Laporan Praktikum Imunoserologi
Pemeriksaan Toxoplasma Gondii Disusun oleh kelompok 2B Rifa Aliyya Tira
P3.73.34.2.16.028
Siti rahmatul ru’iyah
P3.73.34.2.16.035 P3.73.34.2.16.035
Naafi Nabilah
P3.73.34.2.16.027
Saffira Amalia
P3.73.34.2.16.0
Siska indriyani
P3.73.34.2.16.0
Widya Puji Listiyani
P3.73.34.2.16.038
Yasyavia Hatifah Islami
P3.73.34.2.16.040
Dosen Pembimbing : 1. Retno Martina, S.Si, M.Biomed 2. Drs. Chairlan, M.Biomed
D-IV Analis Kesehatan POLTEKKES KEMENKES JAKARTA III
A. PENDAHULUAN
Toksoplasmosis merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh Toxoplasma gondii (T. gondii), yaitu suatu protozoa obligat intraseluler. Toxop lasmosis perlu mendapat perhatian, karena dapat menimbulkan masalah kesehatan pada individu yang imunokompromis dan wanita hamil (Frenkel, 1991; Despommier dkk., 1995). Pada wanita hamil, infeksi T. gondii dapat menimbulkan masalah yang cukup berat karena teknik ini tidak dapat diambil hanya dengan sekali pemeriksaan IgG tanpa adanya IgM positif, sehingga harus dilakukan pemeriksaan ulang untuk melihat ada tidaknya konversi IgG (Remington dan Desmonts, 1976). Untuk memastikan adanya infeksi akut harus didapatkan serokonversi titer IgG dari negatif menjadi positif pada dua kali pemeriksaan dengan interval 2-3 minggu, atau harus didapatkan kenaikan titer IgG yang bermakna (Gandahusada, 1995). Beberapa uji serologis untuk penetapan diagnosa toksoplasmosis, diantaranya adalah uji warna SabinFeldman, indirect immunofluorescent antibody test (IFAT), latex agglutination test (LAT), indirect hemagglutination (IHA), dan the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yang memiliki spesifisitas dan sensitivitas tinggi Beberapa teknik diagnosa serologis tersebut sangat bermanfaat, namun beberapa diantaranya memiliki kelemahan baik dari sensitivitas maupun akurasi, kesederhanaan dan kemudahan aplikasi terutama di lapang. atau IgG. Uji serologis yang banyak diaplikasikan di dunia maupun di Indonesia untuk diagnosa serologis pada manusia dan hewan adalah ELISA dan aglutinasi latek. ELISA merupakan uji serologi yang sensitif dan spesifik, membutuhkan sangat sedikit antigen, dapat menguji banyak sampel dengan mudah di laboratorium (CRUICKSHANK dan MACKENZIE, 1981). Namun demikian, ELISA membutuhkan keterampilan yang memadai, larutan dan peralatan khusus seperti ELISA reader, larutan dapar, membutuhkan waktu uji cukup lama (sekitar 4-5 jam) dan enzim yang digunakan memerlukan penanganan rantai dingin serta memiliki banyak tahapan yang berpotensi mengakibatkan kegagalan uji. Pada kondisi yang demikian, maka uji serologis yang multi aplikasi (dapat dilakukan di lapang dan laboratorium dengan mudah), tidak terlalu membutuhkan keterampilan dan peralatan serta memiliki akurasi yang setara dengan ELISA sangat diperlukan.
B. TUJUAN
Untuk mendeteksi adanya Immnoglobulin G (IgG) Toxoplasma Gondii pada serum manusia. C. METODE
Pemeriksaan Toxoplasma Gondii menggunakan metode kuantitatif (Elisa). D. PRINSIP
•
Sumur strip microtiter sebagai fase padat yang dilapisi dengan antigen Toxoplasma (TOXO-Ag) yang dibuat dari sonkasi seluruh parasit Toxoplasma gandii (Tachyzoites). Inkubasi pertama antibodi spesifik yang sesuai (TOXO-IgG-Ab) terdapat d alam spesimen pasien atau kontrol mengikat ke antigen pada fase padat. Pada akhir inkubasi komponen tak terikat dicuci. Inkubasi kedua, konjugat anti-IgG (anti-human IgG antobodies, peroxidase conjugated) ditambahkan yang mengikat secara khusus antibodi kelas IgG yang menghasilkan pembentukan immunocomplexes khas Absorbansi kontrol dan spesimen ditentukan dengan menggunakan pembaca ELISA microplate atau sistem ELISA otomatis (seperti HUMAN HUMAREADER atau garis ELISYS.
E. ALAT DAN BAHAN a. Reagen dan bahan yang di perlukan
1. Bahan
Serum Manusia
2. Kontrol Negatif TOXO IgG Kontrol Negatif (tutup hijau) Siap pakai, serum manusia Negative
kontrol
berfungsi
sebagai kontrol negative pada saat pembacaan hasil sampel.
3. CC
TOXO IgG Cut-Cff Control
(tutup putih) Siap untuk digunakan, manusia
4. PCL
TOXO IgG Kontrol Positif Low (tutup merah) Siap unuk digunakan, manusia
5. PCM
TOXO
IgG
Kontrol
Positif
Medium (tutup merah) Siap untuk digunakan, manusia
6. PCH
TOXO IgG Kontrol Positif High (tutup Merah) Siap untuk digunakan, manusia CC,
PCL,
PCM,
PCH:
Dikalibrasi terhadap 2 standar persiapan Internasional (WHO serum anti-Toxoplasma)
7. DIL G 5121 100 ml
Larutan Buffer IgG (tutup putih) Siap untuk digunakan, berwarna hijau Buffer Fosfat NaCl Albumin
8. CON
Anti-IgG Konjugat (tutup putih)
12 ml
Siap untuk digunakan, berwarna merah Anti-human
IgG
(kelinci),
konjugat-peroksidase
9. WS 50 ml
Larutan Pencuci (tutup putih) Konsentrasi dalam 100 ml Tris buffer NaCl
10. SUB 13 ml
Reagen Substrat (tutup hitam) Siap untuk digunakan, berwarna kebiruan 3,3’,
5,5’-tetramethylbenzidin
(TMB) Hidrogen peroksida
11. STOP 15 ml
Larutan Stop (tutup merah) Asam
sulfurik,
siap
untuk
digunakan Adhesive Strips
12. Konjugat
Konjugasi peroxidase percobaan),
horseradish anti-HBs berwarna
(kelinci merah,
siap pakai Konjugat
berfungsi
sebagai
antigen/antibodi yang berlabel enzim. ALAT
Fungsi
1. Mikropipet dan tips
Gambar
Mikropipet dan tips berfungsi untuk
memipet
larutan reagen.
sampel
dan
2. Mikrotiter
8- Mikrotiter strips yang dilapisi
wells
dengan
anti-Hbs
(mouse)
berfungsi sebagai tempat/ wadah reaksi sampel dan reagen.
F. PROSEDUR KERJA
a. Pengenceran Sampel 1. Di dalam tabung sampel diencerkan dengan Diluent-G dengan perbandingan 1 bagian serum : 100 bagian diluent. 2. Diencerkan 10 ul sampel dan 1000 ul DIL-G 3. Dihomogenisasi lalu ditutup menggunakan parafilm. b. Pembuatan larutan pencuci (wash solution) Larutan pencuci yang dibutuhkan setiap well sebanyak 350l , well yang digunakan sebanyak 8 well, dan pencucian dilakukan sebn yak 8 kali. Sehingga volume wash yang dibutuhkan sebanyak 22400 l. Dengan perhitungan sebagai berikut : 350l * 9 * 8 = 25.200 l. 1. Volume larutan pencuci digenapkan menjadi 30000l 2. Dibuat Larutan pencuci dengan perbandingan 1:20 dengan cara dipipet aquades sebanyak 22.000 l masukan ke wadah kemudian pipet reagen wash sebanyak 1.100 l lalu dihomogenkan.
c. Prosedur Mencuci Lepaskan strip perekat, keluarkan isinya kedalam larutan natrium hipoklorit 5% dan tambahkan
wash
ke setiap sumur, keluarkan isinya setelah 30 detik terendam.
Pencucian pertama dilakukan sebanyak 4 kali dan pencucian kedua sebanyak 5 kali. d. Prosedur Kerja 1. Siapkan alat dan bahan 2. Mengisi reagen dan sampel serum di setiap well pada mikrotiter sebanyak 100 ul menggunakan mikropipet. Pada well B & C 1 diisi reagen PCL Pada well C & D 1 diisi reagen PCM Pada well E-H diisi dengan sampel serum 3. Mikrotiter ditutup dengan strip addesive kemudian diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 17-25oC 4. Setelah 30 menit, reagen dan sampel pada mikrotiter dibuang ke dalam waste 5. Tambahkan larutan pencuci sebanyak 300 ul ke masing-masing well dari well BH. Tunggu 30 detik kemudian buang larutan, lakukan pencucian sebanyak 4 kali pada setiap well. 6. Tambahkan
100
l
konjugat
ke
setiap
well
(kecuali
well
A)
menggunakan mikropipet , homogenkan tiap-tiap sumur dengan hati-hati. Tutup mikrotiter dengan strip perekat. Inkubasi selama 30 menit pa da suhu 17-25oC. 7. Buang larutan yang ada di dalam well ke wadah waste, kemudian tambahkan larutan cuci sebanyak 300 l ke masing-masing well (kecuali well A). Tunggu 30 detik kemudian buang larutan, lakukan pencucian sebanyak 5 kali pada setiap well.
8. Tambahkan 100 l substrat ke tiap-tiap sumur. Homogenkan dengan mengetuk sisi mikrotiter. Inkubasi 1Q5 menit pada suhu 17-25C pada ruangan tidak terpapar cahaya.
9. Tambahkan larutan stop sebanyak 100 l ke masing-masing well. 10. Intensitas warna larutan dibaca dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 450 nm.
G. VALIDASI HASIL
MCC =
A450 (D1) A450 (E1) 2
Hasil tes dinyatakan valid dengan syarat sebagai berikut :
Blank Subsrat pada well A1 < 0,150
MNC ≤ MCC
MPCM ≥ 0,750
MPCM : MNC ≥ 5
H. HASIL PRAKTIKUM
1. Tanggal pemeriksaan sampel : 8 Mei 2018 2. Data yang didapatkan dari kelompok 2 Sumur
Hasil
A.Blanko
0,138
B. PCL
0,672
C. PCL
0,583
D. PCM
1,127
E. PCM
1,310
F. Sampel 1
1,668
G. Sampel 1
1,676
H. Sampel 3
1,636
Data yang didapat dari kelompok 1 Sumur
Hasil
A.Blanko
0,146
B. NC
0,183
C. NC
0,161
D. CC
0,386
E. CC
0,372
F. Sampel 1
2,097
G. Sampel 1
2,153
H. Sampel 1
2,016
Data Hasil Kelompok 3 Sumur
Hasil
A.Blanko
0,156
B. PCH
2,011
C. PCH
1,862
D. Sampel 1
1,343
E. Sampel 1
1,221
F. Sampel 2
1,639
G. Sampel 2
1,956
H. Sampel 3
0,850
HasilPerhitungan
MCC =
A450 (D1) A450 (E1) 2
1. Blanko 0,146 (valid) nilai blanko > 0.150 2. MCC = 3. MNC =
0,386+0,37 0,83+0,6
4. MPCM = 5. MPCL =
= 0,379 = 0,172
,7+,30 0,67+0,583
= 1,218.5
= 0,6275
Validasi
1. Nilai Blanko 0,138 valid memenuhi syarat <0.150 2. MNC < MCC 0.172 < 0,379 ( Hasil Valid) 3. MPCM ≥ 0.750 1.218,5 ≥ 0.750 ( Hasil Valid) 4. MPCM : MNC ≥ 5 1.218,5 : 0,172 > 5 7.0813 > 5 (Hasil Valid) Hasil pemeriksaan Toxoplasma Gondii dinyatakan valid karena memenuhi syarat. I. INTERPRETASI HASIL Metode kualitatif
A450 (Pasien) ≥ MCC + 15%
anti-TOXO-IgG-Ab-Positive
A450 (Pasien) < MCC – 15%
anti-TOXO-IgG-Ab-Negative
Sampel 1 dikerjakan secara triplo, didapatkan h asil
2,097 > 0,379 + 15% 2,097 > 0,529 = hasil dinyatakan positif terdapat antibodi TOXO IgG
2,153 > 0,379 + 15% 2,153 > 0,529 = Hasil dinyatakan positif terdapat antibodi TOXO IgG
2,016 > 0,379 + 15% 2,016 > 0,529 = Hasil dinyatakan positif terdapat antibodi TOXO IgG
J. DISKUSI
1. Kesalahan Pra Analitik
Identitas specimen tidak jelas
2. Kesalahan Analitik
Teknik pemipetan tidak sama karena setiap sumur dilakukan oleh orang yang berbeda sehingga volume pemipetan yang diambil berbeda
Tetesan serum dan tetesan reagen harus seimbang
Sampel antar sumur tercampur akibat penghomogenan yang terlalu kuat
Prosedur pencucian salah karena waktu inkubasi tidak tepat 30 detik.
3. Kesalahan Pasca Analtik
Tidak ada kesalahan
K. Kesimpulan Bedasarkan hasil pemeriksaan adanya antibodi TOXO IgG pada sampel serum yaitu dinyatakan positif mengandung TOXO IgG.
Bekasi, 8 Mei 2018
Pembimbing I
Pembimbing II
Retno Martini, S.Si., M.Biomed
Drs. Chairlan, M.Biomed
Mahasiswi
Kelompok 2
