BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran .Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbangakan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang teknologi. t eknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler.Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekulyang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalamRichardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasaJunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan SwediaArne Tiselius, ia memisahkan protein serum sesuai dengan change mereka dalam tabung berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gelelektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus disini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.
1.2 Rumusan Masalah 1. Apa itu elektroforesis gel? 2. Apa saja Jenis-Jenis Elektroforesis gel? 3. Bagaimana komponen alat elekroforesis gel?
1.3 Tujuan 1. Mengetahui definisi teori elektroforesis gel 2. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis gel 3. Memahami komponen alat elekroforesis gel
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Definisi Elektroforesis Elektroforesis
adalah
teknik
pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon
adanya
suatu
medan
listrik
(Harvey, 2000). Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002). Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat -sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai. Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berlandasan laju perpindahannya melewati suatau gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002) Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lam bat berpindah.
2.2
Jenis-Jenis Elektroforesis Gel
Jenis Elektoforesis gel ada dua, yaitu:
1. Elektoforesis Gel Agarosa 2. Elektoforesis Gel Poliakrilamida Pemilihan diantara kedua jenis gel tersebut akan mempengaruhi berhasil tidaknya fragmen molekul biologi yang terbentuk sehingga haruslah diketahui karakterisitk gel yang digunakan dan sampel yang akan dianalisis. Oleh sebab itu untuk tujuan pemisahan molekul, dibutuhkan pertimbangan pemilihan gel karena gel agarosa dan gel poliakrilamid masing-masing memiliki karakteristik yang berbeda. 1. Elektroforesis Gel Agarose Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010). Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu: 1. Gel
poliakrilamida
denaturasi,
berfungsi
untuk
memurnikan
penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar. Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktorfaktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang
digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010) Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010). Elektroforesis gel agarosa dijadikan sebagai metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA atau RNA. Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah daripada gel poliakrilamid, akan tetapi gel ini dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan fragmen DNA dan RNA yang berukuran lebih besar dari 100 bp (base pair) hingga 50 kb dan memisahkan protein dengan ukuran > 200 kDa dengan gerak medan yang digunakan adalah secara horizontal. Konsentrasi agarosa mempengaruhi hasil elektroforesis karena semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarosa lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul
yang melewatinya.
Dengan demikian untuk mempermudah
pergerakan molekul tersebut maka persentase konsentrasi yang digunakan pun lebih rendah. Hal ini cukup menguntungkan karena biaya yang dikeluarkan untuk membuat gel juga akan menjadi lebih murah.
Kelebihan elektroforesis gel agarosa diantaranya teknik yang digunakan sederhana, preparasi gel lebih cepat dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah dan bersifat non toksik, laju pemisahan lebih cepat sehingga fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk, dan dapat memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya. Elektroforesis gel agarosa ini dapat dilakukan pada suhu kamar. Akan tetapi kekurangan dari gel agarosa ini yaitu lebih mudah rusak oleh tangan sehingga membutuhkan kehati-hatian, dan bands yang dihasilkan dapat berkabut dan menyebar agak jauh. Hal yang perlu diperhatikan dalam elektroforesis gel agarosa adalah peng gunaan arus listrik. Voltase yang digunakan haruslah rendah sebab jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA. Agarosa memiliki sifat tidak dapat larut dalam air/bufer pada suhu kamar sehingga diperlukan pemanasan dengan microwave. 2. elektroforesis gel poliakrilamid Berbeda dari gel agarosa, elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid dilakukan pada medan gerak vertikal dan pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarosa, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi dan membutuhkan biaya yang lebih mahal serta preparsi yang lebih lama. Gel poliakrilamid bersifat toksik sehingga harus lebih berhati-hati dalam penanganannya. Namun demikian, gel poliakrilamid dapat menampung jumlah DNA yang lebih besar daripada gel agarosa. Gel poliakrilamid sering digunakan untuk uji kualitatif protein, meskipun juga digunakan untuk uji kualitatif DNA. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi. Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan ukuran 5 — 200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu antara 5 — 500 bp. Adapun gel poliakrilamid lebih murni serta dapat digunakan untuk aplikasi lainnya. Namun demikian, laju pemisahan fragmen lebih lambat dibandingkan menggunakan gel agarosa dan membutuhkan persentase konsentrasi yang lebih banyak dal voltase yang digunakan lebih tinggi.
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose. 2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose. 3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose. 4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993). Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999). Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
2.3 Komponen Alat Elekroforesis Gel Komponen utama alat 1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu. 2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar. 3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.
Rangkaian Alat Elektroforesis
Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua: 1. Elektroforesis Planar 2. Elektroforesis Kolom Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik, juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan
karena
interaksi
tersebut
tidak
disebut
elektroforesis,
melainkan
"elektrokromatografi" . Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut "efek Joule" yang disebabkan karena adanya tumbukan partikel elektron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara, yakni: 1. Pendinginan 2. Efek Konveksi. Efek konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler.
Kapiler yang digunakan dibuat dari silika yang bermuatan netral atau negatif. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.
