2010
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Landasan Teori
DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyataka menyatakan n ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masingmasing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006).
Kelompok 2
1
2010
Fachiyah mempengaruhi
(2006)
pun
Elektroforesis
mengemukakan migration
rate
beberapa selama
faktor
DNA
yang
bergerak
menembus gel agarose, sebagai berikut: 1. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa. 2. Konsentrasi gel agarose Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan
T
adalah gel konsentrasi serta adalah
electrophoretic mobility DNA.
Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA No
Konsentrasi Gel
Effisiensi range Pemisahan
Agarose (%)
pada DNA linier (kb)
1
0.3
60-5
2
0.6
20-1
3
0.7
10-0.8
4
0.9
7-0.5
5
1.2
6-0.4
6
1.5
4-0.2
7
2.0
3-0.1
3. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circularopened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
Kelompok 2
2
2010
konsentrasi gel agarose kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan densitas kembaran superheliks pada bentuk I pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,
pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I konsentrasi EtBr kritis antara 0.1 g/ml-0.5l/mg
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarose bergerak 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga. 5. Komposisi basa DNA atau temperature Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30 C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar 6. Keberadaan pewarna DNA Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen , pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.
Kelompok 2
3
2010
7. Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal: Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling
rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi. Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA
dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.
1.2.
Latar Belakang
Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis. Elektroforesis
dilakukan
untuk
memisahkan,
mengidentifikasi,
mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya.
Kelompok 2
4
2010
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan peningkatan khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu Genetika, maka kami mengadakan praktikum isolasi hingga elektroforesis DNA. 1.3. Tujuan
Tujuan praktikum isolasi dan elektroforesis DNA ini diantaranya : 1. Melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman. 2. Mengetahui proses elektroforesis DNA. 3. Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA dan Elektroforesis DNA.
BAB II METODE KERJA
2.1. Alat dan Bahan
Kelompok 2
5
2010
A. Isolasi DNA Tanaman
Untuk melaksanakan isolasi DNA tanaman, diperlukan alat-alat seperti mikropipet berbagai ukuran, pipet berukuran, tabung 1,5 ml, tips mikropipet berbagai ukuran, saringan, gelas kimia, sendok, penangas, vortex, mini sentrifuga, dan blender/lumping. Sedangkan untuk bahanbahannya, diperlukan Buffer ekstraksi (100 mM Tris-HCl, pH 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl, CTAB 2%), Potasium asetat 5M, SDS 20%, Kloroform: Isoamil alcohol (24:1), Alkohol 100% (pa), TE (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA pH 8), Buah-buahan/sayuran (Bayam, Anggur Hitam), dan CTAB 2%.
B. Elektroforesis DNA
Untuk melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan alat-alat seperti Elektroforesisi unit (meliputi comb dan tray), Power supply, Mikropipet digital, dan Transilluminator UV. Sedangkan untuk bahanbahannya diperlukan Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Etidium Bromida, Loading Buffer, DNA Marker, dan Agarose.
2.2. Langkah Kerja A. Isolasi DNA Tanaman
Diambil daging buah yang sudah matang atau sayuran
Dihancurkan daging buah atau sayuran dengan menggunakan blender atau sendok yang ditekan – tekan diatas saringan
Ditampung daging buah dan sayuran yang telah halus Dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml daging buah atau sayuran yang telah halus sebanyak 0,1 ml atau 100 µl
Ditambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total Kelompok 2
Ditambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total Ditambahkan SDS 20% sebanyak 20 µl Ditambahkan SDS 20% sebanyak 20 µl Dih kan de lat sel 5 detik
6
2010
Dipindahkan fasa atas ke dalam tabung 1,5 ml yang baru, dan endapan dijaga sampai tidak terbawa
Ditambahkan klorofom 5 tetes : isoamol alcohol (24:1) sebanyak ½ x volume total sampel
Dihomogenkan sampel dengan cara membolak balik tabung sebanyak
Disentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit
Dipindahkan fasa atas ke dalam tabung baru
Ditambahkan alcohol sebanyak 100 % (-20 c) sebanyak minimal 2x volume total sampel Kelompok 2
7
2010
Disentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Alkohol dibuang dengan hati-hati, agar endapan DNA tidak terbuang
Sampel dicuci dengan alcohol 70 % 1 x, kemudian dikeringkan o sampel pada oven dengan suhu 50 C selama 10 menit
Dilarutkan endapan DNA dengan TE sebanyak 30 µl
o
Disimpan sampel pada suhu 4 C, dibiarkan minimal selama 24 jam agar DNA dapat terlatut dengan sempurna
DNA yang diperoleh akan dielektriforensis dan juga diamplifikasi dengan alat PCR
B. Elektroforensis DNA
Disiapkan tray / cetakan gel elektroforensis untuk membuat cetakan gel. Ditutup rapat sisi-sisi yang terbuka dengan menggunakan selotip.
Dibuat gel agarose dengan konsentrasi yang dikehendaki dalam buffer TAE 1 x. Kelompok 2
Didihkan campuran tersebut hingga campuran terlihat bening atau terpolarisasi.
8
2010
BAB III HASIL PENGAMATAN
3.1. Hasil Pengamatan Isolasi DNA
Kelompok 2
9
2010
Tabel 2. Pengamatan Urutan Poses Isolasi DNA
1
Isolasi DNA buah strawberry 0,1 mL
Warna larutan merah pekat (merah darah) Strawberry pekat larutannyah, belum terbentuk endapan, butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan.
2 Setelah diinkubasi dalam penangas air suhu 60 C selama 20 menit ˚
Warna larutan merah muda Belum terlihat adanya endapan, hanya butiran halus yang tersuspensi.
3 Setelah disimpan dalam wadah es selama 10 menit
Warna larutan >> merah pucat
Tidak ada endapan
4 Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit
Warna larutan pink pudar Terbentuk endapan
Kelompok 2
10
2010
5 Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit.
Warna larutan pink pudar
Warna larutan bening tidak ada endapan
dan
6 Setelah ditambahkan alkohol 00% sebanyak 2x volume total sampel.
Larutan bening
DNA
3.2. Hasil Pengamatan Elektroforesis DNA
Tabel 3. Pengamatan Urutan Poses Elektroforesis DNA No
Foto Hasil Pengamatan
Kelompok 2
Keterangan
11
2010
1 Sampel DNA ( telah dilarutkan dalan TE sebanyak 30 mikroliter ) yang telah
disimpan pada suhu 4˚C selama 24 jam dan siap di elekstroforesis.
Loading dye, Loading dye akan ditambahkan ke dalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye
Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel, alat siap dipasang dan disambungkan
ke
sumber
listrik
(
elektroforesis pada daya 100 volt selama 30 menit )
Fragmen DNA yg sempurna, karena
Kelompok 2
12
2010
tidak terurai
Fragmen DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna
Kontrol fragmen-fragmen DNA
BAB IV PEMBAHASAN
4.1. Pembahasan Isolasi DNA
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk melisiskan membran sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk
Kelompok 2
13
2010
melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah strawberry dapat diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Kemudian diinkubasi sehingga menghasilkan perubahan warna o
larutan. Penginkubasian sampel dalam waterbath bersuhu 65 C selama 20 menit ini dilakukan untuk mengoptimalikan kerja buffer ekstrak. Langkah selanjutnya adalah penambahan Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. Yang kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua fasa, yakni fasa atas dan endapan. Kemudian, setelah fasa atas di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain seperti polisakarida, yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai pendenaturasi protein,tetapi DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam pelarut organik seperti kloroform. Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitasi DNA setelah dilakukan sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol ini berfungsi sebagai penghilang kloroform. Sebab apabila kloroform masih berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzimenzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Dihasilkanlah larutan bening dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut merupakan DNA dari jaringan buah strawberry.
4.2. Pembahasan Elektroforesis DNA
Pada praktikum elektroforesis ini, sampel diambil dari sampel molekul DNA yang telah dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan telah disimpan pada suhu 4˚C selama 24 jam. Lalu penambahan Loading
Kelompok 2
14
2010
dye ke dalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan ( staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita ( band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker ) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding
Kelompok 2
15
2010
terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya.
BAB V PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan beberapa senyawa kimia tertentu. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya
Kelompok 2
16
2010
buffer ekstraksi yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, SDS 20% yang berfungsi untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein, Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel, Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang berfungsi untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan, Fenol yang berfungsi untuk mendapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan, Kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein kecuali DNA dan RNA, dan alkohol yang berfungsi sebagai penghilang kloroform. Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer, DNA Marker, dan Etidium Bromida yang akan mewarnai DNA.
5.2. Saran
Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.
JAWABAN PERTANYAAN
A. Pertanyaan tentang Isolasi DNA
1. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja nomer 5, 14, dan 18! Jawab :
Kelompok 2
17
2010
Pada tahapan kerja nomor 5, buffer ekstraksi yang ditambahkan adalah sebanyak: 400 µL
Pada tahapan kerja nomor 14, kloroform: isoamil alcohol (24:1) yang ditambahkan adalah sebanyak: 250µl dan 125 µl
Pada tahapan kerja nomor 18, alcohol yang ditambahkan adalah sebanyak: 1000 µl.
2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi DNA! Jawab :
Buffer ekstraksi : untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer.
SDS 20% : pelarut lipid dari membran sel, melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein.
Potassium asetat : berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-proteindebris sel.
Kloroform & Isoamil alcohol : mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom.
Alcohol : mempresipitasi asam nukleat.
B. Pertanyaan tentang Elektroforesis DNA
1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis Anda! Jawab :
Kelompok 2
18
2010
Pita DNA yg sempurna, karena tidak terurai Pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna Pita penanda (marker) DNA
2. Mengapa DNA Anda hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV? Jelaskan! Jawab :
Molekul DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar ultraviolet karena pada pewarnaan molekul DNA tersebut menggunakan zat pewarna etidium bromida dan etidium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet.
3. Apakah etidium bromida? Bagaimana cara kerja etium bromida dalam proses pewarnaan DNA? Jawab :
Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium juga biasa digunakan dalam biokimia untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah di pisahkan pada gel elektroforesis. Molekul etidium berpendar fluor ketika diiluminasi dengan cahaya ultraviolet (UV) pada kisaran visible UV. Etidium mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada untai ganda DNA. Struktur cincin etidium adalah hidrofobik dan mirip dengan struktur cincin pada DNA. Etidium dapat membentuk kontak van der Walls tertutup dengan pasangan basa dan hal ini merupakan jawaban bahwa mengapa etidium mengikat pada lokasi hidrofobik molekul DNA (Wicaksono, 2009).
Kelompok 2
19
