LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ISOLASI DNA”
Disusun Oleh :
Disusun Oleh : Nama
: Frelyta A. Z.
NIM
: 115040213111290
Kelompok
: Selasa, (06.00 WIB)
Asisten
: Dita Pahlevi
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu. Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu gugusan asam amino ( -NH2 ), dengan meninggalkan gugusan asam amino ( -NH ) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem cincin molekul yang berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu disebut pergeseran tautomer, dan struktur struktur molekul berbeda yang dihasilkannya disebut tautomer DNA adalah polimer bukleotida biasa bila dua nukleotida digabungkan,molekul resultannya disebut dinukleotida bila tiga menjadi trinukleotida bila beberapa membentuk polinukleotida. Hanya satu gugusan fosfat dari setiap trifosfat pelopor termasuk dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5’- karbon gula pentosa pada satu nukleotida, juga terikata secara kimiawi pada 3’karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5’-3’ pautan fosfat mengikat nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh panjangnya polimer. Ikatan ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. 1.2 Tujuan Untuk Mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR Untuk Mengetahui Uji Kualitas DNA
Untuk Mengetahui Komponen serta Tahapan-tahapan Isolasi DNA Untuk Mengetahui Manfaat dari Isolasi DNA dan PCR Untuk Memahami Tata Cara Pembuatan Isolasi DNA
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni dari makhluk hidup untukkeperluan bioteknologi. Secara spesifik untuk mengisolasi DNA yang mencangkup gen tertentu dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu: Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom menggunakan enzim endonuklease retriksi. Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen yang dimaksud kemudian dilanjut dengan membuat turunan (Complementery DNA/cDNA), Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik) dengan teknik sintesis kimiawi. Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain Reaction). (Yuwono, 2008) Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnose (Chawla,2000) Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya. (Adityawarman, 2010)
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro (Anonymous,a,2012) PCR (Polymeracse Chain Reaction) merupakan teknik untuk meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan menggunakan:
Enzim DNA polymerase dNTP (dinukleotida triphospat) oligonukeotida primer molekul DNA cetakan (DNA template)
(Yuwono, 2008)
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). (Mahmuddin, 2010) 2.2 Uji Kualitas DNA Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain : 1. Spektrofotometri Vis (Visible) Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible).
Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. (Fatimah) 2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible) Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. (Fatimah) 3. Elektroforesis Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat digunakan untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul bermuatan dalam medan listrik ke arah elektroda dengan muatan berlawanan atau teknik yang didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan dalam elektroforesis adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 basepairs dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesispoliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan
dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan 2 DNA (sekuensing). (Windiyastika) Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA diperlukan untuk mengetahui kemurnian dan jumlah konsentrasi DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA terbaik menunjukkan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi seperti kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada DNA/RNA yang diisolasi. Kuantitas DNA/RNA menunjukkan konsentrasi DNA/RNA. Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan cara : 1. Elektroforesis Elektoforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Ada dua jenis elektroforesis yaitu :
a. Elektroforesis kertas Elektoforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. [4] Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. [4] Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. b. Elektroforesis gel Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti proteinprotein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media (Anonymous,b,2012) 2. Spektrofotometer Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet(Harahap,2007)
2.3 Komponen dan Tahapan PCR a. Komponen PCR Penggunaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (template), molekul oligonukleotida untai tunggal ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai precursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzim polimerase, serta larutan penyangga berupa buffer. 1. DNA template adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genome, ada baiknya kalau DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim SalI atau NotI yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genome. 2. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (±
95°C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Ada beberapa catatan terkait dengan jumlah basa yang digunakan dalam urutan primer apabila PCR digunakan dalam analisis RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), ukuran primer tidak boleh lebih panjang dari 10 basa nukleotida. Dalam hal ini, kita memang tidak membutuhkan penempelan primer ke DNA target secara spesifik tetapi secara acak (random). Biasanya, konsentrasi primer yang dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1µM yang sudah cukup digunakan untuk sedikitnya 30 siklus. Primer yang diberikan dalam konsentrasi tinggi dapat menyebabkan penempelan pada sekuen DNA yang salah sehingga hasil PCR yang didapatkan tidak seperti yang diharapkan. Sebaliknya apabila primer berkonsentrasi rendah, proses PCR tidak dapat berjalan secara efisien, karena hasil amplifikasi yang diperoleh akan sangat sedikit. Penentuan konsentrasi primer secara tepat kadang-kadang harus melalui uji coba dengan menggunakan primer pada konsentrasi sangat rendah sampai konsentrasi sangat tinggi. 3. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri atas dua macam, yaitu enzim alami (native) yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis di dalam sel bakteri E. coli. Pada dasarnya tidak ada perbedaan di antara keduanya sehingga kita dapat menggunakan keduanya. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan tidak lebih dari 1 unit. Penggunaan 0,3 unit enzim masih memberikan hasil PCR yang berkualitas baik. Namun demikian, konsentrasi enzim yang berlebihan dapat menyebabkan amplifikasi DNA pada sekuen yang bukan target. 4. Deoxyribonucleoside Triphosphate (dNTPs) merupakan material utama yang dibutuhkan untuk
sintesis DNA baru dalam proses PCR. Konsentrasi yang dibutuhkan sebanyak 200µM untuk tiap dNTP yang terdiri atas dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Material ini tersedia dalam bentuk campuran keempat dNTP tersebut atau dalam bentuk terpisah satu sama lain. 5. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH 8,3 50 mM KCl dan 1,5mM MgCl2. Keberadaan ion Mg sangat penting dan perlu disesuaikan konsentrasinya apabila ada perubahan konsentrasi pada DNA target atau primer atau dNTP. b. Tahapan PCR Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi template, penempelan primer (annealing) dan polimerisasi primer yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95°C, 50°C dan 70°C. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA template terpisah satu sama lain karena terputusnya ikatan hidrogen antar basabasanya sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli primer. Jadi, ada dua buah primer yang masingmasing menempel pada untai tunggal DNA template. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Sepasang primer tersebut akan berhibridisasi menjadi sekuen komplementer pada untai tunggal DNA. Pasangan primer tersebut dipilih sedemikian rupa agar satu primer bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang diinginkan pada salah satu rantai. Sementara itu, primer kedua bersifat komplementer dengan ujung yang lainnya pada untai DNA yang satu lagi. Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan sekuen komplementernya sehingga terbentuklah molekul untai ganda yang stabil. Setelah menempel pada untai DNA template, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA template (ingat: polimerisasi DNA
selalu berjalan dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke ujung 5’ untai template nya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA template awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi template pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n-2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan ukuran target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).(Heldt,2005) Berikut susunan struktur kimia komponen penyusun DNA: Baik purin ataupun pirimidin yang berkaitan dengan deoksiribosa membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida atau deoksiribonukleosida yang merupakan prekursor elementer untuk sintesis DNA.Prekursor merupakan suatu unsur awal pembentukan senyawa deoksiribonukleosida yang berkaitan dengan gugus fosfat.DNA tersusun dari empat jenis monomer nukleotida. Keempat basa nitrogen nukleotida di dalam DNA tidak berjumlah sama rata.Akan tetapi, pada setiap molekul DNA, jumlah adenin (A) selalu sama dengan jumlah timin (T).Demikian pula jumlah guanin (G) dengan sitisin(C) selalu sama.Fenomena ini dinamakan ketentuan Chargaff.Adenin (A) selalu berpasangan dengan timin (T) dan membentuk dua ikatan hidrogen (A=T), sedagkan sitosin (C) selalu berpasangan dengan guanin (G) dan membentuk 3 ikatan hirogen (C = G). Stabilitas DNA heliks ganda ditentukan oleh susunan basa dan ikatan hidrogen yang terbentuk sepanjang rantai tersebut.karean perubahan jumlah hidrogen ini, tidak mengherankan bahwa ikatan C=G memerlikan tenaga yang lebih
besar untuk memisahkan. DNA merupakan makromolekul yang struktur primernya adalah polinukleotida rantai rangkap berpilin.Sturktur ini diibaratkan sebagai sebuah tangga.Anak tangganya adalah susunan basa nitrogen, dengan ikatan A-T dan G-C.Kedua “tulang punggung tangganya” adalah gula ribosa.Antara mononukleotida satu dengan yang lainnya berhubungan secara kimia melalui ikatan fosfodiester. (Anonimous, 2012) Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam
sel
organisme.
DNA
genom
meliputi
gen
danintergen(Campbell dkk.2004:221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7). Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari
dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220). Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219). 2.4 Manfaat PCR Manfaat dari PCR yaitu, keragaman genetik tanaman (kekerabatan), seleksi : 1. Isolasi Gen Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. 2. DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator,
dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. 3. Forensik Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. 4. Diagnosa Penyakit PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya(Clark,2008) PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan
(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat. (Mahmuddin,2010) 1. Untuk mengetahui keragaman genetik; Hal ini penting diketahui untuk proses persilangan, sehingga di dapat varietas unggul, jika keragaman tinggi maka kekerabatannya akan semakin tinggi, begitu pula sebaliknya. 2. Seleksi; Untuk memilih tanaman yang sifatnya sesuai dengan yang diinginkan. Mas (Marker Assisted Selection) : penanda pembantu seleksi. Keuntungan seleksi dengan PCR yaitu mampu menyeleksi dalam waktu cepat, tidak perlu menunggu hingga tanaman dewasa. 3. Uji kemurnian benih; Uji perlindungan varietas tanaman agar hak paten benih tidak dibajak oleh orang lain (Puspita, 2010).
BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan + Fungsi a. Alat Mikropipet :Untuk mengambil larutan bufer Oven :Untuk proses inkubasi Sentrifuge :Untuk memisahkan partikel ringan dan partikel padat berdasarkan berat molekul. Vortex :Untuk menghomogenkan larutan Pistil dan Mortar :digunakan untuk menghaluskan bahan Tabung eppendorf :untuk meletakan larutan bahan sebagai analisa DNA Lemari Es :Untuk meletakan alkohol Timbangan Analitik :Menimbang bahan Camera :Dokumentasi praktikum Alat Tulis :Mencatat hasil praktikum Spatula :Memasukkan bahan ke tabung eppendorf Tissue :Membersihkan alat
b.
Bahan Nitrogen cair Alkohol Isopropanol PVP Buffer CATB B-mercaptoetanol Chisam Buffer TE Wash buffer Kubis Rnase
: Melisiskan dinding sel : Sterilisasi alat : Membantu presipitasi DNA : menghilangkan fenol : menjaga agar DNA tidak rusak : menjaga agar DNA tidak rusak : Menghilangkan kontam protein : Untuk melarutkan DNA : Mencuci DNA : sebagai bahan untuk diamati DNA : Menjaga DNA agar tidak rusak
3.2 Langkah Kerja + Dokumentasi 3.2.1 Langkah Kerja (Diagram Alir)
Tambahkan 500 mikrolit chisam
Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit
Ambil supernatan (bagian atas pada bagian tabung eppendorf)
Tambahkan 500 mikrolit chisam
Sentrifuge 10.000 rpm kembali selama 10 menit
Isopropanol 0,45 x volume supernatan lalu inkubasi frezzer selama 30 menit
Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit
Berikan wash buffer 200 mikrolit sebanyak 2 kali lalu dikeringanginkan
Berikan buffer TE sebanyak 10-50 mikrolit (resuspensi DNA)
Tambahkan Rnase 1 mikrolit inkunasi pada suhu 370 C
Simpan
3.2.2 Dokumentasi
3.3 Analisa Perlakuan Dalam praktikum bioteknologi dengan materi Isolasi DNA ada beberapa langkah yang dilakukan . Langkah pertama yaitu timbang sampel 0,3 g kemudian tambahkan PEP(Polifinil pirolida) dimana senyawa ini merupakan agen pengikat polifenol. Kemudian tambahkan N2 cair yang berguna untuk proses lisis dinding sel . Haluskan jika sudah halus masukkan dalam tabung ependof. Tambahkan buffer CATB ( Cettil Trimettil Amonium Bromida) 1000 µl untuk menjaga DNA agar tidak rusak. Kemudian tambahkan ß-mercophoethanol untuk mengaktifkan kerja dari CTAB selain itu juga dapat menghilangkan kontam dari polisakarida . Lakukan vorteks yang berfungsi untuk menghomogenkan. Kemudian lakukan inkubasi dengan menggunakan waterbatt. Lalu tambahkan 500 ml chisam yang terbuat dari kloroform dan isoamil alcohol dengan pebandingan 4:1 . Kemudian sentrifuge 1000 rpm sehingga akan didapatkan supenatan(fase yang paling atas), DNA dan fase organik(pecahan organel sel). dan ambil supernatan. Tambahkan 500 ml chisam kemudian sentrifuge 1000 rpm Kemudian tambahkan iso propanol dingin 0,45 vol kemudian dilakukan intesifitasi dan lakukan inkubasi pada freezer 30˚. Sentrifuge 1000 rpm 1o menit dan akan didapatkan DNA,Debrish, dan Chisam. Wash buffer 200 ml selama 2 kali dan dikeringanginkan dan tambahkan buffer TE 10,50 ml untuk resuspensi DNA atau melarutkan DNA , Tambahkan R.Nase 1 ml dan lakukan inkubasi dengan suhu 37˚C selama 30 menit dan simpan. Namun untuk perlakuan ini kami tidak melakukan karena waktunya yang relatif panjang.
BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan Isolasi DNA merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu tanaman. Untuk langkah kerja nya terdiri dari beberpa langkah . Dalam praktium yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA murni yang digunakan sebagai bahan untuk bioteknologi memerlukan biaya yang sangat besar. Sehingga sangat tidak memungkinkan jika dilakukan praktikum untuk setiap mahasiswa langsung praktik mengisolasi secara sendiri-sendiri. Selain itu juga untuk menghindari kegagalan dalam isolasi agar tak mengakibatkan isolasi mubazir sehingga terjadi kerugian. Untuk itu dalam praktikum didampingi dengan asisten. Hasil praktikum isolasi DNA secara murni ini walaupun menghabiskan dana yang sangat besar namun didapatkan hasil yang sangat baik dalam pengisolasian DNAnya. Sehingga untuk peneliti dalam bidang bioteknologi tidak merasa dirugikan dengan hasil yang maksimal. 4.2 Saran Perlu adanya perlengkapan alat lagi atau fasilitas untuk praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan efektif Semangat terus !!!
DAFTAR PUSTAKA Aditya.2010. Definisi Isolasi DNA.http://sharkestaditya.blogspot.com/2010/03/isolasidna.html#!/2010/03/isolas i-dna.html. Fatimah, Nur. Tanpa Tahun. Uji Kuantitatif DNA. PBT ahli pertama. Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Mahmuddin, 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). http://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerasechain-reaction-pcr/. Diakses tanggal 30 November 2012. Puspita, 2010. Isolasi DNA. http:// puspitt.multiply.com/ journal/item/14/ISOLASI_DNA?&show_interstitial=1&u=%2 Fjournal%2Fitem. Windiastika, gati. Tanpa Tahun. Metode Uji Kualitatif DNA Dengan Elektroforesis Gel Agarosa. Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya. Surabaya Anonymous,a,2012.DefinisiPCR(http://arifin.blogspot.com/definisiP CR/09/10/2010) Diakses 29 November 2012 Anonymous,b,2012.UjiKualitasDNA(http://June’sblogspot.com/17/0 5/2008)Diakses 29 November 2012 Chawla,H.S.2003.Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science publisher.Inc Plymouth Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA : Spechtrophotometry, Degradation, and the “Frangekel” Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.
Harahap. 2007. spektrofotometer panjang gelombang 230. jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2006/v03n02/hayun0302.pdf. tanggal akses 26 Maret 2008.
LAMPIRAN Ini merupakan hasil pengujian kuantitas dari hasil
