BAB V ELEKTROFORESIS Oleh: Anna Permanasari
PENDAHULUAN Elektr Elektrofo oforesi resiss adalah adalah suatu suatu teknik teknik pemisah pemisahan an yang yang pada pada awalny awalnyaa dikemb dikembang angkan kan untuk memisahkan senyawa-senyawa atau komponen-komponen komponen-komponen yang bermuatan. Pemisahan dengan elektroforesis pada awalnya didasarkan atas perbedaan migrasi komponen bermuatan dalam dalam suatu suatu media media larutan larutan elektr elektroli olitt di bawah bawah pengar pengaruh uh penggu penggunaa naan n arus arus listri listrik k yang yang menyebabkan gradient potensial. Sekarang, teknik elektroforesis berkembang tidak hanya bagi pemisahan senyawa bermuatan saja, melainkan juga dapat digunakan untuk pemisahan pe misahan sekaligus penentuan komponen-komponen tidak bermuatan sekaligus. elalui pembelajaran ini diharapkan mahasiswa dapat: !. menjelaskan prinsip pemisahan dengan teknik elektroforesis ". memahami faktor-faktor yang mempengaruhi elektroforesis. #. mengenal jenis-jenis$tipe-tipe elektroforesis %. memprediksikan pemisahan &omponen atas dasar muatan dan massa molekulnya dengan teknik elektroforesis. '. menjelaskan perbedaan elektroforesis kapiler dari elektroforesis kon(ensional.
)ntuk mempelajari pokok bahasan ini, hendaknya anda memba&a terlebih dahulu tentang prinsip-prinsip kromatografi, serta memahami pekerjaan analisis kuantitatif . )ntuk mendukun mendukung g pemahaman pemahaman anda, disarankan memba&a referensi yang telah ter&antum ter&antum pada bagian belakang dari bahan ajar ini.
PRINSIP ELEKTROFORESIS Elektroforesis adalah teknik pemisahan$analisis suatu &omponen dengan bantuan arus listrik listrik.. Prinsi Prinsip p pemisa pemisahan han dengan dengan elektro elektrofor foresis esis didasar didasarkan kan atas perbed perbedaan aan laju migrasi migrasi &ompon &omponen en sepanj sepanjang ang fasa penduk pendukung ung,, karena karena perbed perbedaan aan bentuk bentuk,, usuran usuran serta serta muata muatan n &omponen-k &omponen-komp omponen onen tersebut. tersebut. *eknik *eknik elektrofore elektroforesis sis banyak banyak digunakan digunakan untuk pemisahan pemisahan partikel koloid bermuatan, atau ion-ion makromolekul seperti protein, asam nukleat serta polisakarida. Adanya Adanya pengembangan teknik, sekarang ini dengan telah berkembangnya berkembangnya teknik elek elektr trof ofor oresi esiss
kapi kapile ler, r, sanga sangatt
memu memung ngki kink nkan an
untu untuk k
memi memisah sahka kan n
seny senyawa-se awa-seny nyawa awa
komponen tidak bermuatan sekalipun. '. !
A. Jenis-Jenis Jenis-Jenis teknik Elektrofor Elektroforesis esis +erd erdasar asark kan
perk erkemba embang ngan an
dalam alam
penem enemu uanny annya, a,
tekn teknik ik
elek elektr tro ofore foresi siss
diklasifikasikan menjadi dua kelompok besar, yaitu teknik elektroforesis kon(ensional dan teknik elektroforesis kapiler.
. Teknik elektroforesis kon!ension"l *eknik *eknik elektroforesis elektroforesis pertama pertama kali dikembangkan dikembangkan dalam dua sistem, yaitu yaitu teknik teknik front" front"ll #$o!in #$o!in% % &o'n(" &o'n("r) r) dan teknik *on"l. *on"l . Perb Perbed edaa aan n kedu keduan anya ya terle terletak tak pada pada penggunaan fasa pendukung. *eknik *eknik elektroforesis frontal tanpa fasa pendukung sementara elektroforesis onal menggunakan fasa pendukung. alam elektroforesis onal, fasa pendukung berfungsi untuk menahan elektrolit yang berfungsi sebagai fasa diam /dalam kromatografi, ada dua fasa yang terlibat, yaitu fasa diam dan fasa gerak gerak.. Pada Pada fasa diam diam berpen berpenduk dukung ung inilah inilah pemisa pemisahan han dari dari kompon komponen en dalam &uran dipisahkan satu dengan lainnya. 0asa pendukung terdiri dari statu bahan berpori dan inert, dapat berupa kertas atau gel. 1omponen dalam &uran bergerak sepanjang fasa diam karena bantuan arus listrik yang tegangannya berkisar pada beberapa puluh (olt saja. 1omponen 1omponen utama alat elektroforesis elektroforesis onal adalah fasa diam berupa larutan elektrolit yang umumny umumnyaa merupakan merupakan suatu larutan larutan bufer dengan p2 tertentu. tertentu. Selain itu, larutan larutan elektrolit berfungsi untuk mengalirkan arus listrik. 1omponen lain dalam alat elektroforesis onal adalah eketroda /katoda dan anoda, serta fasa pendukung. 1utub katoda dan anoda pada saat proses pemisahan dihubungkan dengan arus listrik searah. 0asa pendukung dapat terbuat dari kertas /&elulosa asetat atau &elulosa nitrat atau gel kanji, gel poliakrilamid, busa poliuretan, dan agarosa. 3ambar$bagan alat elektroforesis onal dapat dilihat pada gambar di bawah.
Peralatan elektroforesis sederhana
'. "
4ampuran &omponen ditotolkan pada fasa pendukung dengan jumlah yang memadai menggunakan pipa kapiler. 0asa pendukung yang telah ditotoli dengan &uran &uplikan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah /&hamber yang telah dijenuhkan dengan larutan bufer elektrolit. Sebelum ujung-ujung fasa pendukung di&elupkan ke dalam larutan elektrolit, terlebih dahulu biarkan beberapa saat di dalam wadah untuk menghomogenkan uap elektrolit pada fasa pendukung. Setelah kedua ujung fasa pendukung di&elupkan, hubungkan kedua elektroda /anoda dan katoda dengan arus listrik searah.
Pemisahan senyawa berwarna akan dapat terlihat langsung setelah proses selesai Pemisahan dapat diamati setelah beberapa lama, dan akan mudah terlihat bila &omponen
yang
dipisahkan
&omponen berwarna,
yang
berwarna. dipisahkan
pemisahan
dapat
+ila tidak terlihat
setelah hasil pemisahan pada yertas pendukung tersebut dipaparkan pada &ahaya )5
senyawa tidak berwarna dapat dilihat melalui paparan sinar )5 . '. #
igrasi komponen dalam fasa pendukung dapat terjadi melalui mekanisme yang berbeda, tergantung dari muatan senyawa yang dipisahkan. +ila senyawa tersebut bersifat netral atau tidak bermuatan, maka tidak akan terlihat pergerakan dari molekul tersebut. +ila molekul komponen bermuatan 6 maka akan terlihat bergerak menuju kutub negatif atau katoda. Sebaliknya bila molekul komponen bermuatan - , maka akan terlihat bergerak menuju kutub positif atau anoda.
Sebelum proses
Titik penotolan cuplikan
Sesudah proses
3ambar: Proses pemisahan pada teknik elektroforesis
Semakin besar muatan, semakin &epat ion tersebut bergerak. emikian pula semakin besar r partikel akan bergerak semakin lambat *eknik elektroforesis onal menunjukkan beberapa keunggulan, diantaranya adalah efektif untuk pemisahan senyawa dengan r besar, dapat digabung dengan kromatografi lempeng tipis untuk meningkatkan kinerjanya, lebih &epat dari kromatografi kertas, alat serta teknik &ukup sederhana. eskipun demikian, beberapa kelemahan ditunjukkan oleh teknik ini, yaitu sulit untuk analisis kualitatif, ke&uali dengan elektroforeisis tidak berpendukung, sekar mendeteksi konsentrasi &uplikan yang rendah serta sumar digunakan untuk pemisahan senyawa tidak bermuatan. 1elemahan ini dapat diatasi dengan teknik elektroforesis kapiler.
'. %
Katoda (-) +
Anoda (+)
-
+
-
Katoda (-)
-
-
Anoda (+)
-
Katoda (-)
-2
-
-
-
-2
Anoda (+)
-
3ambar: proses pemisahan pada teknik elektroforesis onal
+. Teknik elektroforesis k",iler. ibandingkan dengan teknik elektroforesis kon(ensional, teknik elektroforesis kapiler menunjukkan beberapa kelebihan. Selain yang telah diungkapkan di atas, pada teknik elektroforesis kapiler, fasa diamnya adalah suatu pipa kapiler /umumnya terbuat dari ka&a$gelas yang meskipun panjangnya bisa bermeter-meter atau bahkan puluhan meter tetapi hanya menggunakan sedikit fasa pendukung. Selain itu, karena fasa diam bersifat tertutup, maka teknik ini dapat dikembangkan kinerjanya dengan &ara menggunakan pompa bertekanan tinggi, dengan tegangan tinggi pula, antara !7.7777 (olt sampai #7.777 (olt. engan meningkatnya kinerja alat, maka proses pemisahan bisa berlangsung jauh lebih singkat dibandingkan dengan teknik kon(enkional, bisa kurang dari 7,' jam. 1elebihan lainnya, dengan teknik elektroforesis kapiler, pemisahan tidak terbatas hanya untuk &omponen bermuatan saja, melainkan juga untuk &omponen yang tidak bermuatan sekalipun. ekanisme pemisahan pada elektroforesis kapiler berbeda dari mekanisme pada teknik elektroforesis onal. Pada elektroforesis kapiler, aliran dan arah pergerakan &omponen tidak hanya dipengaruhi oleh "lir"n elektroforetik seperti pada elektroforesis onal, melainkan juga
dipengaruhi
oleh adanya
"lir"n elektroos$otik . Aliran
elektroforetik menyebabkan partikel-partikel tidak bermuatan relatif tidak bergerak. Partikel-partikel bermuatan 6 bergerak ke kutub 8 /katoda, demikian sebaliknya. engan adanya tekanan dan tegangan yang tinggi, maka partikel-partikel akan 9dipaksa untuk bergerak bersama-sama dari kutub 6 menuju kutub negatip /katoda melalui fasa diam. '. '
Selain itu, pergerakan partikel bermuatan 6 akan diper&epat oleh adanya tolakan muatan 6 pada dinding dalam kapiler. Seperti kita ketahui, ka&a pembuat pipa kapiler tersusun dari silika yang bermuatan -. Selanjutnya muatan 6 dari larutan bufer berinteraksi dengan muatan 8 pada pipa, sehingga praktis permukaan pipa kapiler dikerumuni oleh muatanmuatan 6. 3abungan aliran elektroforetik dan elektroosmotik di dalam pipa kapiler menyebabkan partikel bergerak di dalam pipa kapiler, di mana partikel 6 akan bergerak paling &epat, disusul oleh partikel tidak bermuatan dan akhirnya partikel bermuatan 8 bergerak paling lambat karena adanya hambatan oleh muatan 6 pada permukaan pipa kaplier melalui interaksi asosiasi ion. ekanisme aliran &omponen dalam elektroforesis kapiler ditunjukkan oleh gambar di bawah ini.
ALIRAN LKTR!!S"!SIS
NN NN NN
ALIRAN LKTR!#!RTIK
N
katoda
anoda ALIRAN KSL$R$%AN &ALA" # KA'ILR 3ambar: ekanisme pemisahan pada teknik elektroforesis kapiler
'. ;
iagram alat elektroforesis kapiler ditunjukkan oleh gambar di bawah ini. 1omponen utama dari alat ini adalah wadah larutan buffer, yang ke dalamnya di&elupkan elektroda platina, dimana kedua elektroda dihubungkan dengan sumber arus listrik searah. )jung-ujung pipa kapiler di&elupkan pula ke dalam larutan buffer pada kedua wadaf. Pipa kapiler dilengkapi dengan (al(e injeksi dan pada ujung katoda dihubungkan dengan dete&tor. ete&tor mendeteksi senyawa-senyawa hasil pemisahan, yang selanjutnya mengubah sinyal tersebut menjadi bentuk yang dapat diba&a oleh rekorder, seperti bentuk kromatogram.
*ale in,eksi 'ipa kapiler
detektor
't
't
rekorder
Sumber arus
buer
I
aktu retensi (tr)
3ambar: diagram alat elektroforesis kapiler
'. <
FAKTOR-FAKTOR AN /E/PENARUHI PE/ISAHAN DENAN TEKNIK ELEKTROFORESIS
Ada beberapa fa&tor yang dapat mempengaruhi pemisahan dengan teknik elektroforesis, yaitu kemobilan ion$partikel, erajat ionisasi, pembentukan kompleks bermuatan, konsentrasi larutan elektrolit, serta p2 larutan elektrolit.
A. Ke$o&il"n ion0,"rtikel #12 1emampuan suatu ion atau partikel untuk bergerak sepanjang fasa diam dinyatakan dalam parameter kemobilan. alam suatu pemisahan, perbedaan kemobilan /∆12 harus sedemikian agar menghasilkan perbedaan jarak pemisahan yang &ukup besar. engan demikian diharapkan pemisahan akan terjadi dengan efisiensi memadai. Pada pemisahan dua komponen A dan +, jarak pemisahan selain dipengaruhi oleh kemobilan, juga ditentukan oleh besarnya tegangan yang diterapkan, panjang pendukung dan waktu pengembangan /proses. 2ubungan parameter-parameter tersebut dinyatakan oleh persamaan,
∆S = S A −
= S B
= A −= B t . E L
/!
di mana
S A dan S B
adalah jarak komponen A dan + dari titik penotolan, > adalah panjang fasa
pendukung, 1A dan 1B adalah kemobilan A dan +, E adalah tegangan yang diterapkan dan t adalah waktu pengembangan. ari persamaan di atas diperlihatkan bahwa perbedaan kemobilan yang besar dapat menghasilkan jarak pemisahan yang besar pula. emikian pula, semakin lama waktu pengembangan dan semakin besar tegangan yang diterapkan /sampai batas tertentu, maka akan menyebabkan jarak pemisahan menjadi lebih besar. Selain oleh faktor-faktor di atas, kemobilan ion dipengaruhi pula oleh muatan ion, jari-jari ion serta (iskositas fasa &air elektrolit. 2ubungan tersebut dapat dilihat dari persamaan " berikut.
=
dimana
=
q±
;πη r
/"
adalah (iskositas fasa &air elektrolit, dan r adalah jari-jari ion, ? adalah muatan ion. '. @
B. Konsentr"si l"r't"n elektrolit Seperti telah diungkapkan pada bagian terdahulu, larutan elektrolit berfungsi selain sebagai fasa diam yang terikat pada fasa pendukung, juga sangat berperan dalam menurunkan tahanan fasa pendukung. Selain itu adanya larutan elektrolit menyebabkan terjadinya arus yang memang dikehendaki terjadi. 1onsentrasi larutan elektrolit akan sangat mempengaruhi kemobilan ion. 1onsentrasi larutan elektrolit yang terlalu pekat akan menyebabkan (iskositas elektrolit menjadi tinggi. engan demikian, mengikuti persamaan ", maka kemobilan ion menjadi lebih ke&il. 2al ini berarti terhambatnya migrasi ion sepanjang fasa pendukung, sehingga akan menyebabkan lambatnya pergerakan ion-ion se&ara keseluruhan. Akibat lebih lanjutnya adalah rendahnya kualitas pemisahan ion-ion tersebut.
3. Pe$&ent'k"n ko$,leks &er$'"t"n Senyawa-senyawa yang nonionik satu sama lain tidak dapat dipisahkan dengan teknik elektroforesis onal karena syarat utama elektroforesis onal adalah spesi yang dipisahkan terdapat dalam bentuk ion. Agar senyawa-senyawa tersebut dapat dipisahkan dengan teknik ini, maka perlu ada treatment9 terlebih dahulu, diantaranya melalui pembentukan kompleks bermuatan. Sebagai &ontoh, bila kita akan memisahkan &uran senyawa hidrokarbon yang sudah tentu tidak bermuatan /nonpolar, maka terlebih dahulu direaksikan dengan pengompleks ion borat /+O ##- dalam suasana basa. 2asil reaksinya adalah suatu kompleks organo-borat yang bermuatan -, yang dibawa oleh pengompleks borat tadi. Se&ara umum reaksi yang terjadi dapat dituliskan sebagai berikut. O212
6
+O##-
1ompleks organo-borat bermuatan /-
. ,H l"r't"n elektrolit >arutan elektrolit yang digunakan dalam teknik elektroforesis umumnya adalah larutan bufer dengan p2 tertentu. +ila yang dipisahkan dengan teknik ini adalah &uran asam atau basa , termasuk asam-asam amino atau asam$basa lainnya, maka p2 menjadi sangat penting untuk diperhatikan.
'. B
arilah kita lihat reaksi ionisasi suatu asam lemah yang akan dipisahkan dari &urannya dengan teknik elektroforesis.
26 /a? 6 A-/a?
2A/a?
Ka
=
E H +DE A−D HA
p1a C %,<'
−
pKa
=
pH − log
E A D E HAD
/#
+ila p2 larutan elektrolit sama dengan p1a asam yang akan dipisahkan, maka baik spesi molekul maupun ion-ionnya akan berada bersama-sama dalam larutan. *etapi bila kita menginginkan asam tersebut berada pada bentuk ionnya, karena bentuk ionnya berwarna sehingga dapat dengan mudah terlihat hasil pemisahannya, sesuai dengan persamaan kesetimbangan di atas maka p2 larutan elektrolit harus lebih besar dari dari nilai p1a /%,<' dalam &ontoh. 2al ini dapat difahami karena pada p2 lebih besar dari %,<' , jumlah 2 6 dalam larutan menjadi lebih sedikit. engan demikian maka kesetimbangan akan bergeser ke arah pembentukan 26 dan A- atau kesetimbangan bergeser ke arah penguraian 2A /ingatlah aas >e 4hatelier. Sebaliknya, bila kita mengharapkan asam ini terdapat dalam bentuk molekulnya karena kita menginginkan asam tersebut tidak bergerak selama proses pemisahannya, maka kita dapat mengatur p2 larutan elektrolit lebih ke&il dari nilai p1a-nya. engan demikian maka pada p2 ke&il /26D akan menjadi besar kesetimbangan akan bergeser ke arah pembentukan molekul 2A. engan demikian, karena terdapat dalam bentuk molekulnya maka selama proses elektroforesis /onal berlangsung prkatis 2A tidak bergerak.
3onto4 So"l. Suatu &uran yang mengandung basa organik dan senyawa nonionik akan dipisahkan dengan teknik elektroforesis onal dengan harapan keduanya dapat terpisah satu sama lain. +ila basa tersebut memiliki nilai 1 b " F !7 -# , *entukan pada p2 larutan elektrolit berapa proses ini dapat dilaksanakan. Pen)eles"i"n5 Pers"$""n5 BOH #&"s" or%"nik2 #"62
+6 /a? 6 O2- /a?
1b C" F !7-#
'. !7
+
K b
=
−
E B DEOH D E BOH D
pOH =
pK b
−
log
E BOH D +
E B D
p1bC - log 1b C - log " .!7 -# C # 8 log " C ", <
Pada p2 C p1b C ",< basa +O2 terdapat dalam baik spesi molekulnya maupun spesi ionnya. iharapkan dalam pemisahan, basa organik terdapat dalam bentuk ionnya, sehingga dapat terpisah dari senyawa nonionik yang tidak bermuatan. Agar terdapat dalam bentuk ionnya, maka menurut reaksi kesetimbangan di atas, O2-D harus diperke&il.
engan demikian maka kesetimbangan
akan bergeser ke arah
pembentukan ion atau ke arah penguraian molekul +O2. Gika O2 -D lebih ke&il artinya 26D menjadi lebih besar. engan demikian maka dapat diartikan lebih lanjut bahwa p2 larutan elektrolit harus lebih ke&il dari nilai p1b nya /",<
PE/ISAHAN ASA/ A/INO DENAN TEKNIK ELEKTROFORESIS *eknik elektroforesis sangat banyak diaplikasikan untuk memisahkan &uran asam-asam amino hasil penguraian protein. Seperti kita ketahui bila protein dihidrolisis, maka akan diperoleh berbagai jenis asam amino yang dapat diidentifikasi jenisnya berdasarkan hasil pemisahan dengan teknik elektroforesis, baik dengan teknik elektroforesis kapiler maupun teknik elektroforesis onal /kon(ensional. Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pemisahan &uran asam amino tersebut adalah kemampuan asam amino untuk terdapat dalam spesi anionik, kationik atau bentuk witternya. alam hal ini akan terlihat bahwa pemisahan asam amino sangat dipengaruhi oleh p2 larutan elektrolit /larutan bufer yang digunakan. alam kegiatan belajar ini, akan dijelaskan a. Pengaruh p2 terhadap bentuk$spesi asam amino dalam larutan b. Pemisahan asam amino dengan teknik elektroforesis onal &. Pemisahan asam amino dengan teknik elektroforesis kapiler
A. Pen%"r'4 ,H ter4"(", &ent'k 0s,esi "s"$ "$ino ("l"$ l"r't"n Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino yang bila berasala dari protein, gugus aminonya terdapat pada atom karbon
α.
Humus umum asam
amino adalah '. !!
H 8 42 8 4OO2 l I2" Apabila asam amino dilarutkan dalam air, maka gugus karbosilatnya akan melepaskan ion 26 sementara gugus amina akan terprotonasi seperti terlihat dalam reaksi berikut ini. O H 8 42 8 4 8 O
O 2
H
42
4
O-
I2#6
I2"
Oleh karena kemampuannya untuk membentuk spesi dengan gugus 6 dan 8 itulah maka asam amino tergolong at yang dapat membentuk zwitter
ion /ion
6 dan 8 bersama-sama
dimiliki dalam struktur molekulnya, dinamakan juga molekul isolistrik. +entuk zwitter ion sangat
dipengaruhi oleh p2 larutan. p2 dimana bentuk asam amino terdapat sebagai
zwitter ion disebut
titik isolistrik /*J>. Pada konsentrasi O2- yang tinggi /p2 tinggi
dalam larutan, asam amino terdapat sebagai anion /bentuk basa sementara pada konsentrasi 26 tinggi /p2 rendah, asam amino terdapat sebagai kation /bentuk asamnya O H 8 42 8 4 8 O I2" /bentuk basa p2 L *J>
O H
42
4
O O-
I2#6 /bentuk Kwitter p2 C *J>
H 42
4
O2
I2#6 /bentuk asam p2 M *J>
apat disimpulkan bahwa pada p2 C *J>, asam amino berada dalam bentuk witternya. Sementara itu, bila p2 larutan lebih besar dari *J> nya, maka deprotonasi menyebabkan asam amino akan berada pada spesi basanya /bermuatan -. +ila p2 larutan M *J nya, maka asam amino akan berada pada spesi asamnya /bermuatan 6 karena protonasi.
'. !"
i bawah ini adalah titik isolistrik beberapa asam amino/Orten, G., N O Ieuhaus Asam amino Alanin Arginin Asam Aspartat Asam 3lutamat 3lisin 2istidin >eusin
*itik Jso >istrik ;,77 !7,<; ",<< #,"" ',B< <,'B ',B@
Asam Amino >isin 0enilalanin Prolin Serin *riptofan *irosin 5alin
*itik Jsolistrik B,<% ',%@ ;,#7 ',;@ ',@B ',;; ',B;
Sekarang mari kita ambil &ontoh salahsatu asam amino yaitu alanin. Pada p2 ; alanin terdapat dalam bentuk witter ionnya. +ila p2 di bawah ;, maka akan terjadi protonasi terhadap gugus 4OO -, sehingga terbentuk 8 4OO2. Alanin akan bermuatan 6 dari gugus I2#6. Sebaliknya bila p2 larutan L dari ; maka akan terjadi deprotonasi. 26 dari gugus I2#6 akan dinetralkan oleh ion O2 - dari larutan sehingga alanin terdapat dalam bentuk basa /bermuatan -. +erbeda dengan alanin, arginin yang memiliki p2 isolistriknya sebesar !7,<; akan bermuatan 6 /dalam bentuk asamnya pada p2 di bawah !7,<;. Alanin baru akan bermuatan 8 /dalam bentuk spesi basanya bila p2 larutan lebih besar dari !7,<;. +erdasarkan perbedaan titik isolistrik ini, maka setiap asam amino kemungkinan akan memiliki muatan yang berbeda di dalam medium air dengan pengontrolan p2 larutan.
3onto4 So"l. Jsilah kotak-kotak kosong pada tabel di bawah ini. Asam amino
*J>
bentuk pada
+entuk pada
+entuk pada
p2 #
p2 ;
p2 !"
Asam aspartat Arginin >isin 0enilalanin
Pen)eles"i"n:
'. !#
Pelajari kembali uraian tentang pengaruh p2 terhadap spesi asam amino. Jsikanlah nilai *J> masing-masing asam amino berdasarkan tabel pada uraian, kemudian isilah kotak kosong dalam tabel. Asam amino Asam aspartat Arginin >isin 0enilalanin
*J> ",<< !7,<; B,<% ',%@
bentuk pada
+entuk pada
+entuk pada
p2 # Spesi basa /- Spesi asam /6 Spesi asam /6 Spesi asam /6
p2 ; Spesi basa /- Spesi asam /6 Spesi asam /6 Spesi basa /-
p2 !7 Spesi basa /- Spesi basa /- Spesi basa /- Spesi basa/-
B. Pe$is"4"n "s"$ "$ino (en%"n teknik elektroforesis 7on"l +erikut ini adalah data pemisahan tiga jenis asam amino dengan teknik elektroforesis onal pada berbagai p2 larutan elektrolit$bufer yang digunakan. 1eberhasilan pemisahan dapat ditunjukkan oleh migrasi relatif dari masing-masing asam amino pada masingmasing p2 yang digunakan
Asam amino
*J>
2istidin As glutamat 3lisin
<,'; #,# ',B<
igrasi relatif pada KE0 p2 #,# p2 <," p2 B,# -;@ 6< -'7
-@ 6<" 6!%
6!7 6<< 6 <7
*anda 8 pada kolom migrasi relatif menunjukkan arah migrasi. *anda 8 menunjukkan bahwa arah migrasi asam amino menuju kutub 8 atau katoda, sedangkan
tanda 6
menunjukkan arah migrasi ke kutub 6 atau anoda. Angka ;@, @, <" dan seterusnya merupakan petunjuk tentang ke&epatan migrasi komponen. Semakin &epat migrasinya maka angkanya akan semakin besar.
3onto4 So"l P"(" ,H 898 $"k" 2istidin bermuatan ........., asam glutamat bermuatan ............, glisin bermuatan ................ 2istidin bermigrasi ke kutub ......................... / .......................... Asam glutamat bermigrasi ke kutub ......................../......................... 3lisin bermigrasi ke kutub ..................... /................................. )rutan >aju migrasi histidin, asam glutamat, dan glisin :...................................................... Apakah asam glutamat dapat terpisah dari histidin dan glisin '. !%
Pen)eles"i"n: P"(" ,H 898 2istidin bermuatan / 6 , asam glutamat bermuatan kurang lebih /netral, glisin bermuatan /6 2istidin bermigrasi ke kutub /- /1atoda Asam glutamat bermigrasi /6./anoda, sebenarnya hampir tidak bermigrasi karena netral 3lisin bermigrasi ke kutub /- /katoda )rutan >aju migrasi histidin, asam glutamat, dan glisin anoda
1atoda
/6
as glu
gli
his
Apakah asam glutamat dapat terpisah dari histidin dan glisin 1etiga asam amino dapat terpisah satu sama lainnya.
A," )"n% ter:"(i &il" elektroforesis (il"k'k"n ,"(" ,H ;9+ < P"(" ,H ;9+9 2istidin bermuatan hampir bermuatan netral / dalam tabel masih bermuatan 6 , asam glutamat bermuatan /-, glisin bermuatan /- 2istidin bermigrasi ke kutub /- /1atoda Asam glutamat bermigrasi ke kutub /6./anoda 3lisin bermigrasi ke kutub /6 /anoda )rutan >aju migrasi histidin, asam glutamat, dan glisin anoda /6
1atoda glu
gly his
Apakah asam glutamat dapat terpisah dari histidin dan glisin 1etiga asam amino dapat terpisah satu sama lainnya. As glutamat terpisah jauh sedangkan histidin dan glisin berdekatan
Bil" kit" &eker:" ,"(" ,H =989 2istidin bermuatan hampir bermuatan - , asam glutamat bermuatan /-, glisin bermuatan /- '. !'
2istidin bermigrasi ke kutub 6 /Anoda Asam glutamat bermigrasi ke /6./anoda 3lisin bermigrasi ke kutub /6 /anoda )rutan >aju migrasi histidin, asam glutamat, dan glisin anoda
1atoda
/6
his
gli as glu
Apakah asam glutamat dapat terpisah dari histidin dan glisin 2istidin terpisah baik dari glisin dan asam glutamat. Asam glutamat tidak terlalu terpisah dengan glisin baik karena perbedaan migrasinya &ukup ke&il
3. Pe$is"4"n "s"$ "$ino (en%"n teknik Elektroforesis k",iler. +erbeda dengan pada teknik elektroforesisi onal, dimana arah pemisahannya ke kedua kutub 6 dan -, pada elektroforesis kapiler, arah pemisahannya hanya menuju katoda saja. 2al ini dimungkinkan karena selain oleh dorongan "lir"n elektroforetik , pada teknik terakhir ini mekanisme migrasinya dipengaruhi pula oleh gaya
"lir"n
elektroos$otik . engan dukungan ,er&e(""n ,otensi"l )"n% tin%%i /sampai !7.7777 m5 atau bahkan lebih, maka dalam elektroforesis kapiler migrasi komponen hanya $en':' ke s"t' "r"4 s":"9 )"it' k"to(" . Oleh karena itu, bila pada elektroforesis onal &uran dapat ditotolkan di tengah-tengah fasa pendukung, maka dalam elektroforesis kapiler >"$,'r"n (iin:eksik"n (i ':'n% "no(".
alam peralatannya, teknik
elektroforesis kapiler umumnya dilengkapi dengan detektor yang dapat mengubah sinyal listrik menjadi bentuk elektrogram /kur(a waktu retensi (s intensitas. engan demikian maka hasil pemisahan dapat langsung di analisis lebih lanjut dalam ke dalam aspek kuantitatifnya, dengan adanya standar asam amino yang diketahui jumlah dan jenisnya. Setiap asam amino akan memiliki ?"kt' retensi )"n% k4"s dan berbeda untuk setiap jenisnya pada kondisi yang sama. Prinsip ini melandasi "n"lisis k'"lit"tif hasil pemisahan. Intensit"s #"re"2 ,'n>"k dalam elektroforegram /lebih disukai dengan istilah yang digunakan dalam kromatografi, yaitu kromatogram menunjukkan konsentr"si asam amino hasil pemisahan /berarti "n"lisis k'"ntit"tif . engan membandingkan intensitas standar dengan intensitasnya dalam &uran &uplikan, maka konsentrasi asam amino dalam &uran dapat diketahui.
'. !;
Adakalanya asam amino yang akan dipisahkan tersebut memiliki *J> yang hampir sama. alam hal ini, maka perbedaan laju migrasi akan ditentukan oleh massa molekul relatif dari masing-masing asam amino. Semakin besar massanya, semakin lamban kemampuan geraknya dan semakin ke&illah laju migrasinya. arilah kita perhatikan hasil pemisahan &uran yang terdiri dari beberapa asam amino berikut ini, pada kondisi pemisahan tertentu. waktu retensi /menit pada p2 Asam amino Alanin /ala Arginin /arg Asam Aspartat /asp Serin /ser *irosin /tyr
r @B !<% !## !7' !
*J> ;,77 !7,<; ",<< ',;@ ',;;
bufer %
;
!," #,' ',! !,@ ",B
!,B !,# #,' ",@ ',"
arilah kita &ermati data retensi untuk pemisahan pada bufer %. )rutan waktu retensi mulai dari yang terke&il /berarti yang ter&epat sampai ke detektor adalah : Ala M ser M tyr M arg M asp 0enomena di atas dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada p2 bufer %, asam amino yang terhadap dalam bentuk "s"$nya /berarti p2 bufer lebih rendah dari *J> adalah ser, tyr, ala dan dan arg. Artinya dapat ditulis spesi asam aminonya : ser/6, tyr /6, ala /6, dan arg /6. Asam amino yang terdapat dalam bentuk &"s"nya /berarti p2 bufer lebih ke&il dari *J> adalah asp, sehingga dapat ditulis asp /- alam elektroforesis kapiler berlaku aturan: yang paling &epat bermigrasi adalah yang bermuatan /6, kemudian tidak bermuatan, dan terakhir yang bermuatan /-. Jngatlah bahwa analit bergerak ke katoda yang bermuatan /-. aka dapat diartikan bahwa aspartat akan bermigrasi paling lambat dibandingkan asam amino lainnya. 2al ini ditunjukkan oleh paling besarnya waktu retensi asam aspartat dibandingkan dengan asam amino lainnya. alam &uran di atas, yang bermuatan /6 ada % spesi, maka selanjutnya yang menentukan perbedaan laju migrasi adalah rnya. r. Ala M Ser M tyr M arg . Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa laju migrasi ala L ser L tyr L arg, atau waktu retensi ala M ser M tyr M arg. '. !<
Se&ara keseluruhan dapat disimpulkan, bahwa urutan laju migrasi mulai dari yang ter&epat /berarti waktu retensi terke&il adalah Ala 8 ser 8 tyr 8 arg 8 asp. Oleh karena itu pada p2 %, maka kromatogram pemisahannya dapat dilihat dalam kromatogram di bawah ini..
J
asp ala
tyr ser
!
"
arg
#
% ' *r, waktu retensi /menit
engan &ara yang sama, pada p2 bufer !!, maka urutan retensi asam amino adalah sebagai berikut /mulai dari yang tr terke&il : arg 8 ala 8 ser 8 asp 8 tyr. Pada kondisi tersebut, semua asam amino terdapat dalam spesi basanya, karena p2 larutan bufer berada di atas *J> untukse mua asam amino dalam &urannya. an mengingat r ala M ser M asp M tyr M arg, maka arginin adalah asam amino yang keluar dari kolom kapiler paling lambat sedangkan yang paling &epat adalah alanin dengan r paling ke&il. Oleh karena itu, maka kromatogram yang dihasilkan pada pemisahan dengan p2 bufer !! ditunjukkan oleh gambar di bawah ini.
'. !@
J
arg ala
asp ser
!
"
tyr
#
% ' *r, waktu retensi /menit
L"ti4"n: !. pemisahan pada elektroforesis pada umumnya terjadi karena QQQQQQQ.. ". Partikel 6 dalam elektroforesis ona bergerak ke kutub QQQQQQQQQ. #. Partikel 8 dalam elektroforesis ona bergerak ke kutub QQQQQQQQQQ %. >aju partikel dengan r besar lebih besar$lebih ke&il /Pilih salah satu dari laja migrasi partikel dengan r 4e&il '. +erilah penjelasan bagaimana (iskositas, muatan serta jari-jari ion mempengaruhi kemobilan. ;. +agaimana pemisahan senyawa bila tegangan, perbedaan mobilitas, waktu pengembangan serta panjang pendukungnya besar <. Partikel dengan muatan paling besar menunjukkan laju migrasi QQQQQQ.. pada kondisi p2 larutan elektrolit berupa &uran arginin, metionin, leusin, dan triptofan dapat dipisahkan dengan teknik elektrofoersis onal. +erikan penjelasan yang memadai untuk pemilihan tersebut @. Jsilah kotak kosong dalam tabel dengan seksama. Prediksikan urutan retensi &uran asam amino dalam &uplikan dalam bentuk kromatogram. Pemisahan dilakukan pada p2 bufer ',B.
'. !B
Asam amino fenilalanin triptofan arginin asam
*J> ',' ',B !7,@ #,"
r
spesi dalam
laju migrasi
urutan retensi
larutan
relatif /R
/RR
!<' "7% !<% !%;
glutamat /R berilah tanda R, RR, RRR, RRRR untuk urutan laju migrasi. Semakin banyak semakin besar laju migrasinya. /RR berilah no !, ", #, % untuk urutan retensi. Angka ! menunjukkan urutan retensi paling pendek /paling singkat. Angka % menunjukkan urutan retnsi paling panjang /paling lama teretensi.
DAFTAR PUSTAKA !. 4hristian, 3.. !BB%. An"l)ti>"l 34e$istr). 'th edition. Iew ork: Gohn iley N Sons. ". ay, H.A. )nderwood, A.>. A. 2adyana Pudjaatmaka /Alih bahasa. !B@B. An"lisis Ki$i" K'"ntit"tif . Edisi 1elima. Gakarta: Penerbit Erlangga. #. Geffery, 3.2., +aset, G., endham, Gl., enney, H.4. !B@B. Vo%el@s Tet&ook of '"ntit"ti!e 34e$i>"l An"l)sis. 'th edition. Iew ork: >ongman S&ientifi& N *e&hni&al. %. orrison, 3.2., and 2. 0reiser /!B<%. Sol(ent EFtra&tion in Anality&al 4hemistry, ' th Edition, Gohn illey and Son Pub. Iework. '. in4ewsky, G. 11./!B@". Separation and Pre&on&entration ethods in Jnorgani& *ra&e Analysis, !st Edition, Ellis 2orwood >imited Pub., Iework.. ;. Poedjiadi, Anna /"77%, asar-dasar +iokimia, Edisi He(isi, Penerbit )ni(ersitas Jndonesia, Gakarta. <. Skoog, .A., est, .., and 2oller, 0.G., !BB;. F'n("$ent"ls of An"l)ti>"l 34e$istr).
'. "7
