii seperti seperti adsorpsi, adsorpsi, partisi, dan penuk penukar ar ion adalah adalah contoh contoh-con -contoh toh dari dari kromat kromatogr ografi afi kolom. kolom. Pada Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan ber berma maca cam m diam diamet eter er.. Part Partik ikel el deng dengan an dime dimens nsii yang yang berv bervar aria iasi si digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumla jumlahny hnyaa sedemi sedemikia kian n rupa rupa sehing sehingga ga hanya hanya cukup cukup mengha menghasil silkan kan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam.
Secara Secara keselu keseluruh ruhan an pemisa pemisahan han ini memaka memakan n waktu waktu lama. lama. Berbag Berbagai ai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. Bila dibandingk dibandingkan an terhadap terhadap kromatograf kromatografii gas-cair/gas gas-cair/gas-liquid -liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian demikian juga zat yang secara termal tidak stabil stabil.. Tetapi Tetapi ditinj ditinjau au dari dari kecepa kecepatan tan dan kesede kesederha rhanaa naan, n, GC lebih lebih baik. baik. Kedua Kedua teknik teknik ini komple komplemen menter ter satu satu sama sama lainny lainnya, a, keduan keduanya ya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Akhir-akhir Akhir-akhir ini, untuk untuk pemurnian pemurnian (misalnya (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan ting tinggi gi untu ntuk meng mengir irim im fas fasa mobi mobill ked kedalam alam kolo kolom m. Den Dengan gan memb member erika ikan n tekan tekanan an ting tinggi gi,, laju laju dan dan efisi efisien ensi si pemi pemisa saha han n dapa dapatt ditingkatkan dengan besar. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.
B. TUJUAN Makalah ini disusun guna memenuhi tugas kelompok mata kuliah Kimia Analisis Instrumen yang diampu oleh Ibu Sri Haryani dan Ibu Sri Wardani. Adapun tujuan lain adalah sebagai berikut: 1. Menget Mengetahu ahuii prinsi prinsip p dasar dari Kromato Kromatogra grafi fi cair kinerj kinerjaa tinggi tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC). 2. Meng Menget etah ahui ui prose rosess Kro Kromato matog grafi rafi cair cair kin kinerja erja tin tinggi ggi atau atau hig high perfo performa rmance nce liquid liquid chroma chromatog tograp raphy hy (HPLC) (HPLC) secara secara kualit kualitatif atif dan kuantitatif. 3. Menget Mengetahu ahuii instru instrumen menisa isasi si dari dari Kromat Kromatogr ografi afi cair kinerja kinerja tinggi tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC). C. MANFAAT Dari makalah ini, diharapkan dapat : 1. Menamb Menambah ah penget pengetahu ahuan an bagi bagi penuli penuliss dan pembaca pembaca mengen mengenai ai metode metode analisis instrumen khususnya Kromatografi cair kinerja tinggi atau high perfo performa rmance nce liquid liquid chroma chromatog tograp raphy hy (HPLC) (HPLC) baik baik secara secara kualit kualitatif atif maupun secara kuantitatif. 2. Mem Memudah udahk kan mahas ahasis iswa wa dalam alam kegia egiata tan n anal analis isis is inst instru rume men n Krom Kromat atog ogra rafi fi cair cair kine kinerj rjaa ting tinggi gi atau atau high high perf perfor orma manc ncee liqu liquid id chromatography (HPLC).
BAB II KAJIAN PUSTAKA
A. PENG PENGER ERTI TIAN AN Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan dengan High Performance Performance Liquid Liquid Chromatogra Chromatography phy (HPLC) (HPLC) merupakan merupakan metode metode yang yang tidak tidak destru destrukti ktiff dan dapat dapat diguna digunakan kan baik baik untuk untuk analis analisis is kual kualit itati atiff dan dan kuan kuanti tita tati tif. f. KCKT KCKT pali paling ng seri sering ng digu diguna naka kan n untu untuk k : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam asam-- asam asam nukl nuklea eat, t, dan dan prot protei einn-pr prot otei ein n dala dalam m cair cairan an fisi fisiol olog ogis is;; menetu menetukan kan kadar kadar senyaw senyawa-s a-seny enyawa awa aktif aktif obat, obat, produk produk hasil hasil sampin samping g proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan fa rmasi. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah rendah), ), dan High High pressu pressure re (tekan (tekanan an tinggi tinggi 76 bar biasan biasanya ya memakai memakai satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pad padaa part partik ikel el kecil kecil,, caira cairan n dite diteka kan n terj terjad adii gese geseka kan n maka maka digu diguna naka kan n pen pendi ding ngin in dan dan teka tekana nan n tingg tinggii (cair (cairan an dite diteka kan n meng menggu guna naka kan n pomp pompaa kemudi kemudian an didoro didorong, ng, jika jika ditari ditarik k cairan cairan masuk) masuk).. Tekana Tekanan n harus harus 76 bar, bar, antara antara fase fase diam diam dan fase gerak gerak terjad terjadii geseka gesekan n sehing sehingga ga temper temperatu atur r meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap. Jenis HPLC Pemisahan Pemisahan dengan HPLC HPLC dapat dilakukan dilakukan dengan dengan fase normal (jika fase fase diamny diamnyaa lebih lebih polar polar diband dibanding ing dengan dengan fase fase gerakn geraknya) ya) atau atau fase fase terbal terbalik ik (jika (jika fase fase diamny diamnyaa kurang kurang non polar polar diband dibanding ing dengan dengan fase fase gerakn geraknya) ya).. Berdas Berdasark arkan an pada pada kedua kedua pemisa pemisahan han ini, ini, sering sering kali kali HPLC HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC f ase terbalik. Sela Selain in klas klasif ifik ikas asii di atas atas,, HPLC HPLC juga juga dapa dapatt dike dikelo lomp mpok okka kan n berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Krom Kromat atog ogra rafi fi Ads Adsor orbs bsii Prinsi Prinsip p kromat kromatogr ografi afi adsorp adsorpsi si telah telah diketah diketahui ui sebaga sebagaima imana na dalam kromatografi kromatografi kolom kolom dan kromatografi kromatografi lapis tipis. Pemisahan Pemisahan kromat kromatogr ografi afi adsorb adsorbsi si biasan biasanya ya menggu menggunak nakan an fase normal normal dengan dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
2.
3.
4.
5.
berbe berbeda, da, karena karenanya nya solut solut dapat dapat terika terikatt secara secara kuat kuat sehing sehingga ga dapat dapat menyebabkan puncak yang berekor. Krom Kromat atog ogra rafi fi fase fase teri terika katt Kebany Kebanyaka akan n fase fase diam diam kromat kromatogr ografi afi ini adalah adalah silika silika yang yang dimo dimodi difik fikas asii seca secara ra kimi kimiaw awii atau atau fase fase teri terika kat. t. Seja Sejauh uh ini ini yang yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase fase gerak gerak tida tidak k diatu diaturr maka maka solu solutt akan akan meng mengal alam amii ioni ionisa sasi si atau atau protonasi. protonasi. Terbentukn Terbentuknya ya spesies spesies yang terionisasi terionisasi ini menyebabka menyebabkan n ikatannya ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding dibanding jika solut solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. Krom Kromat atog ogra rafi fi penu penuka karr ion ion KCKT KCKT penu penuka karr ion ion meng menggu guna naka kan n fase fase diam diam yang yang dapa dapatt menuk menukar ar kation kation atau anion dengan dengan suatu fase gerak. Ada banyak banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaan penggunaannya nya adalah polistiren polistiren resin. Kebanyakan Kebanyakan pemisahan pemisahan kromatograf kromatografii ion dilakukan dengan menggunakan menggunakan media air karena sifat sifat ionisa ionisasin sinya. ya. Dalam Dalam bebera beberapa pa hal diguna digunakan kan pelaru pelarutt campur campuran an misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. Krom Kromat atog ogra rafi fi Pasa Pasang ngan an ion ion Krom Kromat atog ograf rafii pasa pasang ngan an ion ion juga juga dapa dapatt digu diguna naka kan n untu untuk k pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. Kromat Kromatogr ografi afi Eksklu Eksklusi si Ukuran Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel gel dan dan dapa dapatt digu diguna naka kan n untu untuk k memi memisa sahk hkan an atau atau meng mengan anali alisi siss seny senyaw awaa deng dengan an berat berat mole moleku kull > 2000 2000 dalt dalton on.. Fase Fase diam diam yang yang digu diguna naka kan n dapa dapatt beru berupa pa sili silika ka atau atau poli polime merr yang yang bers bersif ifat at poru poruss
sehing sehingga ga solut solut dapat dapat melewa melewati ti porus porus (lewat (lewat dianta diantara ra partik partikel) el),, atau atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh jauh lebih lebih besar, besar, akan akan terelus terelusii terleb terlebih ih dahulu dahulu,, kemudi kemudian an moleku molekullmolekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati melewati porus, porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Krom Kromat atog ogra rafi fi Afin Afinit itas as Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang yang terkait terkait dengan dengan muatan muatan dan sterik terten tertentu tu pada pada sampel sampel yang yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromat Kromatogr ografi afi jenis jenis ini dapat dapat diguna digunakan kan untuk untuk mengis mengisola olasi si protei protein n (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. Tekn Teknik ik HPLC HPLC lebi lebih h berm berman anfaa faatt diba diband ndin ingk gkan an deng dengan an GC (Gas (Gas Chromatography). Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain : 1. HPLC HPLC dapat diguna digunakan kan untuk untuk isolasi isolasi zat yang yang tidak mudah mudah menguap menguap dan zat yang tidak stabil. 2. HPLC memiliki memiliki detecto detectorr dengan dengan kepekaa kepekaan n yang yang tinggi tinggi 3. Teknik Teknik ini ini memilik memilikii daya memi memisah sah yang yang tingg tinggii 4. Dapat menganalisi menganalisiss sampel sampel yang kecil kuantitasn kuantitasnya ya 5. Dalam HPLC HPLC dapat dapat memberi memberikan kan beberapa beberapa ribu ribu lempeng lempeng teoritis teoritis hanya hanya dalam dalam beberap beberapaa cm sehing sehingga ga memung memungkin kinkan kan analis analisis is kolom kolom yang yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi) 6. Biaya pelarut pelarut jauh jauh lebih rendah rendah diband dibandingk ingkan an LC kuno, kuno, sehingg sehinggaa dapat menurunkan biaya karyawan. 7. Teknik Teknik HPLC HPLC dapat dapat dilak dilakuka ukan n pada suhu suhu kamar kamar.. B. PRIN PRINSI SIP P DAS DASAR AR Prinsip kerja HPLC : Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntik penyuntikan. an. Di dalam kolom kolom terjadi terjadi pemisahan pemisahan komponenkomponen-komp komponen onen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan akan keluar keluar dari dari kolom kolom lebih lebih dulu. dulu. Sebalik Sebaliknya nya,, solute solute-so -solut lut yang yang kuat kuat
berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolo kolom m lebi lebih h lama. lama. Seti Setiap ap komp kompon onen en campu campuran ran yang yang kelu keluar ar kolo kolom m dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
C. INST INSTRU RUME MEN N ALAT ALAT Instrument Instrumentasi asi HPLC HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
a. Fasa gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pel pelaru arut. t. Sela Selain in berfu berfung ngsi si seba sebaga gaii pemb pembaw awaa komp kompon onen en-k -kom ompo pone nen n campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fasa gerak HPLC: 1. Zat cair harus harus bertind bertindak ak sebagai sebagai pelarut pelarut yang yang baik untuk untuk cuplikan cuplikan yang akan dianalisis. 2. Zat cair harus harus murni sekali sekali untuk untuk menghin menghindar darkan kan masukn masuknya ya kotoran kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. 3. Zat air harus harus jernih jernih sekali untuk untuk menghin menghindar darkan kan penyum penyumbat batan an pada kolom. 4. Zat Zat cair cair haru haruss muda mudah h dipe dipero role leh, h, mura murah, h, tidak tidak muda mudah h terb terbak akar, ar, dan tidak beracun. 5. Zat air tidak tidak kental. kental. Umumny Umumnyaa kekentalan kekentalan tidak tidak melebihi melebihi 0,5 0,5 cP (centi (centi Poise). 6. Sesu Sesuai ai den denga gan n dete detect ctor or.. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak: a) HPLC HPLC fasa normal: normal: HPLC HPLC dengan dengan kombina kombinasi si antara antara fasa diam polar polar dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumin alumina, a, atau atau trietil trietilena enagli glikol kol yang yang dilapi dilapiska skan n pada pada partik partikel el silica. silica. Seda Sedang ngka kan n fasa fasa gera gerak k yang yang digu diguna naka kan n adal adalah ah heks heksan anaa atau atau i propileter. b) HPLC HPLC fasa terbalik: terbalik: HPLC HPLC dengan dengan kombinas kombinasii antara fasa diam diam nonnon polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. Fasa gerak yang yang baik memberikan memberikan factor factor kapasitas k’ pada rentang rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k’ antara 2-5. b. Pompa Pompa Pompa dalam dalam HPLC HPLC dapat dapat dianal dianalogk ogkan an dengan dengan jantun jantung g pada pada manusi manusiaa yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC: 1. Mengha Menghasil silkan kan tekana tekanan n sampai sampai 600psi 600psi (point/ (point/in in2) 2. Kelu Keluar aran an beba bebass puls pulsaa 3. Kecepa Kecepatan tan alir alir berkisa berkisarr antara antara 0,1-10 0,1-10 ml/me ml/menit nit 4. Baha Bahan n tah tahan an koro korosi si Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pomp Pompaa recip recipro roca cati ting ng Pompa Pompa ini terdir terdirii dari dari ruanga ruangan n kecil kecil tempat tempat pelaru pelarutt yang yang dipomp dipompaa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebalik sebaliknya nya ketika ketika piston piston maju maju maka maka bola bola bawah bawah menutu menutup p salura saluran n pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) b) Pomp Pompaa dis displ plac acem emen entt Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. c) Pomp Pompaa pneu pneuma mati ticc Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
c. Pema Pemasu suka kan n cup cupli lika kan n Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC: 1. Inje Injeks ksii syri syring ngee Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek. 2. Inje Injeks ksii ‘sto ‘stopp-fl flow ow’’ Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihent dihentika ikan n sement sementara, ara, sambun sambungan gan pada pada ujung ujung kolom kolom dibuka dibuka dan cupl cuplik ikan an disu disunt ntik ikan an lang langsu sung ng ke dala dalam m ujun ujung g kolo kolom. m. Sete Setela lah h menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 3. Kran Kran cupl cuplik ikan an Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: a) Sejumlah Sejumlah volume volume cuplikan cuplikan disunt disuntikkan ikkan ke ke dalam loop loop dalam dalam posisi posisi “load”, cuplikan masih berada dalam loop b) b) Kran Kran dipu diputa tarr untu untuk k meng mengub ubah ah posi posisi si “loa “load” d” menj menjad adii posi posisi si “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
d. Kolo Kolom m dan dan Fase Fase diam diam Ada 2 jenis jenis kolom kolom pada pada HPLC HPLC yaitu yaitu kolom kolom konven konvensio sional nal dan kolom kolom mikrobor. mikrobor. Kolom Kolom merupakan merupakan bagian HPLC yang mana terdapat terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: a) Kons Konsum umsi si fase gerak gerak kolo kolom m mikr mikrob obor or hany hanyaa 80% 80% atau atau lebi lebih h keci kecill dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). b) Adanya Adanya aliran fase fase gerak yang yang lebih lebih lambat lambat membuat membuat kolom mikrob mikrobor or lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. c) Sensit Sensitivi ivitas tas kolom mikrobo mikroborr diting ditingkat katkan kan karena karena solut solut lebih pekat, pekat, karena karenanya nya jenis jenis kolom kolom ini sangat sangat berman bermanfaat faat jika jika jumlah jumlah sampel sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagenreagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi silanisasi) : CH 3
CH 3 Si
OH +
Cl
Si
C H3
R
Si
O
Si
R
+HCl
C H3
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebi lebih h pend pendek ek lagi lagi lebi lebih h sesu sesuai ai untu untuk k solu solutt yang yang polar polar.. Sili Silika ka-s -sil ilik ikaa aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. e. Detektor HP HPLC Detektor Detektor pada HPLC dikelompo dikelompokkan kkan menjadi menjadi 2 golongan golongan yaitu: yaitu: detekt detektor or univer universal sal (yang (yang mampu mampu mendet mendeteks eksii zat secara secara umum, umum, tidak tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri spektrometri massa; massa; dan golongan detektor detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, Idealnya, suatu detektor harus mempunyai mempunyai karakteristi karakteristik k sebagai sebagai berikut: a. mempunyai mempunyai respon respon terhadap terhadap solut solut yang yang cepat cepat dan dan reprodus reprodusibel; ibel; b. mempu mempunya nyaii sensit sensitifit ifitas as yang tinggi, tinggi, yakni mampu mampu mendet mendeteks eksii solut solut pada kadar yang sangat kecil; c. stab stabil il dalam dalam pengo pengope pers rsia iann nnya ya;; d. memp mempun unya yaii sel sel volu volume me yang yang keci kecill sehi sehing ngga ga mamp mampu u memi memini nima malk lkan an pelebaran pita; e. signal signal yang dihasi dihasilkan lkan berband berbanding ing lurus lurus dengan dengan konsen konsentrasi trasi solut solut pada pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); f. tidak peka terhadap terhadap perubah perubahan an suhu suhu dan kecepatan kecepatan alir alir fase fase gerak. gerak. Karakteristik detector HPLC: Dasar Jenis Pendeteksian Absorbsi UV Spesifik Absorbsi IR Spesifik Flourometri Sp Spesifik Indek bias Umum Konduktometri Sp Spesifik Spektometri Umum massa elektrokimia Spesifik
Maksimum sensitifitas 2 x 10 -16 10 -6 10-11 1 x 10 -7 10-8 10-10
Peka Peka terha terhada dap p kecepatan alir Tidak Tidak Tidak Tidak Ya Tidak
Sensitivitas suhu Rendah Rendah Rendah + 10-4 0 C 2% 0C Tidak ada
10-12
Ya
1,5% 0C
D. ANALISA ANALISA KUALIT KUALITATIF ATIF dan KUANTITATI KUANTITATIF F Apli Aplika kasi si anal analis isis is HPLC HPLC adala adalah h untu untuk k pene penent ntua uan n kuali kualita tatif tif dan dan penentuan kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: 1. Paramet Parameter er percoba percobaan an sama sama antara antara standar standar dan dan sampel sampel
2. Penentuan Penentuan berdasar berdasarkan kan waktu waktu retensi retensi sampel sampel dan standar standar yang yang sama 3. Penent Penentuan uan kadar dilakuka dilakukan n berdas berdasark arkan an hubun hubungan gan (korelas (korelasi) i) dengan dengan menggunaka menggunakan n larutan larutan standar standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam Dalam kromat kromatogr ogram am akan akan terdapa terdapatt peak-p peak-peak eak yang yang mengga menggamba mbarka rkan n banya banyakny knyaa jenis jenis kompon komponen en dalam dalam sample sample.. Sample Sample yang yang mengan mengandu dung ng banyak banyak komponen komponen didalamnya didalamnya akan mempunyai mempunyai kromatogra kromatogram m dengan dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh Oleh karen karenaa itu itu bias biasan anya ya untu untuk k samp sample le jenis jenis ini ini dilak dilakuk ukan an taha tahapa pan n preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih lebih mudah mudah karena karena sediki sedikitt mengan mengandun dung g kompon komponen en selain selain zat aktif. aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja. Contoh hasil analisa HPLC
Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah kompone sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campur campuran. an. Komput Komputer er dapat dapat diguna digunakan kan untuk untuk mengon mengontro troll kerja kerja system system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori, teori, konsep konsep yang yang dipinj dipinjam am dari dari teori teori distil distilasi asi.. Penerap Penerapann annya ya dalam dalam kromatografi, jumlah teori plat N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi.
Untuk peak-peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan peak-peak kromatografi gas, jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai:
meny menyat atak akan an wakt waktu u reten retensi si dan dan
meny menyat atak akan an lehe leherr peak peak pada pada
sete seteng ngah ah ting tinggi gi.. Akan Akan teta tetapi pi untu untuk k peak peak-p -pea eak k yang yang tida tidak k sime simetr trii disarankan menggunakan persamaan:
Gambar grafik asimetri:
Peak asimetri dengan parameter A dan B untuk menghitung haraga N. Berdasarkan Berdasarkan gambar, gambar,
adalah waktu retensi, retensi,
adalah lebar peak
pada ketinggian 10% atau A+B, A adalah lebar sebelah kanan, dan B adalah lebar setengah peak sebelah kiri. Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan kromatogra kromatografi fi gas adalah mendapat mendapat pemisahan pemisahan yang sempurna. sempurna. Derajat Derajat
pemisahan pemisahan (R s) dalam dalam kromat kromatogr ografi afi cair cair kinerj kinerjaa tinggi tinggi-pu -pun n dinyat dinyataka akan n dengan istilah resolusi yang di formulasi sebagai berikut:
Berdasarkan persamaan di atas, terlihat bahwa resolusi dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas selektivitas (α), dan retensi (k’). lebih sederhana sederhana dari kromatografi kromatografi gas, di sini selektivitas selektivitas cukup cukup dinyatakan dinyatakan sebagai:
Dimana: α adalah selektivitas selektivitas,
dan
adalah adalah masing masing-ma -masin sing g factor factor
kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2. Harga selektivitas dapat sama dengan satu atau lebih besar dari satu. satu. Bila harga
berarti berarti senyawa senyawa 1 dan 2
keluar dari kolom bersama-sama. Dengan kata lain senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dipisahkan dari senyawa senyawa 2, sebaliknya sebaliknya bila harga
maka senyawa senyawa 1
keluar dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. Semakin besar harga , semakin baik pemisahan. Efisiensi Pemisahan: Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek pek-p -peak eak krom kromat atog ogram ram yang yang diha dihasi silk lkan an.. Sema Semaki kin n leba lebarr suat suatu u peak peak kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. Parame Parameter ter efisien efisiensi si pemisa pemisahan han dinyat dinyataka akan n dlam dlam bentuk bentuk HETP HETP (heigh (heightt equivalent to a theoretical plate) yang diformulasikan sebagai berikut:
Dimana:
H L N
: HETP (height equivalent to a theoretical plate) : pa panjang kolom da dalam ce centimeter : jumlah total theoretical plate
Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT
adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi. Nilai H menurun dengan: 1. Ukuran Ukuran partikel partikel kolom yang kecil 2. Laju alir fase fase gerak gerak yang yang rendah rendah 3. Fase gerak yang kurang kurang kental kental 4. Pemisahan Pemisahan pada temper temperature ature tinggi tinggi 5. Molekul-mol Molekul-molekul ekul sample sample yang kecil 6. Meningkatk Meningkatkan an panjan panjang g kolom. kolom. Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system. Leba Lebarr puna punak k krom kromat atog ogra rafi fi menu menunj njuk ukka kan n efis efisie iens nsi. i. Efis Efisie iens nsii dan dan sele selekt ktiv ivita itass meru merupa paka kan n desc descrip ripto torr pelen pelengk gkap ap yang yang terg tergan antu tung ng pada pada param parameter eter-par -parame ameter ter kromat kromatogr ografi afi yang yang berbed berbeda-be a-beda. da. Efisie Efisiensi nsi lebih lebih tergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, dan optima optimasi si instru instrumen mental tal,, sedang sedangkan kan selekt selektivit ivitas as lebih lebih tergan tergantun tung g pada pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri. Keuntungan dan keterbatasan HPLC Ada beberapa keuntungan HPLC, yaitu: 1. Dapa Dapatt meng mengan anal alis isis is sampel sampel yang yang tidak tidak mudah mudah meng mengua uap p atau atau tidak tidak stabil dengan pemanasan. 2. Interak Interaksi si yang yang lebih lebih selekti selektiff dengan dengan moleku molekull sample sample kerena kerena fasa fasa gerak gerak dan fasa diam berperan dalam proses kromatografi. 3. Berb Berbag agai ai jen jenis is kol kolom om yan yang g sele selekt ktif if.. 4. Mengha Menghasil silkan kan pemi pemisah sahan an denga dengan n kecepa kecepatan tan ting tinggi. gi. 5. Wa Wakt ktu u anal analis isis is yan yang g cep cepat at.. 6. Pema Pemasu suka kan n samp sample le yang yang tepa tepatt dan dan muda mudah h dike dikend ndal alik ikan an sehi sehing ngga ga menjamin presisi kuantitatif. 7. Resi Resiko ko peru perura raia ian n samp sample le yang yang lebi lebih h keci kecill kare karena na tida tidak k dila dilaku kuka kan n pemanasan. 8. Kera Keraga gama man n kolo kolom m dan dan detec detecto torr bera berarti rti bahwa bahwa selekt selektiv ivita itass meto metode de tersebut dapat disesuaikan dengan mudah. Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPL dihubu dihubungk ngkan an dengan dengan spektr spektrofo ofotom tometer eter massa massa (MS). (MS). Selain Selain itu, itu, keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
BAB III
SIMPULAN
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High High Perform Performanc ancee Liquid Liquid Chroma Chromatog tograp raphy hy (HPLC) (HPLC) merupa merupakan kan metode metode yang yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Dili Diliha hatt dari dari jeni jeniss fase fase diam diam dan dan fase fase gerak gerak,, KCKT KCKT (kol (kolom omny nya) a) dibe dibeda daka kan n menjadi: menjadi: Kromatograf Kromatografii fase normal dan fase terbalik. Beberapa kegunaan HPLC yaitu HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarann kepolarannya, ya, alatnya terdiri terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan larutan tertentu tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campur Campuran an analit analit akan akan terpis terpisah ah berdas berdasark arkan an kepola kepolaran rannya nya,, dan kecepa kecepatan tannya nya untuk untuk sampai sampai ke detektor (waktu retensinya) retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Alat yang berperan berperan penting di dalamnya, dalamnya, antara lain yaitu pompa, injektor, injektor, kolom, kolom, deterk deterktor tor,, dan fase fase gerak. gerak. HPLC HPLC diguna digunakan kan untuk untuk analis analisaa kualit kualitatif atif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Seda Sedang ngka kan n bebe bebera rapa pa hal hal yang yang haru haruss dipe diperh rhat atik ikan an agar agar HPLC HPLC dapa dapatt dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: 1. Parameter Parameter percobaa percobaan n sama sama antara standar standar dan dan sampel sampel 2. Penentuan Penentuan berdasar berdasarkan kan waktu waktu retensi retensi sampel sampel dan dan standar standar yang yang sama 3. Pene Penent ntua uan n kada kadarr dila dilaku kuka kan n berd berdas asar arka kan n hubu hubung ngan an (kor (korel elas asi) i) deng dengan an meng menggu guna naka kan n laru laruta tan n stan standa darr seri seri pada pada wakt waktu u rete retens nsii tert terten entu tu.. Yait Yaitu u berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.
DAFTAR PUSTAKA Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB Bandung. Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu . Semarang: IKIP Semarang Press. . 2006. Kimia Kimia Pemisaha Pemisahan n Metode Metode Kromatogr Kromatografi afi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya Offset. Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair . Bandung: ITB Bandung. Bella, Lisa.2009. Skripsi ‘Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Campuran Guaifene Guaifenesin sin dan Dextrome Dextrometorf torfan an HBr dalam dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Medan: Fakult Fakultas as Farmasi Farmasi Univer Universit sitas as Sumatra Sumatra (KCKT). Medan: Utara. Kromat Kromatogr ografi afi Cair Cair Kinerja Kinerja Tinggi Tinggi (HPLC) (HPLC) | Chem-I Chem-Is-T s-Try. ry.Org Org | Situs Situs Kimia Kimia Indonesia | HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ Lansida Dasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa
