V. Alat dan Bahan
Alat : -
Rak tabung reaksi
-
Beker gelas
-
Pipet tetes
-
Spektrometer
-
Tabung reaksi
-
Gelas ukur
-
Batang pengaduk Bahan :
reagen-reagen
reagen biuret : Larutkan 1,5 gr CuSO 4.5H2O dan 6,0 gr natrium kalium tartrat (NaK C4O6.4H2O) kedalam kira-kira 500 ml air di labu takar 1 liter. Kemudian tambahkan 300 ml 10 % NaOH sambil d ikocok-kocok. Dan akhirnya tambahkan air sampai garis. Larutan biru ini dapat disimpan lama sekali. Apabila pembuatannnya kurang baik dapat terjadi endapan hitam atau merah. Reagen yang demikian tidak boleh dipakai.
Larutan protein : buatlah larutan serum albumin murni atau kasein dalam air yang berkadar 10 mg per ml. untuk mudah larutannya tambahkan beberapa tetes 3 % NaOH.
VI. Prosedur Percobaan
Pipet kedalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1 sampai 10 mg per ml. tambahkan 4 ml reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Hukum lambert-beer berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 dan 10 mg per ml.
VII. Hasil Pengamatan
Konsentrasi Kasein
Adsorbansi (A)
Adsorbansi (A)
albumin
blanko
1
0,199
0,148
2
0,249
0,137
3
0,299
0,154
4
0,341
0,153
5
0,465
0,141
6
0,561
0,142
7
0,592
0,146
8
0,598
0,141
9
0,623
0,142
10
0,676
0,141
(mg/ml)
Absorbansi Sampel : 0.536
VIII. Reaksi Kimia H
O 2+
Cu
+2
H2N
N
O
NH O
+
O
4 NaOH
H2N
HN
NH
+
Cu HN
HO
NH
N H
OH
4
H2O
+
4Na
+
IX.
Analisa Data
X
Y
XY
X
1
0,199
0,199
1
2
0,249
0,498
4
3
0,299
0,897
9
4
0,341
1,364
16
5
0,465
2,325
25
6
0,561
3,366
36
7
0,592
4,144
49
8
0,598
4,784
64
9
0,623
5,607
81
10
0,676
6,76
100
X= 55
Y= 4,603
XY = 29,944
N . XY - X . Y Slope (A)
= N . X2 – (X)2
10(29,944) – 55 (4,603) = 10 (385) – (55)2 =
0,056091 2
Y . X - X . XY
Intersep
= N . X2 – (X)2 4,603(385) – 55 (29,944) = 10 . 385 – (55)2 = 0,1518
Y = AX+ B
Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (1) + 0,15 = 0,21 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (2) + 0,15 = 0,27
2
X = 385
Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (6) + 0.15 = 0.51 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (7) + 0.15 = 0.57
Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (3) + 0,15 = 0,33 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (4) + 0,15 = 0,39 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (5) + 0,15 = 0,45 X 0 1 2 Y 0.15 0.21 0.27
3 0.33
Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (8) + 0.15 = 0.63 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (9) + 0.15 =0.69 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (10) + 0.15 = 0.75 4 5 6 7 0.39 0.45 0.51 0.57
8 0.63
9 0.69
10 0.75
Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin
0.8 0.75 0.7
0.69 0.63
0.6
0.57 0.51
0.5 0.45 0.4
0.39 0.33
0.3
0.27 0.21
0.2 0.15 0.1 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin dalam regresi linear 0.8 0.75 0.69
0.7 0.63
0.6
0.57
i s n0.5 a b r 0.4 o s b0.3 a
0.51 0.45 0.39 0.33 0.27 0.21
0.2 0.15
0.1 0 0
1
2
3
4
5
6
kadar albumin
7
8
9
10
Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi sample X yang memiliki Absorbansi= 0.536 dapat ditentukan dengan rumus be rikut :
=
=
= =
=
X.
Pembahasan
Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Terdapat beberapa metode spektrofotometri untuk penetapan kadar protein yaitu Pengukuran langsung pada 280nm, Metode Biuret, Metode Lowry, Metode pengikatan pewarna dan Metode Turbimetri. Namun pada percobaan kali ini penentuan kadar protein dengan menggunakan metode biuret. Dimana protein yang akan di uji adalah larutan albumin. Pada percobaan kali ini, larutan protein di buat dari 1 sampai 9 mg per ml yang di encerkan dari larutan albumin 10%. Setelah larutan protein dibuat lalu dimasukkan dalam tabung reaksi dan semua tabung tadi ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret dan dikocok lalu diamkan selama 30 menit. Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan operating time yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Selain itu digunakan juga larutan blanko, larutan blanko merupakan larutan tidak berisi analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko diberi perlakuan yang sama seperti larutan albumin. Setelah itu akan terlihat warna biru ungu pada semua tabung reaksi tadi. Pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu+2. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu spectrometer UV pada panjang gelombang 540 nm, dengan alat ukur ini kita dapat secara sfesifik mengukur absorbansi atau % T dari senyawa yang mengandung unsure logam, oleh sebab itulah larutan standar ditambahkan dengan reagen biuret yaitu reagen yang mengandung ion logam dalam hal ini adalah Cu 2+. Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu 2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-NaTartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu 2+ sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana
basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi pada masing-masing konsentrasi yaitu 0.249, 0.299, 0.341, 0.465, 0.561, 0.592, 0.598, 0.623, 0.676. Data tersebut menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi harga absorbansi yang didapat semakin besar. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi yang berbanding lurus, yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya. XI. Kesimpulan
1. Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret, terjadi pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu 2+. 2. Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang bewarna ungu. 3. Semakin tinggi konsentrasi larutan protein maka semakin banyak ikatan peptida dalam larutan yang menyebabkan pembentukan kompleks semakin banyak, ini dapat dilihat dari warna biru ungu yang semakin pekat. 4. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu spektrometer UV pada panjang gelombang 540 nm. 5. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu 6. Semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula daya serapnya.
XII. Daftar Pustaka
Anonim. (2012,Juni 09). Penentapan Totap Protein Serum Dengan Metode Biuret . Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://smartfresh.blogspot.com/2012/06/penetapan-total-protein-serum-dengan.html Poedjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press. Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. Lesmana, I. (2011,Maret 01). Fungsi Larutan Blanko. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://indralesman.blogspot.com/2011_03_01_archive.html
Lampiran : a. Gambar Alat
Pipet tetes
Beaker Gelas
Gelas Ukur
Erlenmeyer Spektometer
b. Jawaban Pertanyaan
1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang diberikan 0.8 0.7 0.6 n a 0.5 b r o0.4 s d0.3 A
0.2 0.1 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Konsentrasi Albumin
Karena diketahui harga adsorbansi sampel sebesar 0,536 maka konsentrasi sampelnya terletak antara 5-6 mg/ml
=
=
= =
=
2. Berikan penjelasan tentang hukum Lambert-beer Jawab : Hukum lambert-beer menyatakan hubungan antara konsentrasi dengan adsorbansi yang semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya. Hal ini ditunjukkan dengan bentuk kurva yang linear antara konsentrasi dan adsorbannya.
3. Senyawa apakah yang dapat menganggu cara biuret seperti di atas ? Jawab : Senyawa yang memberikan endapan warna hitam atau merah pada reagen biuret yaitu garam amonia. Jika hal tersebut terbentuk maka reagen biuret tidak terbentuk.
4. Mengapa reaksi tersebut juga disebut dengan reaksi biuret ? Jawab : Karena menggunakan reagen biuret
5. Senyawa kompleks apa yang terjadi ? Jawab : Senyawa kompleks bewarna ungu
6. Apakah peptida juga memberikan reaksi biuret, jika memberikan, berikan penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yang bercampur di dalam peptide ? Jawab : Ya, karena pada uji tersebut berfungsi untuk menunjukkan adanya ikatan peptida pada molekul protein dengan memberikan efek warna ungu. Cara menentukannya yaitu dengan menambahkan reagen biuret pada larutan protein dengan pengukuran adsorbansi.
