ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN Tujuan Percobaan
Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan fraksi-fraksi hemoglobin dan menentukan Hb ormal dan Hb abnormal yang terkandung dalam darah.
Prinsip Percobaan
Elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memisahkan protein-protein atau zat-zat lain yang bermuatan, misalnya protein serum, protein membran, DNA, dan lain-lain dengan cara meletakkan zat-zat tersebut dalam suatu medan listrik. Hb merupakan suatu protein, karena itu ia mempuny mempunyai ai muatan muatan.. Adanya Adanya varias variasii asam asam amino amino pada berbaga berbagaii rantai rantai polipe polipepti ptida da Hb akan akan menyeb menyebabka abkan n perbeda perbedaan an besar besar muatan muatan moleku molekull Hb. Oleh Oleh karena karena itu, itu, Hb dapat dapat dipisa dipisahka hkan n melalui proses elektroforesis. Selain itu, proses elektroforesis juga dapat menunjukkan adanya Hb abnormal sperti Hb C, E, dan S, bahkan dapat juga dilakukan pemeriksaan kwantitatif varianvarian Hb-nya.
Bahan-bahan
Dalam percobaan ini menggunakan bahan-bahan antara lain : 1.
Hemolisat •
Sejumlah darah dicuci dengan menambahkan 2 volume NaCl 0,9%
•
Pusingkan, kemudian buang supernatannya
•
Endapan eritrosit yang didapat dicuci sampai 3 kali dengan cara yang sama seperti di atas
•
Lisiskan endapan yang didapat setelah pencucian tadi, dengan menambahkan 2 volume H2O
•
Debris diendapkan dengan menambah 2 volume CCl4
•
Pusingkan pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit
•
Didapat supernatan yang merupakan larutan Hemolisat, menganding Hb berkadar 8-10 gr%
•
Penambahan 1-2 tetes KCN akan mengawetkan supernatan sampai beberapa minggu
2.
Strip Selulosa Asetat Berukuran : 2,5 x 14,5 cm
3.
Buffer Tris 12 gr Tris, 1,22 gr EDTA dan 15 gr Asam Borat dilarutkan dalam H2O sampai 1 liter.
4.
Larutan Pewarna Ponceau 0,5% dalam larutan trichlorasetat 5%
5.
Larutan Destaining Asam Asetat glasial 5%
6.
Larutan Penjernih Campuran antara 8 volume methanol dan 2 volume asam asetat glasial
Cara Kerja 1.
Strip selulosa asetat direndam dalam buffer Tris selama 5 menit, lalu kelebihan buffer dikeringkan dengan kertas saring. Dua ul sample digariskan pada strip. Setelah strip diletakkan pada alat elektroforesis, jalankan power supply selama 20-35 menit pada tegangan 250-350 V
2.
Setelah proses elektroforesis selesai, rendam strip dalam larutan pewarna selama 5 menit
3.
Cuci strip dalam larutan destaining sampai tdiak tampak lagi adanya pelepasan warna dari strip
4.
Rendam strip dalam larutan methanol selama 2 menit
5.
Rendam strip dalam larutan penjernih selama 5 menit, lalu keringkan diatas sebuah glaas object yang kering dan bersih
