ELEKTROFORESIS
Elektrofor Elektroforesis esis merupakan proses proses bergeraknya bergeraknya molekul bermuatan bermuatan pada suatu medan listrik. listrik. Kecepatan Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam asam nukleat nukleat). ). Elektr Elektrofo ofores resis is untuk untuk makrom makromole olekul kul memerl memerlukan ukan matri matriks ks penyang penyangga ga untuk untuk menceg mencegah ah terjad terjadiny inyaa difusi difusi karena karena timbu timbulny lnyaa panas panas dari dari arus arus listr listrik ik yang yang digunak digunakan. an.
Gel
polia poliakri krilam lamid id dan agarose agarose merupa merupakan kan matrik matrikss penyangg penyanggaa untuk untuk separa separasi si protei protein n dan asam asam nuklea nukleat. t. Posisi Posisi molekul molekul yang yang tersep tersepara arasi si pada pada gel dapat dapat didete dideteksi ksi dengan dengan pewarna pewarnaan an atau atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektrode negatif. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya (Batur, 2008).
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel tidak hanya digunakan sebagai metode analisis, tetapi secara rutin digunakan untuk persiapan memurnikan fragmen-fragmen DNA tertentu (Klug, 2009). Molekul-molekul DNA itu bermuatan negatif dan di dalam medan listrik, molekul DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukurannya: molekul DNA yang kecil dapat dengan mudah melewati melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat dibandingkan dibandingkan molekul yang lebih besar (Old, 1989).
Molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Gel agarosa biasanya digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil (biomul.wordpress.com). Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa , PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut (Batur, 2008). Keuntungan khusus yang diperoleh dengan melakukan elektroforesis gel adalah bahwa pita DNA dapat dideteksi dengan kepekaan yang tinggi.
Keuntungan khusus yang diperoleh dengan melakukan elektroforesis gel adalah bahwa pita DNA dapat dideteksi dengan kepekaan yang tinggi. Selain dapat memunculkan fragmenfragmen DNA yang panjangnya berbeda-beda, elektroforesis gel dapat memisahkan konfigurasi molekul yang berbeda-beda dari suatu molekul DNA.molekul DNA yang berbentuk lingkaran tutup kovalen, lingkaran longgar, dan berbentuk lurus memiliki kecepatan yang berbeda-beda (Old, 1989).
Elektroforesis dengan hubungannya dengan bioteknologi
Bioteknologi adalah aplikasi prinsip-prinsip ilmu dan rekayasa dalam pengolahan bahan bahan menggunakan agen biologis untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi yang
berpotensi dikembangkan di Indonesia meliputi bioteknologi pertanian, farmasi dan kesehatan, industri (bioproses), lingkungan, dan kelautan. Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa.DNA akan bergerak ke arah anoda dan molekul dengan ukuran paling kecil akan bergerak paling jauh/cepat. Terdapat hubungan yang erat antara elektroforesis dengan bioteknologi. Misalnya dalam bidang kesehatan, elektroforesis dapat berfungsi sebagai kemajuan dalam bidang bioteknologi kesehatan. Seperti dalam memecahkan permasalahan yang sering timbul perebutan anak, mencari orangtua kandung hingga pembuktian teroris membuat tes DNA menjadi hal utama yang paling ditunggu. Tes DNA saat ini sudah makin familiar, apalagi dengan bermacam kasus yang terjadi di Indonesia. Berkat tes DNA, proses penyelidikan pun terbantu dan kebenaran lebih mudah terungkap. Tes DNA biasanya dilakukan untuk tujuan pribadi maupun tujuan umum seperti kasus-kasus untuk kepentingan penyelidikan polisi. DNA atau Deoxyribo Nucleic Acid merupakan asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang genetika. DNA inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifatsifat khusus dari manusia.Metode yang digunakan dalam tes DNA adalah dengan mengidentifikasi fragmen-fragmen dari DNA itu sendiri. Secara sederhananya, yaitu metode untuk mengidentifikasi, menghimpun dan menginventarisir file-file khas karakter tubuh. Di dalam inti sel, DNA membentuk satu kesatuan untaian yang disebut kromosom. Setiap sel manusia yang normal memiliki 46 kromosom yang terdiri atas 22 pasang kromosom somatik dan 1 pasang kromosom sex (XX atau XY). Setiap anak akan menerima setengah pasang kromosom
dari ayah dan setengah pasang kromosom lainnya dari ibu sehingga setiap individu membawa sifat yang diturunkan baik dari ibu maupun ayah. Hampir semua bagian tubuh dapat digunakan untuk sampel tes DNA, tetapi yang sering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut pada pipi bagian dalam dan kuku. Sampel DNA yang digunakan bisa dari inti sel maupun mitokondrianya. Namun yang paling akurat adalah inti sel karena inti sel tidak bisa berubah. Biasanya yang paling sering dan mudah digunakan dalah sampel darah karena lebih gampang. Tapi sel darah yang diambil adalah sel darah putih, bukan sel darah merah, karena sel darah merah tidak mempunyai inti sel. Akurasi kebenaran tes DNA hampir mencapai 100% akurat. Kesalahan pola DNA bisa saja terjadi, tapi sangat kecil kemungkinannya, mungkin satu diantara satu juta. Metode tes DNA yang umumnya digunakan adalah metode elektroforesis DNA. Metode ini sudahsesuai dengan standar yang dianjurkan oleh FBI, jika akan membantu dalam hal penyidikan kepolisian. Sedangkan metode tes DNA yang terbaru adalah dengan menggunakan kemampuan partikel emas berukuran nano untuk berikatan dengan DNA. Namun metode ini masih dikembangkan di Amerika.
Pada dasarnya tahapan metode tes DNA dengan cara elektroforesis meliputi beberapa tahapan berikut yaitu: 1.
2.
Preparasi sampel dan pengambilan sampel DNA (isolasi) dari bagian tubuh. Pemurnian DNA dari kotoran-kotoran seperti protein menggunakan teknik sentrifugasi atau filtrasi vakum.
3.
Pemasukan sampel DNA yang telah dimurnikan k edalam mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai tahapan amplifikasi.
4.
Hasil amplifikasi ini adalah kopi urutan DNA lengkap dari DNA sampel.
5.
Karakterisasi kopi urutan DNA dengan elektroforesis untuk melihat po la pitanya.
6.
Tahapan typing untuk memperoleh tipe DNA.
7. Finishing untuk mencocokan tipe-tipe DNA.
Gb 1. Elektroforesis
Gb 2. Percobaan Elektroforesis
Komponen2 dan tahapan elektroforesis ( Batur, 2008) :
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked ) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker ), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well ) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan ( staining ) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, pe rak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Gb 3. Contoh pemfotoan hasil elektroforesis DNA
Pita-pita (band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda m ( arker ) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. (www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler )
Gb 4. Proses Elektroforesis
DAFTAR PUSTAKA
Batur Agung, 2008, Electrophoresis Protein, http://oefy.blogmalhikdua.com , diunduh pada tanggal 11 November 2009 Klug, William.S., Michael R. Commings., Charlotte A. Spencer., Michael A. Palladino., 2009, Concepts of Genetics 9th Ed, Pearson Benjamin Commings, San Fransisco. hal 270 Old R.W., Primrose S.B., 1989, Prinsip-prinsip Manipulasi Gen : Pengantar Rekayasa Genetik edisi 4, Blackwell Scientific Publication, Oxford. Hal 5-11 http ://biomul.wordpress.com, diunduh tanggal 11 November 2009 www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler , diunduh tanggal 9 November 2009
MAKALAH PRESENTASI BIOTEKNOLOGI
ELEKTROFORESIS
Oleh: Kelompok 1 Ganjil
Devi Putri H. Kandhita Aliena R. Oviani Bravista D. Eldina Febrianifa Renadya Elsaristy Nurliana Puspitasari
06/KG/07981 06/KG/07983 06/KG/07985 06/KG/07987 06/KG/07989 06/KG/07991
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2009
