BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran . Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam Richardson dkk, dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa Junani yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
1
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada 1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.
B. Tujuan
a. Mengetahui Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Prinsip dan Teori Elektrofor El ektroforesis esis
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif. keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari pemisahan elektroforesis. elektroforesis . hal ini terutama t erutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al, et.al , 2010) Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalam medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda. sama,
ion
bermuatan
positif
bergerak
diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)
3
menuju
katoda
dalam
medan
listrik
Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010) Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang lebih kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010) Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008). Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenen
4
atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal dan
interferensi
anomali
paling
kecil
pada
boundary.
Pada
umumnya
istilah
elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar, 2008). Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)
5
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan(Ricardson dkk. 1986): F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996 ektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986 Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986). Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh oleh suatu partikel bermuatan sesuai dengan :
6
d= =
(persamaan 2.1)
dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U = Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang ditempuh (Kopkar, 2008). Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas Manz, et.al, 2010) a. Mobilitas elektroforesis Mobilitas elektroforesis μep merupakan parameter spesifik untuk senyawa yang diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik diterapkan. senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain. Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E, pengalamannya sebuah gaya listrik Fef: Fef
= q.E
(persamaan 2.2)
Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode negative (katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda negative (anoda). Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul menengah. gaya ini berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi elektroforesis, Vep serta viskositas medium, ἠ. (Andreas Manz, et.al, 2010) Ffr = 6 . ἠ . π . r. Vep
(persamaan 2.3)
7
Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan gaya listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan konstan, Vep (persamaan 2.5). Fef
=
Ffr
(persamaan 2.4)
Vep
=
q.E
(persamaan 2.5)
6 . ἠ . π . r Mobilitas elektroforesisμep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan migrasi Vep atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering digunakan daripada VEP untuk menggambarkan migrasi ion.
μep = Vep / E =
q.E
(persamaan 2.6)
6 . ἠ . π . r Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka mobilitas elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti yang disebutkan sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas dasar rasio q / r, ketika mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam medan listrik. perubahan pH penyangga mengubah muatan suatu analit dan dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas Manz, et.al, 2010) b. Aliran elektroosmosis (EOF) Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti kaca, menyatu silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan yang paling bioanalitik, pH buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif yang dihasilkan. Kelompok Silanol (SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler
8
menjadi negatif . Ini menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi massal. (Andreas Manz, et.al, 2010) Dalam
penerapan
medanlistrikkationdilapisandifusbergerak
menujukatodadan
tariksolusimassaldengan mereka. gerakan inidari solusimassaldisebutaliranelektroosmosis. dalamelektroforesisgelphenomenonofEOFjugadisebut
sebagaielectroendoosmosis.
Kecepatan dari EOF ,VEOF berbanding lurus dengankonstanta dielektrikdan potensizeta, dari buffersertakekuatan
medanlistrik
diterapkan,
E.Veofberbanding
terbalik
denganviskositasbufferpemisahan.
VEOF =
μEOF
=
( persamaan 2.7)
VEOF / E
(persamaan 2.8)
Seringkaliarahmobilitaselektroosmosisdari ionanalit.
Iniadalahkarena
bagi
solusimassal
adalahmelawanarahdari
kebanyakanpemisahanbiomelecularionanalitbermuatan
negatifdan akandiseretke arahanodasedangkanEOFdiarahkankatoda. ProfilaliranEOFmemilikibentukplug.
kecepatan
aliranidentikatas
seluruhdiameterkapiler , kecuali untukbergeraklebih lambatlapisandifusdekat dengan dindingkapiler. Distribusi kecepatanhomogeneusmeminimalkanpelebaran pitadan dengan demikian meningkatkanefisiensi pemisahan. situasiyang sangat berbedaterjadidengan tekananalirandidorongdigunakan siniprofilaliranparabolakecepatan
dalamChromatografycair.di aliranmemilikidistribusi
9
besaratasdiameterkolom.
analitdalam arustengahjauh lebih cepat daripadaanalitlebih dekat kedindingsaluran.Hasilini dalampelebaran pitadan hilangnyaefisiensi pemisahan. Kontrol EOF
Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh:
1). beroperasi pada pH rendah, 2).
permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya dengan lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas, dan potensial zeta. 1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan ata pH cukup rendah untuk protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pH di mana banyak biomolekul tidak stabil. 2). Modifikasi kimia dari gugus silanol pada dinding kapiler dapat dilakukan untuk membuat mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan hidrofilik, diperoleh dengan pengobatan dengan asam sulfonat, mempertahankan konstan, EOF tinggi. kelompok fungsional hidrofobik melekat memimpin permukaan penekanan EOF. masalah dengan modifikasi kimia adalah bahwa stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah. 3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan polimer seperti polietilena glikol (PEG) ke buffer run. lapisan polimer kental terbentuk pada dinding kapiler,yang topeng biaya dan menekan EOF. 4). Aditif netral seperti hidroksil etil selulosa atau Polyvinil alkohol meningkatkan viskositasbuffer menjalankan dan dengan demikian mengurangi kecepatannya. Selanjutnya, mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik seperti asetonitril metahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau meningkatkan viskositas masingmasing.
surfaktan
dindingcapillarlydan
kationik
seperti
dengan
dedocyl demikian
10
trimetilamonium
bromidamenyerapke
mengubahmuatan
permukaan.
inimembalikkanarahEOF.
surfaktanharus
digunakanpada
konsentrasi
rendahuntuk
menghindaripembentukanmisel, yangdapat menggangguproses pemisahan. c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran elektroforesis
(EOF).
mobilitasnyata
μappdarisuatu
analitditentukan
olehjumlah
darimobilitaselektroforetiknyaμep dan mobilitaselektroosmosisμ EOF .(Andreas Manz, et.al, 2010)
μapp = μep + μ EOF
(persamaan 2.9)
JikaEOFmendominasigerakanelektroforesis, menujukatoda.
mereka
dalammobilitasjelas. samadenganμ EOF .
dipisahkandari
kationmemilikiμapp
satu
semuakomponenanalitbergerak
sama
lainkarena
perbedaanmereka
tertinggikarenamerekaberada
Spesiesnetraltidak
merekadiseretpadakecepatandari
maka
diarah
memilikiμep.
yang
Karenanya
solusimassal.Anionmencapaikatodaterakhir,
μepnya
menentangarahμ EOF.
Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari mobilitas nyatanya ,
μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8). kekuatan medan, E,
adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L. Karena itu v, dapat dijelaskan sebagai:
v = μapp . E = (μep +
μ EOF ) .
V/L
11
(persamaan 2.10)
Waktu perpindahan, t, dari analit didefinisikan sebagai panjang kapiler , L, kecepatan perpindahan ,v. Substitusi v untuk persamaan 3.9 menjadi: L2 t = L/v =
(persamaan 2.11)
μapp . V Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat velocitynya dan lebih cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran pita utamanya disebabkan ileh difusi longitudinal. Distribusi peak
τ berbanding lurus dengan koefisien difusi, D dari 2
analit dan waktu perpindahannya. 2 . D. L2
τ
2
=
2.D.t =
(persamaan 2.12)
μapp.
V
Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:
μapp . V N = L2 /
τ
2
=
(persamaan 2.13) 2. D
Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan. Tegangan yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat. Dalam teori jutaan pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis membuat teknik ini unggul dari
LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam
prakteknya, bagaimanapun, plat nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis.
12
pelebaran pita disebabkan oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan yang mengarah ke plat nomor di urutan ratusan ribu ketimbang jutaan . Resolusi, Rs, elektroforesis
antara
antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas dua
spesies,
∆μep (yaitu
selektivitas
pemisahan),
tegangan
pemisahan,V, mobilitas elektrofoersis nyata, μapp , dan koefeisien difusi, D.
Rs = ∆μep .
√ . √ .
(persamaan 2.14)
Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah untuk meningkatkan selektivitas pemisahan∆μep. ini dapat dicapai misalnya dengan mengubah pH buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis. meningkatkan tegangan pemisahan, juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi untuk molekul besar seperti ini memiliki koefisien difusi yang kecil
B. Jenis – Jenis Elektroforesis
Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan konvensional yang telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai penyempurnaan dari
metode
koinvensional
yang sebelumnya.
Adapun
jenis-jenis
elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok teknik elektroforesis, yaitu: a.
Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving boundary)
13
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang. b.
1.
Dengan pengemban padat atau matriks seperti: -
Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)
-
Elektroforesis Kertas
-
Elektroforesis selulosa asetat
-
Elektroforesis gel
Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah) Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan
elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion-ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida dan bubuk gel (Kopkar, 2008). Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas atau konformasi. 2.
Elektroforesis Kertas Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia
di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang
14
kemudian menghasilkan nukleosida 2′ -monoposfat dan 3′ -monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis
tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu
dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis. Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
2′-monoposfat dan nukleosida 3′ -monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis
komponen
tersebut
terpisah-pisah,
sehingga
dapat
mengisolasi
dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut. 3.
Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu), Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinu.
Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari
15
suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.
Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar, 2008)
4.
Elektroforesis Gel (GE) Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked ) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
16
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker ), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well ) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan ( staining ) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita
17
yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker ) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan kecepatannya tergantung dari : a.
Ukuran molekul DNA
b.
Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c.
Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk : 1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur 2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur. 3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.
18
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut. a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom b. DNA Fingerprinting c. Mendeteksi kelainan genetik. d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen f. Mempelajari evolusi tingkat molecular g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu. i.
Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j.
Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik nonkonduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer elektrolit. pori-pori fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul bermigrasi menurut ukuran mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media pendukung anticonvective, yang dapat meminimalkan difusi dari molekul sampel, dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita.
19
karenanya, nomor plat tinggi dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel, hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak bermigrasi melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis gel adalah agak lambat dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah otomatis. Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam
gel native elektroforesis
dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium dedocylsulfate-poliakrilamida
gel
elektroforesis
(SDS-PAGE)
analit
diperlakukan
sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk sixe rasio. maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.
Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE) Gel M edia
Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu : mudah atau
20
cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya pemisahan yang sangat besar. Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam: 1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel
agarosa
formaldehid
denaturasi,
berfungsi
untuk
menyediakan
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).
21
sistem
Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. pori-pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm konsentrasi 1% (10 mg mL-1) sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1). pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive. Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen crosslinking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C% Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut: 1. Ukuran molekul DNA. Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak. 2.
Konsentrasi gel. Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel. 4. Densitas muatan
22
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume molekul. 5. Pori-pori gel. Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA. 6. Voltase. Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan. 7. Larutan buffer. Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi DNA akan lebih cepat.
5.
Elektroforesis Kapiler (CE) Elektroforesis
kapiler
adalah
metode
elektroforesis
yang
digunakan
untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
23
Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen campuran bermuatan listrik maka komponen-komponen
campuran tersebut bermigrasi
ketika arus listrik searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak menuju katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda-noda berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana. Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat
dari noda-noda
tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan
24
konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah istilah elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). . Ali ran El ektroforentik Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa klasik (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997)) Al ir an elektr oosmotik .
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO -) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kationkation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan
25
kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.5.
Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroosmotik)
(sumber: L. Thompson, et.al (1997)) Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara keseluruhan aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation) bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling lambat karena aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen elektroforesis kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan
26
sebagai ikan yang sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai akan menuju ke hilir. Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut
V=
E + E ef
(persamaan 2.15)
eo
V menyatakan kecepatan solut menuju katoda,
adalah mobilitas elektroforetik, adalah ef
eo
mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis kapiler (sumber: L. Thompson, et.al (1997)) Ef isiensi E lektr ofor esis kapil er .
Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor penentu keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler menyerupai kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dengan formula berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
27
N = Seperti dalam persamaan, mobilitas elektroforentik,
ef
(persamaan 2.16)
menyatakan mobilitas elektroforetik,
menyatakan ef
adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang eo
diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N) dalam elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya efisiensi dalam elektroforesis konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
C. Instrumentasi Elektroforesis
1.
Elektroforesis Gel Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat pendingin dan
komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan
28
secara vertikal atau horizontal. catu daya memberikan tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk melindungi pengguna dari tegangan tinggi . Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan 3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya digunakan. Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam bentuk pita yang sempit dan lebar Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.
29
Gambar 2.7 Bentuk – bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c. bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010) Preparasi Sampel Dan Sistem B uf fer
Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya mengandung gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk menghindari pemblokiran untuk gel
30
sampel pori-pori harus tidak mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi dan garam dan penyangga dalam sampel dapat mengganggu pemisahan elektroforesis. maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel yang diperlukan tergantung pada metode deteksi, jumlah khas di ordee g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa berkisar dari L ke Ml Vi sual i sasi Dan Deteksi
Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan protografhy M etode Gel Elektr ofor esis
A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE) Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing seperti
ᵝmercapto
etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan
tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino
31
B. Isoelektrik Focussing (IEF) Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose dan PA keduanya digunakan pada metode IEF. C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE) Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat dibandingkan dengan database elektronik.
Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil dalam operasi.
2.
Instrumen Elektroforesis Kapiler Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari
beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
32
Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Pipa Kapil er .
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100
m dan
panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan pada gambar 2.9 dan 2.10
33
Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak efisien.
Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
34
Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena s utu molekul dapat bermuatan positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukan pada gambar 2.11
Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide dengan elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional
35
dilakukan mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4. Sistem Pemasuk an Cupl ikan
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masingmasing dapat diformasi dengan persamaan.
Q=
Q=
(persamaan 2.17)
(persamaan 2.18)
Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah konsentrasi cuplikan,
adalah visikositas, dan , ef
eo,
kuata rus, dan L adalah panjangh
pipa kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah cuplikan akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi efisiensi elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.
36
Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap efisiensi (N) (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain spektrometri (seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan
37
amperometri). Detektor UV diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa kapiler yang terbuat dari gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini memungkinkan pendeteksian aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak perlu mengganggu aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15 dapat digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.
Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006). Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati sinar UV maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.
Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
38
Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
D. Aplikasi Elektroforesis
1.
Elektroforesis Gel (GE) Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualis asi asam nukleat. Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel. Standar pencampuran mengandung molekul dengan dasar berpasangan panjangnya. Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder. Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan pita ke pita dalam barisan DNA.
39
Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida 2.
Elekroforesis Kapiler (CE) An ali sis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC diperlihatkan pada gambar 2.17.
Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A) CE dan B (HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)
40
Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate. Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak
0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan peptide. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya : 1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus. 2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. 3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
Kelebih an dan Kekur angan dalam E lektr ofor esis
Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
41
tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak terlalu jelas memisah.
42
BAB III KESIMPULAN
1.
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat.
2.
Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elektroforesis.
3.
Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis kertas, elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler
4.
Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel poliakrilamida
5.
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara
untuk
memvisualisasikan
keberadaan
DNA,
plasmid,
PCR.Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada se buah DNA.
43
dan
produk
