LAPORAN PRAKTIKUM ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
ISOLASI DNA PLASMID BAKTERI DENGAN MINIPREP ALKALI LISIS
DOSEN PENGASUH : Dr. Ir. AGUSTIN KRISNA WARDANI, M.Si
Oleh : ERNAWATI NIM. 106100100111003
MAGISTER ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN PASCA SARJANA FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2011
1
BAB I PENDAHULUAN 1.1. DASAR TEORI Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Plasmid memiliki fungsi yang dapat dimanfaatkan keuntungannya, misalnya plasmid dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Salah satu usaha untuk mendapatkan keuntungan dari plasmid tersebut adalah dengan cara mengisolasi DNA plasmid. Terdapat beberapa cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi biasanya berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Menurut Anam (2009) dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi DNA, 3. Pengendapan DNA, dan satu tahap yaitu pelarutan DNA dalam air atau buffer. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol (Gaffar, 2007). DNA plasmid hanya berukuran 1.000-100.000 pasang basa. Plasmid membawa informasi genetik dan mengalami replikasi untuk menghasilkan plasmid yang identik dan diturunkan selama pembelahan sel (Gaffar, 2007).
2
Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah Bacillus subtilis. Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif yang berbentuk batang. Dinding sel bakteri gram positif membentuk struktur kaku di luar sel, karena dinding sel terdiri dari peptidoglikan, yang merupakan polimer dari gula dan asam amino. Peptidoglikan yang ditemukan pada bakteri dikenal sebagai murein dan unsur lain yaitu asam teichoic, asam lipoteichoic, dan protein. Dinding sel membentuk penghalang antara lingkungan dan sel bakteri (Anonim, 2011). Evaluasi hasil, kemurnian dan ukuran DNA dalam sebelum melanjutkan pekerjaan lebih jauh yang mahal dan memakan waktu yaitu dengan menghitung nilai A260 dan rasio A260/A280. Protein sebagai kontaminan dalam DNA juga akan menyerap sinar UV tetapi protein menyerap sinar UV yang menghasilkan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu, rasio A260/A280 dapat mengungkapkan adanya kontaminasi protein atau RNA. DNA murni memiliki rasio A260/A280 dari 1,8-2,0. Rasio yang lebih rendah menunjukkan adanya kontaminasi protein. Rasio yang lebih tinggi menunjukkan kontaminasi RNA. Elektroforesis
merupakan
salah
satu
cara
untuk
memvisualisasikan
keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan
3
kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam well, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol (Anam, 2009) 1.2. Tujuan Praktikum ini bertujuan :
Mahasiswa dapat mengisolasi DNA plasmid bakteri dengan metode
mini
preparation alkali lisis.
Mahasiswa dapat menganalisis kemurnian DNA dan kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer
Mahasiswa dapat membuat gel agarosa
Mahasiswa
dapat
mengetahui
cara
visualisasi
plasmid
dengan
metode
elektroforesis.
4
BAB II METODE 2.1. Alat Micropipet dan tip, tabung eppendorf, microsentrifuge, vortex, oven, neraca, erlenmeyer, microwave, cetakan, spektrofotometer 2.2. Bahan 2.2.1. Isolasi DNA Plasmid dengan M i n i p r e p Bakteri Bacillus subitis dalam media LB cair, Solution I (50 mM Glukose, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH8), Solution II (5 m NaO, 10% SDS, d H2O), Solution III (5 M potasium asetat, Glacial acetat acid, d H2O), Phenol saturated (phenol + TE buffer), Etanol absolut, Etanol 70%, TE buffer. 2.2.2. Pembuatan gel Agarosa 1 % TBE 50 ml, Tris borax EDTA, Bubuk agarosa 0,3 gram, Et Br 0,5 ul, dye loading 2.3. Cara Kerja 2.3.1. Isolasi DNA Plasmid dengan M i n i p r e p
Disiapkan kultur bakteri Bacillus subitis dalam media LB cair diinkubasikan pada suhu 37 derajat celsius sehari sebelumnya
Diambil 1 ml kultur dalam microtube (tabung eppendorf )
Disentrifugasi 1000 rpm, suhu 4 oC selama 10 menit
Dibuang supernatan, dan melarutkan pelet dengan ice cold Solution I 100
μl, divortex.
Ditambahkan fresh Solution II sebanyak 200 μl
Di bolak-balik e-tube tersebut 2- 5 kali, jangan divortex.
Diinkubasi selama 2-3 menit.
Diambahkan ice cold Solution III sebanyak 150 μl, ditutup rapat tabung eppendorf , divortex dalam posisi tepat selama beberapa detik.
Disimpan dalam es selama 3-5 menit, disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm, 4 oC selama 5 menit
Dipindahkan supernatan ke tabung eppendorf steril baru.
5
Ditambahkan 1 kali volume phenol, divortex selama 5 menit
Disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm, selama 5 menit pada suhu ruang
Dipindahkan supernatan ke tabung eppendorf steril baru.
Ditambahkan 2 kali volume EtOH Abs, dibolak-balik dengan cepat 2-3 kali
Disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm, 4 oC selama 5 menit
Dibuang supernatan dan diambil pelet
Ditambahkan EtOH 70% dingin sebanyak 500 μl, dicampur
Disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm, 4 oC selama 5 menit
Diulangi langkah ini selama 2 kali
Pelet dikeringkan dengan dianginkan selama 10 menit
Ditambahkan 20 μl TE buffer (pH 7,6)
Disimpan -20oC sampai akan digunakan
2.3.2. Analisis Konsentrasi DNA dan kemurnian DNA dengan Spektrofotometer Persiapan sampel
Diambil 998 μl TE buffer dan dimasukkan ke dalam microtube.
Ditambahkan 2 μl sampel (plasmid) ke dalam microtube.
Dihomogenkan dengan cara diambil dan dikeluarkan dengan pipet berulangulang sampai tercampur merata.
Pengukuran dengan Spektofotometer
Microtube kosong untuk blanko diisi sebanyak 1 ul.
Dimasukan blanko ke dalam kuvet.
Dimasukan kuvet pada tempat UV spektrofotometri.
Ditera pada panjang gelombang 260 nm sampai menunjukkan hasil absorbansi nol.
Dikeluarkan kuvet blanko
Dicuci kuvet dengan aquades sampai bersih dan dikeringkan dengan tisue.
Diambil dan dimasukan sampel ke dalam kuvet dan ditera absorbansinya (sampel plasmid dan genom diukur secara bergantian).
Diulang langkah 2-7 untuk pengukuran pada panjang gelombang 280 nm.
6
Konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang
260
nm.
Mendekti
kontaminan
DNA
dengan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm 2.3.3. Analisis DNA dengan Elektroforesis Pembuatan Gel Agarose 1% dan Analisis Electroforesis
Ditimbang bubuk agarosa sebanyak 0,3 gr dengan menggunakan alumunium
Dimasukkan ke dalam erlenmeyer ditambahkan TBE 30 ml dan dicampur
Ditutup dengan plastik wrap yang dilubangi supaya saat pemanasan, plastik tidak terlepas
Dipanaskan dalam microwave selama 2 menit sampai larut sempurna
Disiapkan baki gel agarosa, selotip dilekatkan di tiap ujung baki gel agarosa (dipastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki)
Dipasang sisir elektroforesis 17 di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki
Diperiksa suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 oC, ditambahkan 0,5 µl etidium bromid (digunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).
Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian dituangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, dibiarkan selam 30 menit hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
Diambil sisir dengan hati-hati, selotip dilepaskan dari ujung-ujung baki.
Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1 kali (dipastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).
Disiapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
Dimasukkan sampel DNA dan loading dye dengan perbandingan 1:3 ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
Dibuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
7
Menghubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, diubah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
Menyalakan sumber arus, mengatur volatase 100 V dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
Menjalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Mematikan sumber arus dan baki diangkat dari tangki elektroforesis.
Mengeluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (meletakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
Menyalakan UV transluminator, mengamati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
8
Diagram alir prosedur praktikum Isolasi DNA Plasmid dengan M i n i p r e p adalah sebagai berikut :
Pelet
Disuspensi kembali dengan 100 µl Ice-cold Solution I, Vortex.
Dicampur dengan sempurna.
Ditambahkan 200 µl fresh Solution II (tutup rapat tabung eppendorf).
Mix Solution in Tube
Dibolak-balik dengan cepat sebanyak 2x. Jangan divotex!
Diinkubasi pada suhu ruang selama 2-3 menit.
Ditambahkan 150 µl Ice-cold Solution III (tutup rapat tabung eppendorf), vorte dalam posisi yang tepat selama beberapa detik.
Disimpan dalam es selama 3-5 menit, disentrifuse pada 10000rpm, 5 o
menit, suhu 4 C.
Supernatan
Dipindahkan ke tabung eppendorf steril baru.
Ditambahkan 1x volume Phenol, vortex selama 5 menit.
Disentrifuse pada 10000rpm,5menit, suhu ruang 25 C (4 C).
o
o
Supernatan
Pelet
Pelet
Dipindahkan ke tabung eppendorf steril baru.
Ditambahkan 2x volume EtOH Abs, dibolak-balik dengan cepat 2-3 kali.
Disimpan dalam es/suhu 4 C Selma 3-5 menit.
Disentrifuse pada 10000rpm, 5 menit, 4 C.
o
o
Ditambah 500 µl EtOH 70% dingin, campur.
Disentrifuse pada 10000rpm, 5 menit, 4 C.
LANGKAH INI DIULANG 2X DGN EtOH 70% yang baru.
o
Dikeringkan dalam oven selama 10 menit.
Ditambah 50 µl TE Buffer (pH 7,6).
Disimpan pada suhu -20 C sampai akan digunakan.
O
DNA
9
BAB III HASIL PRAKTIKUM Tabel 1. Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA dan Kemurnian DNA
A pada λ260 A pada λ280 P1 P2 G1 G2
0,007 0,006 0,016 0,002
0,005 0,010 0,013 0,016
DNA μg/ml 24.050 4.000 2.725 3.000
Kemurnian 1.582 1,739 1,579 1,690
Perhitungan TE buffer = 998 µl, Sampel = 2 μl
⦋DNA⦌ = A260 nm x fp x 50 Fp = 500
Kemurnian DNA = Absorbansi λ260/ Absorbansi λ280 Tabel 2. Hasil analisis DNA dengan elektroforesis Sumur
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Sampel
CG
CP
P1
P1
P1
P1
P2
P2
P2
P2
G1
G1
G1
G1
G2
G2
G2
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
Keterangan: CG = kontrol genom, CP = Kontrol plasmid P1= plasmid 1, P2= plasmid 2, G1= genom 1, G2= genom 2, √ : mucul pita/band
Gambar 1. Hasil Elektrophoresis Isolasi Plasmid dan DNA genom pada 1% Agarose gel
10
BAB IV PEMBAHASAN
4.1. Isolasi DNA plasmid bakteri dengan metode m i n i p r e p alkali lisis Bacillus subtilis termasuk bakteri jenis bacillus. Bakteri ini termasuk bakteri gram positif yang umum ditemukan di tanah, selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan yang tipis, biasanya bentuk rantai atau terpisah. Bakteri ini merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45 °C – 55 °C dan mempunyai pertumbuhan suhu optimum pada suhu 60 °C – 80 °. B. subtilis terbukti dapat digunakan untuk manipulasi genetik, karena itu telah banyak diadopsi sebagai model organisme untuk penelitian laboratorium (Setiyono, 2011). Pada praktikum ini digunakan bakteri B. Subtilis untuk isolasi DNA genom bakteri (metode Bernstein) dan miniprep alkali lisis untuk isolasi DNA plasmid bakteri. Bakteri Bacillus subtilis dalam media LB telah dipersiapkan diambil dan disentrifugasi
untuk
mendapatkan
pelet
sel
yang
terpisah
dari
media
pertumbuhannya. Pelepasan plasmid dari sel dengan menambahkan Solution I, II dan III . Solution ini semuanya adalah lysis buffer. STE (Sodium Tris EDTA) pada Solution I berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Solution I,
maka tris-EDTA dapat mengikat Mg
2+
dan Ca2+
sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse,
sedangkan glukosa dari Solution I akan
mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik. Pemberian solution II yang terdiri dari NaOH dan SDS harus fresh. Solution II menggunakan NaOH sebagai alkali, yang berfungsi merusak membran sel. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut (DNA double strain menjadi single strain). Plasmid juga terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. Plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar. Pada pencampuran tidak boleh mem-vortex karena sel akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat). SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti) protein membran sehingga terpisah dari bilayer lipid. Membran sel telah lysis ditandai dengan adanya lendir.
11
Penambahan potasium asetat pada
Solution III akan menyebabkan
renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk menetralkan pH sehingga DNA plasmid tidak rusak. Sentrifuge dilakukan kembali untuk mengendapkan membran-membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening yang berisi DNA). Supernatan yang berisi DNA ditambahkan phenol saturated yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. DNA tidak larut dalam ethanol, maka dengan pemberian ethanol maka DNA akan mengalami presipitasi, yaitu pengendapan DNA. DNA dipisahkan dengan sentrifuge dan dicuci dengan ethanol 70%, dikeringanginkan ( dry up) dan pemberian TE buffer. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut. 4.2. Analisis kuantifikasi DNA dan kemurnian DNA dengan spektrofotometer Konsentrasi DNA dapat dianalisis dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260 nm yang menghasilkan Absorbansi maksimum, berdasarkan cincin aromatik struktur dasar DNA. Cara ini untuk memperkirakan dan menghitung konsentrasi DNA, selama DNA relatif bebas dari kontaminan yang dapat menyerap sinar UV. Protein, dan fenol tersisa dari prosedur isolasi, adalah kontaminan yang khas dapat menyebabkan konsentrasi DNA lebih besar dari yang seharusnya. Menurut Anonim b (2010), digunakan panjang gelombang yang 260 nm berdasarkan struktur cincin aromatik dari basa DNA, yang merupakan cara yang sesuai untuk memperkirakan konsentrasi DNA dan menghitungnya selama preparasi DNA relatif bebas dari kontaminan yang akan diserap oleh sinar UV. Sedangkan digunakan panjang gelombang 280 nm untuk mengetahui kontaminasi protein pada preparasi DNA akan diserap UV. Oleh karena itu panjang gelombang 260/280 dapat memperlihatkan adanya sejumlah besar kontaminasi protein. Pada praktikum ini diperoleh konsentrasi DNA plasmid kelompok 1 paling
besar yaitu 24.050 μg/ml, DNA plamsid kelompok 2 yaitu 4.000 μg/ml, konsentrasi genom kelompok 1 (G1) adalah 2.7 25 μg/ml dan G2 yaitu 3.000 μg/ml. Nilai kemurnian DNA baik untuk genom 1 dan 2 maupun plasmid 1 dan 2 adalah 1,582-
12
1,739, yang menandakan bahwa DNA yang diisolasi mengandung protein meskipun pada plasmid 2 nilainya mendekati kemurnian DNA yaitu 1,739 . DNA murni memiliki nilai 1,8-1,9 setelah dihitung. Jumlah di bawah 1,8 menandakan kontaminasi protein dan jumlah di atas 1,9 menandakan kontaminasi RNA (Anonima, 2010). Hasil perhitungan kemurnian ternyata dari semua sampel baik plasmid dan genom menunjukkan kemurnian < 1,8 yang berarti terkontaminasi protein atau fenol dari prosedur isolasi. 4.3. Analisis DNA dengan Elektroforesis Berdasarkan hasil pengamatan isolasi DNA plasmid, terdapat pendaran pitapita DNA yang jelas terbentuk pada elektroforesis, hal ini karena konsentrasi DNA relatif besar 2.125- 24.050 μg/ml. Gambar 1. menunjukkan pita plasmid P1 (sumur 3
– 6) dan P2 (sumur 7 - 10) bermigrasi lebih cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan DNA genom G1 (sumur 11- 14) dan G2 (sumur 15 - 17). Hal ini sesuai dengan pernyataan Anam (2009) dimana DNA plasmid berukuran 1 – 300 kb, sehingga dapat dibedakan dengan mudah dari DNA kromosom (genom) bakteri yang berukuran 3000 – 5000 kb. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Perbedaan jarak migrasi antara DNA plasmid dan genom juga akibat struktur tersier yang berbeda yaitu struktur DNA plasmid berbentuk supercoiled ( covalently closed circular/ccc) sedangkan struktur DNA genom linier. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA supercoiled lebih kompak dibandingkan dengan DNA dalam keadaan open sirkuler atau linier. Penambahan Ethidium Bromida yang digunakan untuk membuat pita DNA terlihat karena DNA adalah sesuatu yang tidak terlihat di dalam gel. Molekul Ethidium Bromida berinterkalasi di antara basa menyebabkan DNA berfluorosescens ketika gel dieluminasi dengan sinar ultraviolet setelah proses destaining ini dilakukan yaitu dengan membilas gel agarose dengan akuades. Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan Etidium bromida yang terperangkap di dalam gel sehingga ketika dieluminasi oleh sinar UV hanya pita DNA yang terlihat karena DNA berikatan dengan Etidium Bromida.
13
BAB V KESIMPULAN
Dari praktikum yang dilakukan, maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan mini preparation yaitu lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, presipitasi dan purifikasi.
Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan tahap lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, presipitasi dan purifikasi.
DNA plasmid dan genom diperoleh dengan kemurnian 1,579 sampai 1,739 kurang dari standar karena terkontaminasi protein.
Pita plasmid bermigrasi lebih cepat dan lebih jauh dibandingkan dengan DNA genom karena ukuran dan struktur tersier yang berbeda.
Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan praktikum
sangat menentukan
hasil kemurnian DNA plasmid dan DNA genom.
14
DAFTAR PUSTAKA
Anam, K., 2009, Laporan Praktikum Genetika Molekuler, Bioteknologi Sekolah Pasca Sarjana IPB, Bogor Anonima, 2010. Isolasi DNA. From http: biofin.wordpress.com/2011/03/17/isolasidna-genom-2/, 10 Mei 2011 Anonimb, 2010, Isolation and Purification of Total Genomic DNA from E. Coli . From bio.classes.ucsc.edu/bio105l/EXERCISES/DNA/genomic.pdf, 9 Mei 2011 Anonim, 2011, Bacillus Bacillus_subtilis
subtilis,
http://
microbewiki.kenyon.edu/index.php/
Faatih, M., 2009, Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom Isolation And Digestion Of Chromosomal DNA, Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10(1) : 61 – 67. Gaffar, S., 2007, Buku Ajar Bioteknologi Molekul, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Bandung. Pradhika, E. I., 2008, Isolasi Plasmid Metode Lisis Alkali, http://ekmonsaurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html. Setiyono, L., 2011. Bacillus subtilis dan Aplikasinya Dalam Industri. From http lutfiblurry.blogspot.com/.../bacillus-subtilis-dan-aplikasinya-dalam.html, 17 Mei 2011 Wardani, A. K., 2011, Teknik Analisa Molekuler, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang
15
LAMPIRAN Perhitungan Konsentrasi DNA Perhitungan TE buffer = 998 µl
Sampel
=
2 μl
⦋DNA⦌ = A260 nm x fp x 50 fp = 500
⦋DNA⦌P1 = 0,007 x 500 x 50 = 175 ⦋DNA⦌P2 = 0,006 x 500 x 50 = 150 ⦋DNA⦌G1 = 0,016 x 500 x 50 = 400 ⦋DNA⦌G1 = 0,002 x 500 x 50 = 50 Perhitungan Kemurnian DNA
Kemurnian DNA = λ260/ λ280 Kemurnian DNA P1 = 0,007/0,005 =1,4 Kemurnian DNA P2 = 0,006/0,010 =0,6 Kemurnian DNA G1 = 0,016/0,013 =1,23 Kemurnian DNA G2 = 0,002/0,016 =0,125
16
