LAPORAN PRAKTIKUM “ISOLASI DNA, PCR, DAN ELEKTROFORESIS GEL”
dibuat untuk memenuhi tugas praktikum Modul Cellular and Molecular Basis of Inheritance
Oleh: Kelompok 9
M. Ilyas Saputera
Mulia Sari
Azwar Lauzardi
Annisafitria
Ilham Murtala
Eka Rahma
Noor Shabrina
Abqariyatuzzahra M.
Reni Dwi Parihat
Novia Putri R.
Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2012
Kata Pengantar Segala puji dan syukur kami ucapkan kehadirat Allah Yang Maha Esa, yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya serta nikmat yang tiada hentinya kepada manusia. Terutama nikmat iman dan akal yang menjadikan manusia sebagai makhluk yang paling sempurna. Dengan nikmat akal tersebutlah kita dituntut untuk dapat memanfaatkannya dengan sebaik-baiknya tanpa menyimpang dari perintah-Nya. Salawat serta salam bagi makhluk mulia junjungan kita baginda Nabi Muhammad SAW, yang telah mengajarkan ilmu dari Allah kepada umat-umatnya. Ilmu tersebut tidak akan habis sekalipun air laut dijadikan tinta untuk menuliskan ilmunya itu. Dan manusia hanya diberi sedikit sekali. Alhamdulillah, kami dapat menyelesaikan laporan praktikum tentang isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis menggunakan gel agarosa. Semoga dengan tersusunnya makalah ini dapat menambah pengetahuan kita. ”Tiada gading yang tak retak” demikian pepatah mengatakan. Karena itu tiada menutup kemungkinan jika dalam penulisan makalah ini terdapat banyak kesalahan dan kekurangan. Untuk itu, segala kritik dan saran kami harapkan demi kesempurnaan makalah ini. Terima Kasih.
Ciputat, 18 Nopember 2012
Kelompok 9
Daftar Isi Kata Pengantar .......................................................................................................................ii Daftar Isi ................................................................................................................................ iii 1
Isolasi DNA 1.1 Tujuan Praktikum .............................................................................................. 1 1.2 Landasan Teori .................................................................................................. 1 1.3 Alat dan Bahan ..................................................................................................2 1.4 Cara kerja...........................................................................................................3 1.5 Hasil Percobaan ................................................................................................. 4 1.6 Analisis Hasil.....................................................................................................4
2
PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.1 Tujuan Praktikum .............................................................................................5 2.2 Landasan Teori .................................................................................................. 5 2.3 Alat dan Bahan ..................................................................................................6 2.4 Cara kerja...........................................................................................................7 2.5 Hasil Percobaan ................................................................................................. 8 2.6 Analisis Hasil.....................................................................................................5
3
Elektroferesis DNA 3.1 Tujuan Praktikum .............................................................................................. 8 3.2 Landasan Teori .................................................................................................. 8 3.3 Alat dan Bahan ..................................................................................................9 3.4 Cara kerja...........................................................................................................9 3.5 Hasil Percobaan ................................................................................................. 10 3.6 Analisis Hasil.....................................................................................................10
4
Kesimpulan...................................................................................................................... 10
Daftar Pustaka ........................................................................................................................12
1. Isolasi DNA 1.1 Tujuan Praktikum
Mengisolasi DNA dari darah Vena menggunakan kit Wizzard genomic DNA 1.2 Landasan Teori
Deoxyribosa acid merupakan salah satu dari dua asam asam nukelat yang memilikii berat molekul(BM) paling besar dari semua senyawa organik. Pada umumnya terletak pada inti sel (99%) dan pada dua organel sitoplasma(1%) yakni mitokondria dan plastida. DNA terdiri dari polimer polipeptida. 1 polipeptida terdiri dari 3 komponen(gugus) yakni: P(fosfat), S(sugar,gula deoxribosa), B(basa). Dalam suasana natural (alami) DNA berpasangan menurut ikatan hidrogen dari tiaptiap basanya. Kedua utas yang sepasang ini letaknya sejajar-berpiin namun berlawanan arah,sehingga disebut double helix yang anti perarel. 1molekul DNA= 1 gen yang umumnya mengatur akan penurunan sifat keturunan suatu individu DNA dapat mengatur kehidupan sel dan tubuh suatu makhluk hidup melalui dua tahapan yaitu: 1.
Replikasi (pengendapan) berguna untuk sintesis protein.
2.
Transkripsi (mencetak) berguna untuk pembelaan sel dan perbaikannya.
DNA bisa dipotong menggunakan enzim restriksi sehingga terpotong-potong menjadi fragmen-fregmen yang terdiri 4 sampai belasan basa (nukleotida). Sedangkan enzim yang digunakan untuk menyambung fragmen tersebut enzim ligase, baik dari DNA yang sama ataupun dari DNA yang berbeda. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga dapat diisolasi. Isolasi DNA merupakan salah satu langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. pada saat prosesnya, ada dua prinsip yang akan dilakukan yakni sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan pemisahan molekul suatu dna dari campuran yang terjadi berdasarkan beratnya. Molekul yang mempunyai berat yang ringan akan berada pada bagian atas tabung sedangkan pada bagian bawah tabung akan terlihat molekul yang berukuran besar. Pada saat sentrifugasi akan terdapat dua bagian yaitu supernatan dan pelet. Supernatan merupakan bagian atas hasil sentrifugasi sedangkan pelet merupakan bagian bawah dari sentrifugasi. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.
1.3 Alat dan Bahan
Alat: 1. Microfuge tube 1,5 ml 2. Micropipet 100-1000 uL, 10-100 uL 3. Tip Biru 4. Tip Kuning 5. Microsentrifugator
Bahan: 1. Wizzard genomic 2. Isopropanol 3. Alkohol 70% 4. Darah vena (Darah Azmi) 3 ml
Darah Vena
1.4 Cara Kerja
(Pemecahan Sel) 1. Masukkan larutan lisissel(Cel Lysis Solution) ke dalam tabung mikro 1,5 ml
2. Tambahkan 300 uL sampel darah azmi ke dalam tabung pertama, dan tabung dibolak balik untuk homogenisasi 3. Inkubasi selama 10 menit dalam suhu kamar, bolak-balik 2-3 kali selama inkubasi 4. Sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 5. Buang larutan(supernatan), sehingga yang ada tinggal pelet 6. Tambahkan 600 uL larutan lisis sel, kemudian sentrifuse selama 1 menit
(Pemisahan Inti) 7. Supernatan dibuang sampai bersih, kemudian pelet yang terbentuk(endapan berwarna putih) yang merupakan inti sel ditambahkan larutan pelisis inti(nuclei lysis solution) 8. Inkubasi larutan di waterbath pada suhu 37 selama 15 menit 9. Tambahkan 100 uL larutan pengendap protein(protein precipitation solution), bolak balik untuk homogenisasi 10. Sentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit 11. Pindahkan supernatan yang terbentuk ke dalam tabung kedua yang telah berisi isopropanol dingin 1 ml 12. Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus(DNA) 13. Simpan tabung di refrigerator dengan suhu -20 selama 1 jam atau overnight 14. Sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit 15. Buang supernatan, kemudian pelet ditambahkan 1 ml alkohol 70% dingin 16. Sentrifuse kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 17. Buang supernatan kemudian tabung yang berisi pelet(DNA) dikeringanginkan 18. Masukkan 100 uL DNA rehidration solution(melarutkan DNA), inkubasi pada suhu 65 selama 1 jam 19. DNA siap digunakan 20. Simpan DNA pada suhu -20
Hasil Sentrifugasi 1.5 Hasil Percobaan
Hasil DNA
1.6 Analisis Hasil
Teknik isolasi DNA merupakan teknik memisahkan komponen DNA dari komponenkomponen inti sel lainnya. Teknik ini diawali dengan pemisahan komponen sel
dari
komponen lainnya dengan teknik sentrifugasi. Penambahan CLS diperlukan untuk melisis sel agar dapat kita peroleh inti sel-nya. Melalui teknik sentrifugasi berikutnya diperoleh pellet yang merupakan inti sel. Penambahan NLS digunakan untuk melisis inti sel agar dapat memisahkan komponen- komponen inti sel. Melalui teknik sentrifugasi berikutnya diperoleh supernatant yang berupa DNA. 2. PCR ( Polymerase Chain Reaction)
2.1 Tujuan Praktikum
Mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen DNA hasil isolasi 2.2 Landasan Teori
Pengklonaan DNA dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan gen tertentu atau sekuense DNA lain dalam kuantitas besar. Akan tetapi ketika sumber Dna sedikit atau tidak murni, PCR atau reaksi berantai polymerase lebih cepat dan lebih selektif. Dalam teknik ini, segmen sasaran spesifik apapun didalam satu atau banyak molekul DNA dapat dengan cepat diamplifikasi dalam tabung reaksi. PCR (P olymerase C hain R eaction) dikembangkan oleh Kary Mullis pada 1980-an. PCR didasarkan pada menggunakan kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis untai baru DNA komplementer dengan untai cetakan yang ditawarkan. Rantai polimerase reaksi (PCR, Erlich, 1989) adalah sebuah teknikcanggih yangdengan cepat menjadi salah satu teknik paling banyak digunakan dalam biologi molekular karena cepat, murah dan sederhana. Teknik ini memperkuat fragmen DNA spesifik dari sejumlah bahan sumber DNA dalam hitungan menit, bahkan ketika bahwa DNA sumber kualitas relatif buruk. Dalam PCR hal- hal yangdibutuhkan antara lain: - Template DNA - DNA sampel yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu tinggi diterapkan pada molekul DNA beruntai ganda asli untuk memisahkan helai dari satu sama lain. - DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai baru DNA komplementer dengan urutan target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim Taq DNA polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang tinggi ketika
menyalin DNA. Meskipun enzim agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR: 1) mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan template DNA dan primer, dan 2) mereka tahan panas. - Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. ePolimerase mulai mensintesis DNA baru dari ujung primer. - Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoxynucleotide) - unit tunggal dari basis A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA baru.
Berikut ini proses yang terjadi pada saat PCR: 1.
Denaturasi:
fragmenDNAyangdipanaskanpada
suhu
tinggi,
yangmengurangihelixganda DNAkeuntaitunggal.Helai tersebut diakses menjadi helai primer. 2.
Annealing:
Campuran
daerahpelengkapdalam
reaksididinginkan.
Primeranilmenuju
untaianDNAtemplate,danhelai
ke
gandaterbentuklagi
antaraprimer danurutan komplementer. 3.
Perpanjangan: The polimerase DNA synthesises untai komplementer. Enzim membaca urutan untai berlawanan dan memperluas primer dengan menambahkan nukleotida dalam urutan di mana mereka dapat memasangkan. Seluruh proses ini berulang-ulang.
Enzim polimerase DNA, dikenal sebagai 'polimerase Taq'. Enzim tersebut dapat menahan suhu tinggi yang diperlukan untuk DNA-untai pemisahan, dan dapat dibiarkan dalam tabung reaksi. Siklus pemanasan dan pendinginan berulang-ulang, merangsang primer untuk mengikat ke urutan asli dan urutan yang baru disintesis. Enzim akan memperpanjang urutan primer. Karena jumlah DNA ditempatkan di tabung di awal sangat kecil, hampir semua DNA pada akhir siklus reaksi disalin urutannya. Produk reaksi dipisahkan dengan elektroforesis gel. Tergantung pada jumlah yang akan diproduksi dan ukuran fragmen diperkuat, produk reaksi dapat divisualisasikan secara langsung dengan pewarnaan dengan etidium bromida atau protokol perak-noda, atau dengan cara radioisotop dan autoradiografi. 2.3 Alat dan Bahan
Alat: 1. Mesin PCR
Bahan: 1. DNA template 2. Primer(sepasang) 3. dd H2O 4. dNTP(deoxynucleotide Tri Pospat)
5. Buffer 6. Larutan MgCl2 7. Enzim Taq Polymerase
2.4 Cara Kerja
1.
Membuat larutan Master Mix PCR(berisi buffer, larutan MgCl2, Primer(sepasang), dan dNTP+ Enzim Taq Polymerase) pada saat ditambahkan enim, tempatkan es di bawah tabung yang berisi larutan Mix PCR(bekerja dengan es)
2.
Setelah itu pipet larutan mix PCR ke dalam tabung reaksi PCR ke dalam tabung reaksi PCR/ tube PCR yang telah diberi label/ ditandai dengan pen marker, setelah itu baru dimasukkan sampel DNA yang telah diisolasi ke dalam masing tube PCR(camprkan larutan tersebut dengan baik menggunakan vortex)
3.
Kemudian memprogram mesin PCR dengan 35 siklus dengan tampilan 3 tahapan suhu
4.
Letakkan tabung reaksi PCT/ tube PCR dan jalankan sesuai program yang ada
5.
Setelah selesai reaksi PCR, ambil tabung reaksi dan DNA hasil amplifikasi siap dianalisis melalui gel elektroforesis
Mesin PCR 2.5 Hasil Percobaan
DNA yang telah diamplifikasi
2.6 Analisis Hasil
Dari hasil PCR yang melalui 3 tahapan penting yaitu denaturasi, annealing, dan extension, serta bantuan enzim Taq Polimerase, didapatkan perbanyakan segmen DNA yang n
spesifik dengan jumlah perbanyakan 2 , dimana n adalah jumlah siklus yang dilakukan. Jadi setelah dilakukan PCR dengan 35 siklus didapatkan perbanyakan segmen DNA dengan n
jumlah 2 .
3. Elektroforesis DNA 3.1 Tujuan Praktikum
Mengetahui DNA yang terbentuk dari hasil isolasi DNA dan hasil PCR 3.2 Landasan Teori
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA yang lebih kecil, akan lebih cepat keluar dari pada molekul DNA yang besar. Sehingga akhir dari proses elektroforesis ini akan didapatkan molekul DNA yang berurutan dari yang paling kecil sampai yang terbesar. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Ethidium Bromida merupakan bahan mutagenik dan karsinogenik. 3.3 Alat dan Bahan
Alat: 1. Satu set alat elektroforesis 2. Lampu UV
Bahan: 1. Larutan hasil isolasi DNA dan hasil PCR 2. Larutan TAE 1x(Tris base, glacial acetic dan EDTA) 3. Loading dye 4. Ethidium Bromida 5. Agarosa bubuk
Alat Elektroforesis 3.4 Cara kerja
1. Timbang larutan agarosa bubuk(1,5% gel agarosa dalam larutan TAE) 2. Masal larutan tersebut sampai mendidih 3. Biarkan larutan dingin sampai kira-kira 70 , kemudian masukkan 5 uL 0,1% etidium bromida 4. Tuang larutan agarosa ke dalam tray elektroforesis yang sudah dipasangin sisir 5. Biarkan agarosa dingin dan mengeras 6. Pasang tray ke dalam chamber elektroforesis, ambil sisir kemudian tuang larutan TAE 7. Masukkan loading dye (1uL) + DNA (5 uL) ke dalam sumur (yang terbentuk dari cetakan sisir) 8. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply, 90 volt selama 1 jam. 9. Amati pita-pita DNA yang terbentuk dengan menggunakan UV, kemudian foto dengan kamera polaroid
3.5 Hasil Percobaan
Hasil Elektroforesis gel dengan bantuan UV 3.6 Analisis Hasil
Dengan Proses elektroforesis pada dasarnya menghasilkan molekul-molekul DNA yang berurutan berdasarkan ukuran dan besarnya. Pengamatan akan hal tersebut dapat dilhat dari penggunaan marker DNA. Pada praktikum kali ini, tidak digunakan marker DNA sehingga tidak dapat diamati urutan molekul DNA berdasarkan ukuran dan besarnya, hanya dapat membuktikan adanya DNA yang terbentuk dari isolasi DNA dan PCR. 4. Kesimpulan
Setelah melakukan 3 tahapan yaitu isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis menggunakan gel agarosa, dan difoto dengan bantuan sinar UV, didapatkanlah gambar benda warna putih seperti kilat yang merupakan penampakan DNA yang berinterkasi dengan pewarna ethidium bromida. Pada percobaan ini juga didapatkan kilatan DNA yang hilang. Hal i ni disebabkan oleh oleh dua kemingkinan, yaitu kesalahan dalam proses isolasi DNA dan PCR, atau kesalahan dalam memasukkan DNA ke dalam sumur sehingga larut dalam larutan TAE ketika proses elektroforesis gel. Jadi dari percobaan yang melalui tiga tahapan diatas, didapatkan penampakan DNA. Namun, pada praktikum kali ini, tidak digunakan marker DNA sehingga tidak dapat diamati urutan molekul DNA berdasarkan ukuran dan besarnya, hanya dapat membuktikan adanya DNA yang terbentuk dari isolasi DNA dan PCR.
DAFTAR PUSTAKA
yatim wildan. kamus biologi. -ed2-. Jakarta.Yayasan Obor Indonesia. 2003
Campbell, Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorski, et al Biologi
Erlich, H.A. 1989. PCR teknologi: prinsip-prinsip dan aplikasi untuk amplifikasi DNA. StocktonPress, NY.
NCBI.
PCR.
[internet].
[dikutip
13/11/12].
Available
From:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml
http://www.scribd.com/doc/95728598/Laporan-Praktikum-Isolasi-Dna
http://www.iqbalali.com/2012/08/isolasi-dna-sederhana.html
https://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversityDocs/Training/molecular _markers_volume_1/english/MolMarkers%2520Vol1%2520III%2520PCR%2520basi cs.pdf
http://ebookbrowse.com/modul-praktikum-isolasi-dna-dan-elektroforesis-pdfd333543351
