ISOLASI PROTEIN
Laporan Praktikum
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekuler yang dibimbing oleh Dr. Umie Lestari, M.S dan Hendra Susanto, S. Pd, M. Kes, Ph. D
Oleh Kelompok 3/Off I Alif Rosyidah El Baroroh
150342606362 150342606362
Badrul Munir Arrosadi
150342607243 150342607243
Dewi Sekar Miasih
150342606610 150342606610
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI November 2017
A. TOPIK :Isolasi Protein Jaringan Otot Ikan B. TUJUAN
Tujuan dalam praktikum ini sebagai berikut: 1. Mengetahuhi cara isolasi protein 2. Mengetahui cara elektroforesis SDS Page dn menghitung berat molekul protein
C. DASAR TEORI
Protein adalah molekul organik terbanyak yang terdapat dalam sel. Fungsi protein antara lain memicu kontraksi dalam melakukan gerak dan memicu terjadinya berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel sendiri. Selain itu protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri (voet dan voet , 2011). Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein jenis apapun dan berasal dari makhluk apapun tersusun atas 20 asam amino. Jadi sebenarnya perbedaan antara protein yang satu dengan yang lainnya disebabkan oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino di dalam tiap-tiap tiap-ti ap molekul (voet dan voet , 2011).. Molekul protein berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen dan membentuk mantel air. Dikarenakan molekul protein besar, maka di dalam air protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sangat meningkatkan kelarutan suatu protein ( salting in). in). Sifat ini, yakni kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain sifat tersebut, protein juga mempunyai sifat lain yang berperan penting dan menjadi dasar dalam pemisahan protein yaitu ukuran molekulnya yang berbeda-beda sebagai akibat dari perbedaan jumlah asam amino penyusun protein serta muatan yang dikandungnya dikandungnya (voet dan voet , 2011)..
A. TOPIK :Isolasi Protein Jaringan Otot Ikan B. TUJUAN
Tujuan dalam praktikum ini sebagai berikut: 1. Mengetahuhi cara isolasi protein 2. Mengetahui cara elektroforesis SDS Page dn menghitung berat molekul protein
C. DASAR TEORI
Protein adalah molekul organik terbanyak yang terdapat dalam sel. Fungsi protein antara lain memicu kontraksi dalam melakukan gerak dan memicu terjadinya berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel sendiri. Selain itu protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri (voet dan voet , 2011). Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein jenis apapun dan berasal dari makhluk apapun tersusun atas 20 asam amino. Jadi sebenarnya perbedaan antara protein yang satu dengan yang lainnya disebabkan oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino di dalam tiap-tiap tiap-ti ap molekul (voet dan voet , 2011).. Molekul protein berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen dan membentuk mantel air. Dikarenakan molekul protein besar, maka di dalam air protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sangat meningkatkan kelarutan suatu protein ( salting in). in). Sifat ini, yakni kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain sifat tersebut, protein juga mempunyai sifat lain yang berperan penting dan menjadi dasar dalam pemisahan protein yaitu ukuran molekulnya yang berbeda-beda sebagai akibat dari perbedaan jumlah asam amino penyusun protein serta muatan yang dikandungnya dikandungnya (voet dan voet , 2011)..
Sifat-sifat protein tersebut menjadi dasar pemisahan protein yang digunakan untuk deteksi atau diagnosis molekuler. Pemisahan protein dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu kromatografi gel, elektroforesis, dan salting out Kromatografi gel berfungsi sebagai proses pemisahan protein berdasarkan berat dan ukuran molekul. Cara ini juga sering disebut kromatografi kolom dan size exclusion chromatography chromatography karena menggunakan butirn sintetik yang memiliki diameter dan ukuran pori-pori tertentu sebagai penyaring molekul. Molekul yang berukuran kecil akan mudah masuk ke pori-pori dan menjadi lambat berjalan keluar dari kolom, sedangkan molekul dengan ukuran lebih besar akan lebih sulit masuk ke pori-pori dan langsung menuju ke luar, sehingga hasil kromatografi akan menunjukkan urutan pengeluaran molekul mulai dari yang terbesar hingga yang terkecil (Holil ,2014). Dasar dari proses elektroforesis adalah fakta bahwa protein adalah makromolekul yang terdiri dari asam amino yang terikat secara kovalen. Setiap protein dibedakan dari muatan elektronnya yang berikatan secara kovalen atau ionik. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan dengan pH tertentu dapat mengandung protein dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Sebab, susunan dan jumlah asam amino setiap protein tidaklah sama (Holil ,2014).. Apabila larutan protein diletakkan dalam suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak bermuatan tidak akan bergerak.PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode analisis yang digunakan untuk memisahkan komponen campuran protein berdasarkan ukurannya. Teknik ini berdasarkan prinsip bahwa molekul yang bermuatan akan bermigrasi pada daerah elektrik ke elektroda yang berlawanan tandanya. Dengan kata lain teknik ini menggunakan prinsip perbedaan kemampuan migrasi dari setiap molekul (Holil ,2014).. Teknik elektroforesis umum tersebut tidak bisa digunakan untuk menentukan berat molekul dari molekul biologis karena pergerakan zat bergantung pada tidak hanya ukuran tapi juga muatan. Untuk mengatasi ini, sampel biologis membutuhkan perlakuan khusus yaitu penyeragaman muatan yang dapat
menyebabkan pergerakan zat bergantung hanya pada ukuran. Untuk protin-protein yang memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda, harus didenaturasi terlebih dahulu dengan menggunakan bantuan SDS ( Sodium Dodecyl Sulphate(Holil Sulphate (Holil ,2014).).
D. ALAT DAN BAHAN
Alat : 1. Mortal pistil 2. Mikrotube 1,5 ml 3. Sentrifuge dingin 4. Mikropipet 5. Plate elektroforesis 6. Vortex 7. Elektroforesis 8. Tip mikropipet 9. Shaker 10. Scaner 11. Sonikator 12. Nanodrop 12. Nanodrop spektrofotometer
Bahan 1. Alumunium foil 2. PBS tween-PMSF 3. Etanol PA 4. Tris HCl 5. Acrilamid-bis 30% 6. Tris Cl 1,5 M pH 6,8 7. dH2O 8. SDS 10 % 9. Temed 10. Aquades 11. APS 10%
12. Tris Cl 1,5 pH 8,8 13. Sampel crude protein 14. RSB 15. Plastick wrap 16. Larutan destaining
E. PROSEDUR KERJA
1. Isolasi Protein Jaringan otot ikan Organ otot
Ditimbang seberat 0,5 gr
Diletakkan pada mortal dingin
Ditambahkan pasir kuarsa secukupnya untuk mempermudah penghancuran, dihaluskan
Ditambahkan PBS tween-PMSF sebanyak 2000 µl
Dipipet dan di masukkan ke dua mikrotube dengan ukuran 1,5 ml
Disonifikasi dengan sonikator selama 10 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 25° C
Diambil supernatan dan diletakkan di empat mikrotube baru masing – masing 500 µl
Ditambahkan maing-masing 500 µl ethanol PA
Dikocok sampai tercampur
Didiamkan dalam freezer selama 24 jam
Disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 °C selama 15 menit
Dibuang etanolnya dan pelet dibirakan dengan kondisi tutup mikrotube terbuka pada suhu ruang
Diletakkan pada wadah dengan posisi mikrotube terbuka serta ditutup dengan alumunium foil wadah tersebut
Dimasukkan dalam kulkas dengan suhu 4 °C selama 24 jam
Dikeluarkan dari kulkas
Ditambahkan Tris-HCL pH 6,8 sebanyak 100 µl
Dikocok sampai tercampur
Disimpan didalam frezer
Supernatan dalam tabung, supernatan dalam tabung kemudian dapat diukur kemurniannya dengan nanodrop spektrofotometer
2. Elektrroforesis SDS-PAGE Crude Protein Jaringan Otot ikan a. Pembuatan separating Gel 12,5%
Mencampur bahan 2793 µl Acrimaid-Bis 30%, 2250 µl Tris-Cl 1,5 M pH 8,8, 2046 µl dH 2O, 112,5 µl SDS 10%
Di vortex hingga homogen
Ditambahkan APS 10 % 112,5 % dan temed 5 µl ke dalam mikrotube menggunakan mikropipet
Campuran kemudian dikocok sebentar dengan mikropipet lalu dimasukkan kedalam plate elektroforesis hingga batas
Untuk meratakan gel diberi akuades untuk membentuk permukaan yang lurus Ditunggu 10-30 menit hingga gel mengeras
Dikeluarkan akuades dengan cara dimiringkan dan dihisap menggunakan tissue
b. Pembuatan Stacking Gel 3% Dicampurkan 552 µl Acrilamide-Bis 30 %, 672 µl Tris CL 1,5 M pH 8.8, 300 µl dH 2O, dan 45 µl SDS 10 % ke dalam mikrotube
Di vortex hingga homogen
APS 10 % 45 µl dan temed 5 µl ditambahkan kedalam mikrotube menggunakan mikropipet
Campuran tersebut dikocok sebentar dengan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam plate elektroforesis hingga batas
Sisir elektroforesis dipasang diatas bagian dari stacking gel
Ditunggu 10-30 menit hingga gel mengeras
Dilepaskan sisiran dengan hati-hati dan dikeluarkan akuades dengan cara dimiringkan dan dihisap menggunakan tissue
Sampel crude protein dapat dimasukkan kedalam sumuran yang telah terbentuk
c. Running Gel Elektroforesis
Preparasi sampel dengan cara 10 µl sampel dimasukkan ke dalam mikrotube dan menambahkan 10 µl larutan RSB non reducing pada mikrotube dan diberikan lubang 3 tususk dan ditut up dengan plastik wrap
Sampel dipanaskan dalam akuades yang sudah mendidih selama 5 menit
Sampel dipanaskan dalam akuades yang sudah mendidih selama 5 menit
Crude yang sudah dingin dapat dimasukkan ke dalam sumuran dengan volme 10 µl setap sumuran
Dielektroforesis dengan voltase 130V 60 mA (2 plate) higga tracking dye 0,5 cm diatas dasar
d. Pewanaan Gel dengan Commasie Brilian Blue R250
Gel hasil elrktroforesis direndam dengan larutan staining hingga terendam Shaker gel selama 30 menit
Gel direndam larutan destaining lalu di shaker selama semalam
Visualisasi dengan scaner untuk melihat hasil pita.
F. HASIL DAN ANALISIS
Sebelum
dilakukan
elektroforsis
terlebih
dahulu
sampel
di
periksa
kemurniannya dengan nanodropspektrofotometer sehingga menghasilkan nilai kemurnian pada grafik dibawah:
Keterangan : Unit
: mg/ml
Protein conc
: 14,886
A280
: 14886
260/280
: 1,26
Sampel type
: 1 Abs ; 1 mg/ml
Gel hasil elektroforesis
Perhitungan Berat Molekul Protein
1) Ditentukan nilai b dan a (a 1- a 9) pada marker, yakni dengan menggunakan penggaris, diukur mulai dari ujung sumuran sampai dengan RSB untuk mendapatkan nilai b. Lalu untuk mendapatkan nilai a yakni diukur dari ujung sumuran sampai dengan pita pertama. Lalu jarak dari sumuran ke pita kedua merupakan nilai a2 dan seterusnya sampai a 9
2) setelah diketahhui nilai b dan a kemudian di masukkan nilainya kedalam tabel Ms excel dan menurut literatur diketahui sebagai berikut :
berat molekul marker protein
Sampel 1
marker
RSB
Sampel 2
3) Gel hasil elektroforesis yang telah di scan selanjutnya dihitung berat molekulnya dengan bantuan protein standart sebagai marker
untuk
menghitung Rf (ratardakan factor) dari masing-masing pita dengan rumus :
Rf:
ℎ
4) Dilanjutkan ke spss untuk pembuatan kurva berat molekul standart yang digunakan yakni data Rf dan log BM pada variabel view seperti gambar berikut:
5) Di klik pada data view, sehingga muncul tampilan seperti gambar berikut :
6) Di klik tab analyze lalu dipilih regresion dan dipilih lagi untuk curve estimation seperti yang namapk pada gambar:
7) Pada kolom dependent dipilih log BM, sedangkan untuk variabel dipilih Rf lalu di klik ok
8) Didapatkan kuva linear seperti yang nampak pada gambar , pada tabel coeficients terdapat nilai Rf yang digunakan sebagai nilai a dan (constant) sebgai nilai b lalu dimasukkan kedalam persamaan y = ax + b
9) Persamaan yang telah diperoleh digunakan untuk menccari berat molekul pada sampel yang di uji
*Setelah dilakukan langkah seperti diatas didapatkan hasil a, b, dan Rf pada marker sebgai berikut :
perhitungan berat molekul protein marker no
a
b
rf
berat molekul (BM)
log BM
1
0,5
6,5
0,076
198
2.29666519
2
1,5
6,5
0,230
62
1.792391689
3
2
6,5
0,307
49
1.69019608
4
2,8
6,5
0,430
38
1.579783597
5
3,4
6,5
0,523
28
1.447158031
6
4
6,5
0,615
18
1.255272505
7
4,2
6,5
0,646
14
1.146128036
8
5,9
6,5
0,907
6
0.77815125
9
6,3
6,5
0,969
3
0.477121255
Sehingga dalam analisis spss didapatkan hasil sebagi berikut :
Coefficients
Rf
Unstandardized
Standardized
Coefficients
Coefficients
B
Std. Error
Beta
t
Sig.
-1.815
.107
-.988
-16.949
.000
36.724
.000
(Constant) 2.333
.064
Kemudian kurva regresi yang terbentuk sebagai berikut:
Didaptkan persamaan : Y = ax +b Y = - 1864 x + 2,258 Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel (jaringan otot ikan ) dimana nilai Rf yakni sama dengan x, lalu nilai X yang didapatkan disubtitusikan kedalam persamaan yang telah didapatkan dari perhitungan yakni Y = - 1864 x + 2,258. Setelah nilai disubtitusikan maka akan didapatkan nilai y , yakni sama dengan log BM. Untuk mengetahui
BM (berat molekul) maka nilai log BM di anti log
sehingga didapatkan hasil pada tabel sebagi berikut :
PERHITUNGAN BERAT MOLEKUL PROTEIN SAMPEL No a
b
Rf (x)
BM (AntilogBM)
logBM (y)
1
1.4
6.5
0.215384615
87.51387678
1.942076923
2
2.6
6.5
0.4
40.45758917
1.607
3
3.2
6.5
0.492307692
27.50815979
1.439461538
4
3.5
6.5
0.538461538
22.6825725
1.355692308
5
4.1
6.5
0.630769231
15.42246688
1.188153846
6
4.4
6.5
0.676923077
12.71699836
1.104384615
7
4.9
6.5
0.753846154
9.220813345
0.964769231
8
5.1
6.5
0.784615385
8.108174316
0.908923077
9
5.2
6.5
0.8
7.603262769
0.881
10
5.5
6.5
0.846153846
6.269469143
0.797230769
11
5.8
6.5
0.892307692
5.16965473
0.713461538
12
6
6.5
0.923076923
4.545852967
0.657615385
G. PEMBAHASAN Isolasi Protein
Protein adalah biopolimer yang terdiri dari banyak satuan asam Amino yg dihubungkan oleh ikatan peptide. Beberapa protein merupakan komponen utama dalam jaringan struktur (otot, rambut, kuku, kulit).Kata protein berasal dari bahasa Mesir “proteus” yang terjemahan kasarnya berarti “yang utama”.Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N ada pula yang mengandung unsur S dan P.Protein tersusun dari beberapa asam amino yang saling berikatan (mempunyai lebih dari 100 asam amino disebut protein) (Amin et al. 2014). Kebanyakan peptides dan protein yang diisolasi dari sel dan jaringan tersusun antara 2 hingga 2000 asam amino. Diasumsikan rata-rata bobot molekul dari semua amino adalah 110, bobot molekular kebanyakan peptide dan rantai protein berkisar dari 220 hingga 220.000, walaupun banyak yang lebih besar te lah ditemukan. Tidak peduli berapa banyak asam amino dihubungkan oleh ikatan peptide, selalu terdapat dua ujung rantai yang berbeda: suatu ujung amino terminal (atau N-terminus) dan suatu ujung karboksil terminal (atau Cterminus(Amin et al. 2014)). Denaturasi adalah rusaknya struktur protein tetapi tidak sampai merusak struktur
primer
(ikatan
peptida).
Setiap
perubahan
terhadap
struktur
sekunder/tertier protein.Molekul protein dapat pula mengendap yangdisebut dengan
peristiwa
koagulasi.Denaturasi
belum
tentu
mengakibatkan
koagulasi.Potein dapat saja mengendap, tetapi dapat kembali ke keadaan semula disebut denganflokulasi. Pada proses elektroforesis denaturasi diperlukan untuk memecah polimer menjadi monomer-monomer dalam bentuk pita-pita protein. Faktor-faktor yang mempengaruhi: 1. suhu yang tinggi 2. keasaman (perubahan pH yg ekstrim) 3. zat kimia tertentu (urea, deterjen) 4. karena pengaruh mekanik (guncangan)
5. penyinaran/ radiasi UV 6. konsentrasi ion hidrogen yg tinggi 7. garam-garam dari logam berat : Ag2+, Hg2+, Pb2+ 8. pelarut organik: aseton, alkohol (Amin et al. 2014) Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan sulfida. Adapun struktur protein meliputi struktur :
Gambar 1 . Struktur primer dari protein (Campbell et al., 2009).
Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai (Gambar 1). Struktur primer terbentuk melalui ikatan antara gugus α– amino dengan gugus α– karboksil (Gambar 3). Ikatan tersebut dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida. Struktur ini dapat menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida (Voet & Judith, 2009).
Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang linear distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di sepanjang tulang belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder adalah α-heliks dan β pleated.Struktur ini memiliki segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit atau terlipat secara berulang. (Campbell et al ., 2009).
Gambar 2. Struktur sekunder α-heliks (Murray et al , 2009).
Struktur α-heliks terbentuk antara masing-masing atom oksigen karbonil pada suatu ikatan peptida dengan hidrogen yang melekat ke gugus amida pada suatu ikatan peptida empat residu asam amino di sepanjang rantai polipeptida (Murray et al , 2009). Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino (Gambar 3). Struktur ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial antar struktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan hidrofobik. Dalam struktur ini, ikatan hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik akan berikatan di bagian dalam protein globuler yang tidak berikatan dengan air, sementara asam amino yang bersifat hodrofilik secara
umum akan berada di sisi permukaan luar yang berikatan dengan air di sekelilingnya (Murray et al , 2009).
Gambar 3. Bentuk struktur tersier dari protein denitrificans cytochrome C550
pada bakteri Paracoccus denitrificans (harvey, 2000).
Struktur kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau promoter protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks yang fungsional. ikatan yang berperan dalam struktur ini adalah ikatan nonkovalen, yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan hidrofobik. Protein dengan struktur kuarterner sering disebut juga dengan protein multimerik. Jika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik (Gambar 4) (Murray et al , 2009).
Gambar 4. Beberapa contoh bentuk struktur kuartener.
Protein adalah salah satu komponen penyusun sel yang berperan dalam membangun sel, menggantikan sel yang rusak, menjadi penyusun enzim, hormon, dan lain-lain. Berdasarkan komponen penyusunnya maka protein tersusun atas banyak asam amino hasil proses translasi yang dilakukan oleh sel. Oleh karena protein merupakan makromolekul yang ada di dalam sel dan memiliki gugus asam (COOH) dan dapat juga memiliki gugus basa (NH2), serta protein mudah rusak maka ekstraksi protein harus memperhatikan agar struktur protein tidak rusak (mengalami denaturasi) dengan cara melakukan proses isolasi pada suhu rendah (0-4ºC) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung pada jenis protein yang dianalisis) (Holil 2014). Langkah pertama dalam isolasi protein, atau biologis lainnya molekul, adalah untuk membuatnya menjadi solut. Dalam beberapa kasus, seperti protein serum darah, alam sudah dilakukan begitu. Namun, protein biasanya harus dibebaskan dari sel yang berisi itu. Metode pilihan untuk prosedur ini tergantung pada karakteristik mekanik dari jaringan sumber serta lokasi protein yang dibutuhkan di dalam sel (Voet, dan Voet, 2011). Proses isolasi protein secara umum sama dengan isolasi pada DNA maupun RNA yaitu terdiri dari beberapa tahap yang meliputi tahap memisahkan
sel dari jaringan, tahap menghancurkan membran/dinding sel, tahap memisahkan organel dari molekul penyusunnya serta tahap memisahkan protein dari molekul penyusun yang lain. Jika protein diisolasi dari darah maka dapat menggunakan jaringan, plasma atau serum yang ada dalam darah. Oleh karena itu darah terlebih dahulu harus dipisahkan dari sel darah melalui proses sentrifugasi (Holil 2014). Penghancuran se dapat dilakukan dengan cara kimiawi dan mekanik ,Ini mungkin termasuk beberapa siklus Pembekuan dan pencairan, penggilingan dengan pasir, alumina, atau manik-manik kaca, atau penggunaan blender berkecepatan tinggi (serupa ke alat dapur yang sudah dikenal), homogenizer (sebuah alat untuk menghancurkan jaringan antara piston yang erat dan lengan yang bisa digerakkan secara manual atau mekanis), a Pers Prancis (perangkat yang menggunting sel terbuka dengan menyemprotkan mereka pada tekanan tinggi melalui lubang kecil), atau sonikator (yang memecahkan sel terbuka melalui getaran ultrasonik. Begitu sel-sel telah terbuka, disentrifugasi untuk menghilangkan partikulat puing sel, sehingga meninggalkan protein yang diminati solusi supernatan Jika protein yang dibutuhkan adalah komponen rakitan subselular seperti membran atau mitokondria, cukup besar Pemurnian protein dapat dilakukan dengan pemisahan pertama rakitan subselular dari sisa materi seluler Hal ini biasanya dilakukan dengan diferensial sentrifugasi, Jika protein yang diminati terletak di sitosol sel, pembebasannya hanya membutuhkan pemecahan terbuka (lisis) sel(Voet, dan Voet, 2011). Dalam metode yang paling sederhana dan paling lembut untuk melakukannya, yang dikenal sebagai lisis osmotik, sel-sel ditangguhkan solusi hipotonik; yaitu solusi di mana total Konsentrasi molar zat terlarut kurang dari yang ada di dalam sel dalam keadaan fisiologis normalnya. Dibawah pengaruh Kekuatan osmotik, air berdifusi menjadi lebih terkonsentrasi larutan intraselular, sehingga menyebabkan sel membengkak dan ledakan. Metode ini bekerja dengan baik dengan sel hewan, namun dengan Sel yang memiliki dinding sel, seperti bakteri atau sel tumbuhan, memang begitu biasanya tidak efektif. Penggunaan enzim, seperti lisozim, yang secara kimia menurunkan dinding sel bakteri (Voet, dan Voet, 2011).
Begitu protein telah dikeluarkan dari lingkungan alami, itu menjadi terkena banyak agen yang bisa ireversibel merusaknya Pengaruh ini harus dikontrol dengan hati-hati pada semua tahap proses pemurnian atau hasil dari Protein yang dikehendaki bisa sangat berkurang atau bahkan dihilangkan. Integritas struktural banyak protein sensitif terhadapnya pH sebagai konsekuensi dari banyak kelompok asam basa. Untuk mencegah kerusakan bahan biologis karena variasi dalam pH, mereka secara rutin dilarutkan dalam larutan penyangga efektif dalam kisaran pH di mana bahan stabil. Protein mudah didenaturasi dengan suhu tinggi. Meskipun Stabilitas termal protein sangat bervariasi, banyak dari mereka perlahan denatur di atas 25 ° C. Oleh karena itu, pemurnian protein biasanya dilakukan pada suhu dekat 0 ° C. Namun, ada banyak protein yang dibutuhkan suhu yang lebih rendah, beberapa bahkan lebih rendah dari -100 ° C, untuk stabilitas Sebaliknya, beberapa protein labil tidak stabil di bawah suhu karakteristik (Voet, dan Voet, 2011). Sel
mengandung
protease
(enzim
yang
mengkatalisis
hidrolitik
pembelahan ikatan peptida) dan degradatif lainnya enzim yang, pada lisis sel, dibebaskan menjadi di larutan. Enzim degradasi sering dapat dianggap tidak aktif pada pH dan suhu itu tidak berbahaya bagi protein yang diminati. Kalau tidak, Enzim ini seringkali dapat dihambat secara khusus oleh agen kimia tanpa mempengaruhi protein yang diinginkan. Tentu saja, karena pemurnian protein berkembang, lebih banyak lagi dan lebih banyak enzim degradatif ini dieliminasi (Voet, dan Voet, 2011). Banyak protein didenaturasi dengan kontak dengan antarmuka air-air, dan, pada konsentrasi rendah, signifikan Fraksi protein yang ada mungkin hilang akibat adsorpsi permukaan. Oleh karena itu, larutan protein harus ditangani sedemikian rupa untuk meminimalkan buih dan harus dijaga tetap terkonsentrasi. Tentu saja ada faktor lain yang menjadi protein mungkin sensitif, termasuk oksidasi sistein residu untuk membentuk ikatan disulfida; kontaminan logam berat, yang mungkin secara ireversibel mengikat protein; dan konsentrasi garam dan polaritas larutan, yang harus disimpan dalam kisaran stabilitas protein. Akhirnya, Banyak mikroorganisme menganggap protein menjadi lezatLarutan
protein
harus
disimpan
dalam
kondisi
itu
menghambat
pertumbuhan
mikroorganisme [misalnya, di kulkas dan / atau dengan sejumlah kecil z at beracun yang terjadi tidak bereaksi dengan protein, seperti sodium azide (NaN3)] (Voet, dan Voet, 2011). Protein hasil isolasi dengan menggunakan buffer ekstrak dan reagen lain perlu diukur kadar protein yang terkandung di dalamnya. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kandungan protein yang terdapat dalam sampel yang diisolasi. Selain itu pengukuran dilakukan juga dengan tujuan untuk mengecek proses isolasi yang dilakukan apakah berhasil atau tidak. (Holil 2014)
Menghitung Berat Molekul Protein Hasil Elektroforesis SDS page
Protein adalah heterobiopolimer yang terdiri dari asam amino melalui ikatan peptida. Protein-protein ini dibedakan berdasarkan muatan elektronnya yang berikatan secara ionik atau kovalen. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan protein memiliki muatan listrik yang berbeda-beda. Selain itu, dapat juga dibedakan berdasarkan berat molekulnya (Seidman, danMoore. 2000) Pada teknik pemisahan protein dengan metode elektroforesis, protein serum dipisahkan berdasarkan muatan listriknya. Apabila larutan protein diletakkan dalam suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak bermuatan tidak akan bergerak (Seidman, danMoore. 2000). Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker, 2000).
SDS merupakan detergen anionic yang berfungsi mendenaturasikan protein, memberikan muatan negative pada protein dan molekul hidrofobik. Hal tersebut akan menyebabkan protein kehilangan struktur secondary, tertiary atau quaternary nya. Protein dengan SDS akan bermuatan negatif dan ketika dimasukkan ke dalam tempat elektrik, protein tersebut akan bermigrasi ke elektroda yang bermuatan positif dan terpisahkan berdasarkan ukuran.SDS-PAGE menggunakan gel berupa gel poliakrilamid yang bersifat neurotoksik. Gel poliakrilamid terbentk dari hasil polimerasi monomer akrilamid dan bisakrilamid. Polimerasi tersebut dapat diinisiasi oleh ammonium persulsat (APS) yang dapat membentuk radikal bebas (Seidman, dan Moore. 2000).
Gambar 1. Struktur Protein Setelah diberi SDS ( (Martin,1996)
Sistem buffer terdiri
dari continous
system dan discontinuous
system
.
Continous systemmenggunakan satu jenis gel yaitu menggunakan resolving gel , sementara discontinous system menggunakan dua jenis gel berupa resolving gel dan stacking gel. Stacking gel berfungsi untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Resolving gel berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul yang ada berdasarkan berat molekulnya (Voet dan Voet, 2011).
Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE terdiri dari commasie briliant blue staining dan silver
salt
staining . Commasie
briliant
blue straining adalah
pewarna tekstil trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS PAGE. Commasie briliant blue straining banyak beberapa kelebihan yaitu harga yang relatif murah, mengikat protein secara spesifik, bekerja cepat. Silver salt staining memiliki
kelebihan
yaitu
hasilnya
lebih
akurat
jika
dibandingkan coomassie blue staining. Kekurangan silver salt staining yaitu harga yang lebih mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama (Voet, D dan Voet, 2011).Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000). Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan
sampel,
sehingga
tidak
menghambat
pergerakan
sampel
yang
memungkinkan pemisahan protein secara sempurna. Selain itu, gel poliakrilamida ini mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi. Penggunaan SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol (Voet, D dan Voet, 2011). Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamida adalah akrilamida, bis
akrilamida,
ammonium
persulfate
dan
TEMED
(N,N,N’,N’
tetrametilendiamin). Akrilamida sebagai senyawa utama yang menyusun gel adalah merupakan senyawa karsinogenik. Ammonium persulfate berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang panjang. TEMED berfungsi
sebagai
katalisator
reaksi
polimerisasi
akrilamid
menjadi
gel
poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein. Bis‐akrilamida berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi ‐kisi bersama polimer akrilamida. Kisi‐kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul protein. Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai dengan berat molekul protein yang dipisahkan (Voet, D dan Voet, 2011).
. Semakin rendah berat molekul protein yang dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang digunakan agar kisi ‐kisi yang terbentuk semakin rapat. Dalam preparasi gel, konsentrasi gel yang akan dibuat disesuaikan dengan berat molekulnya semakin berat maka persenan gel yang dibuat semakin kecil. APS dan TEMED merupakan katalisator dan harus diberikan terakhir dalam pencampuran pada tahap preparasi gel. Konsentrasi katalis sangat penting. Anyaman gel yang tidak baik dapat diakibatkan konsentrasi katalis yang tidak akurat. Pemberian APS dan TEMED dilakukan ketika akan dimasukkan ke dalam loyang atau gel caster . PAda campuran stacking gel jangan dulu diberikan APS dan TEMED sebelum separating gel karena akan cepat mengeras atau sudah terlebih dahulu membentuk gel. Jika demikian, akan sulit untuk memasukkan campuran stacking gel tersebut ke dalam Loyang. Stacking gel dimasukkan apabila sisa separating gel pada baker glass sudah mulai membentuk gel. Itu tandanya campuran separating gel yang dimasukkan ke dalam loyang sudah mulai mengeras (Holil, 2014). Pada tahap preprasi sampel, campuran RSB atau b-mercaptoetanol digunakan untuk memotong ikatan disulfide agar mudah bermigrasi dan menunjukkan bentuk migrasi yang linier pada gel. Sedangkan pemanasan dilakukan dengan tujuan mengoptimalkan pengkatalisnya agar benar-benar linier. Pewarnaan bisa dilakukan dengan berbagai staining atau pewarnaan. Pewarna silverstain digunakan jika berat protein kurang dari 4 nanogram. Protein glikoprotein tidak bisa menggunakan pewarnaan kromasin. Pewarna yang digunakan untuk protein gikoprotein adalah PAS. Gel yang didalam chamber disiram dengan larutan biru kemudian diberi destaining . Destaining digunakan untuk memberikan latar putih agar kromasi yang diserap protein dapat terlihat. Ketika dialiri listrik, proteinnya luruh (Holil, 2014). Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada gel, akan terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker. Hal ini menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel yang digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat
yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006). Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004). Molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Bollag, 2009). Setelah dilakukan analiis kuantifitas protein didapatkan hasil kemurnian sebesar 1,26 mg/dl. Kemudian dilakukan elektroforesis pada sampel tersebut. Gel hasil elektroforesis yang telah di scan selanjutnya dihitung berat molekulnya dengan bantuan protein standart sebagai marker untuk menghitung Rf (ratardakan factor) dari masing-masing pita dengan rumus :
Rf:
ℎ
Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel (jaringan otot ikan ) dimana nilai Rf yakni sama dengan x, lalu nilai X yang didapatkan disubtitusikan kedalam persamaan yang telah didapatkan dari perhitungan yakni Y = - 1864 x + 2,258. Setelah nilai disubtitusikan maka akan didapatkan nilai y , yakni sama dengan log BM. Untuk mengetahui BM (berat molekul) maka nilai log BM di anti log.
H. SIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan : 1. Untuk mengisolasi protein terlebh dahulu dilakukan pelisisan membran dengan cara mekanik dan kimia, kemudian
di sentrifugasi
dan
ditambahkan etanol PA, kemudian disentrifugasi kembali dan diuapkan, setelah diuapkan ditambahkna Tris HCl , di homogenkan kemudian disimpan dalam kulkas dalam bentuk supernatan dalam tabung 2. SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein. Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel (jaringan otot ikan ) dimana nilai Rf yakni sama dengan x, lalu nilai X yang didapatkan disubtitusikan kedalam persamaan maka akan didapatkan nilai y , yakni sama dengan log BM. Untuk mengetahui molekul) maka nilai log BM di anti log
BM (berat
Daftar Rujukan
Amin, M., Lukiati, B., Maslikah, A., I., dan balqis. 2014. Bahan Ajar Biokimia. Malang : Universitas Negeri Malang (tidak diterbitkan) Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. 2009. Protein Methods. New York: A John Wiley and Sons Inc Campbell, Neil A., dkk2009. Biologi Edisi Kedelapan Jilid 1 . Jakarta: Erlangga Hames, B.D & Rickwood. 2004. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Compan Harvey, D..(2000). Modern Analytical Chemistry. McGraw-. Hill : New York. Holil, K. 2014. Petunjuk Praktikum Analisis Biologi Molekuler . Malang :UIN MALIKI Malang Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd. : Oxford Murray, R., K., Granner, D., K. Dan Rodwell, V., W. 2009. Biokimia Harper. Jakarta : EGC Seidman, L.A. & C.J. Moore. 2000. Basic laboratory for biotechnology: Textbook and laboratory reference. Prentice Hall, Inc. : New Jersey Suranto. 2006. Electrophoresis Studies of Ranunculus Triplodantus Population. Biodiversitas. 1(1) 1-7 Voet, D and Voet, J., G. 2011. Biochemistry 4 th. USA : JOHN WILEY & SONS , INC. Wilson K. 1994. Protein and enzyme techniques In Practical Biochemistry, (ed. Wilson K and Walker JM), Cambridge University Press. p.161 ‐226.
Lampiran
No
Nama bahan
Komposisi
Fungsi
1.
PBS tween
NaCl 8,74 gr
Sebagai ringer dan
Na2HPO4 1,7799 gr
pelisis
Aquades hingga 1000
sel
membran
ml HCl NaOH Tween 50 µl
2.
SDS
Memebrikan ikatan
negatif
pada
protein
sehingga membentuk linear 3.
Tris HCl
Sebagai
larutan
penyangga 4. Separating Gel
Acrilamid-bis 30%
Menghasilkan
Tris Cl 1,5 M pH 6,8
profil pita protein
dH2O
dengan
berat
SDS 10 %
molekul
6-200
Temed
kDa
Aquades APS 10% 5.
Stacking Gel
Tris Cl 1,5 pH 8,8
Mengelompokkan
Acrilamid-bis 30%
protein
dH2O
berat
SDS 10 %
yang berbeda
Temed Aquades
dengan molekul
APS 10% 6.
APS
Iniasiator akrilamida bereaksi
agar dengan
akrilamida lain
yang
membentuk
poliakrilamida 7.
Bis-akrilamida
Sebagai
cross
linking agen yang membentuk kisi
kisi-
bersama
polimer akrilamida 8.
Temed
Katalisator reaksi polimerisai akrilamid
mnjadi
apoliakrilamid 9.
Aquades
Melepas
gel
akrilamid 10.
Protein
standar
Mengidentifikasi
(marker)
berat molekul dari campuran polypeptida proteinyang digunakan memiiki
rentang
berat molekul 15 kDa-250 kDa 11.
Bromo Fenol Blue
Sebagai
pewarna
molekul protein 12.
RSB
-0,3 M Tris HCL pH 4,8
Membantu
-Gliserol 25 %
memecah
ikatan
-SDS 10 %
protein
-β Mercaptoetanol
13
Larutan destaining
-Asam asetat glasial
Sebagai
pelarut
- metanol absolut
pewarna
yang
-aquades
berlebihan
pada
larutan staining Larutan Staining
-
Metanol absolut
-
Asam
asetat warna pada pita-
glasial
pita protein
-
Memberikan
Comasi briliant Blue
Running Buffer
-
Aquades
-
Glisine 14,4 gr
Memberikan
-
Trise Base 3,03
untuk
-
SDS 1 gr
konduktivitas
-
Aquades
-
HCl
-
NaOh
ion
-
PMSF
-trise base 0,1211 gr
Protein agar tiidak
- EDTA 0,0074
terhidrolisis
- NaCl 0,8775
protease
oleh
-PMSF 0,009 -NP4O 0,125 -Deionazed
water
hingga 100 ml Air Deion
Pelarut
yang
mengandung ion EDTA
Sebagai penghancur
sel
dan mengikat ion magnesium
yang
diperlukan
oleh
sel untuk menjaga membran
sel
secara keseluruhan NaCl
Sebagai
bahan
penetral pada gula phospat Gliserol
Sebagai pemberat molekul protein
-β Mercaptoetanol
Sebagai pemotong ikatan protein
PBS
Sebgai ringer
Etanol absolut
Mengurangi kelauran
protein
dalam
buffer
untuk
proses
purifikasi protein
N O
NAMA
GAMBAR
FUNGSI -
1.
Heater and Stirer
Thermoly ne cimarec*2
Alat yang digunakan untuk mencampurkan larutan bahan dengan menggunakan magnetic stirer. - Fungsinya untuk memanaskan (boiling) air atau sampel dalam proses disosiasi protein dalam Reducing Sample Buffer.
-
2.
3.
Tip Mikropip et
Vortex Maxi Mix
II
-
-
Tip mikropipet EPENDORF bewarna putih bening yang dipasangkan pada mikropipet dengan kapasitas 0,5-10 µl, Tip mikropipet EPENDORF bewarna kuning yang dipasangkan pada mikropipet dengan kapasitas 10-100 µl,
Alat yang digunakan untuk menghomogenisasikan (mencampurkan) suatu larutan.
6.
SENTRI FUS DINGIN TIPE 18R
-
-
9.
Thermo Scientific Nanodro p 2000
-
-
12 .
Elektrofo resis Vertikal
-
-
13 .
Shaker Spring Shaking Plate MMSTRAY L
Fungsi untuk menjaga sampel tetap dingin selama sentrifugasi. Sentrifus ini berkecepatan tinggi, dengan kecepatan maksimum 18000 rpm, dengan kisaran temperatur −20 C- 40 C
Thermo Scientific ™ NanoDrop 2000 dan 2000c adalah spektrum spektrum penuh, spektrofotometer UV Vis yang digunakan untuk mengukur dan menilai kemurnian DNA, RNA, Protein dan banyak lagi. NanoDrop 2000 dan 2000c adalah satu-satunya spektrofotometer mikrovolume dengan teknologi retensi sampel yang dipatenkan yang mengukur volume sampel sekecil 0.5μL. Digunakanuntukmemisahkan pita pita protein berdasarkanberatmolekul (dalamsatuan Dalton/kDa) pada gel poliakrilamid. Elektroforesis vertikal yaitu Poliakrilamida (PAA), digunakan untuk analisis protein.
Digunakanuntukmencampurkanba handengankecepatandanwaktu yang dibutuhkan. - Dalamelektroforesis protein alatinidigunakandalampewarnaan gel poliakrilamiddalamlarutanpewarn acommasie brilliant blue. - Jenis shaker yang satu ini dilengkapi dengan sebuah papan meja horizontal sebagai alas untuk meletakan berbagai wadah berisi cairan yang akan dihomogenkan. Dengan permukaan yang datar,
