Laporan Praktikum Biokimia Umum
Hari/tanggal Waktu P#P )*i*ten
: Senin/15 September2014 : 13.001!.00 W"B : S$ae%u&in' (Si : M. Maftuchin Sholeh +int$a ,ma Lin&a-ati W$ranti
Protein 2
elompok atima ara )nna* -i -i arm armaa-an an )lin&o + +ri*na (ukti ella$atri ella$atri (utta6ien
+34130013 +341 +341300 30025 25 +3413004 +3413010!
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULT FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU ILM U PENETA!UAN PEN ETA!UAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOOR BOOR 2"#$
Pen%ahuluan
(enurut Sumar&7o 82009 &alam bukun$a mengatakan' i*tila protein pertama kali &ikemukakan ole pakar kimia Belan&a' ; # (ul&er taun 1939' i*tila ini bera*al &ari baa*a
atau =$ang paling utama>. Protein memegang peranan *angat penting pa&a organi*me $aitu &alam *truktur' %ung*i' &an repro&uk*i. Protein merupakan *uatu komponen *eluler utama $ang men$u*un *ekitar *etenga &ari berat kering *el. Setiap *el mengan&ung ratu*an protein $ang berbe&abe&a &an *etiap 7eni* *el mengan&ung beberapa protein $ang ka* bagi *el ter*ebut. Sebagian be*ar protein &i*impan &i &alam 7aringan otot &an beberapa organ tubu lainn$a' *e&angkan *i*an$a ter&apat &i &alam &ara. Protein merupakan komponen terpenting atau komponen utama *el e-an &an *el manu*ia karena *el merupakan pen$u*un tubu manu*ia' maka protein $ang ter&apat &alam makanan ber%ung*i *ebagai ?at utama &alam pembentukan &an pertumbuan tubu. Selain itu' *truktur protein ti&ak *tabil karena mu&a mengalami &enatura*i $aitu kea&aan protein terurai men7a&i *truktur primern$a *erta ilangn$a *truktur *ekun&ern$a maupun ter*iern$a' baik reer*ibel maupun ireer*ibel. )&a berbagai @ara &alam pengu7ian tera&ap protein $aitu &engan reak*i u7i a*am amino &an reak*i u7i protein $aitu ber&a*arkan pa&a pengen&apan ole garam' pengen&apan ole logam &an alkool *erta u7i koagula*i &an &enatura*i protein 8Poe&7a$a&i 200!. )&a berbagai @ara &alam pengu7ian tera&ap protein $aitu &engan reak*i u7i a*am amino &an reak*i u7i protein. Aeak*i u7i a*am amino *en&iri ter&iri &ari ! ma@am u7i $aitu: u7i millon' u7i opkin* @ole' u7i belerang' u7i antroproteat' &an u7i biuret. Se&angkan untuk u7i protein' ber&a*arkan pa&a pengen&apan ole garam' pengen&apan ole logam &an alkool *erta u7i koagula*i maupun &enatura*i protein. elarutan protein akan berkurang bila ke &alam larutan protein &itambakan garamgaram anorganik' akibatn$a protein akan terpi*a *ebagai en&apan. Peri*ti-a pemi*aan protein ini &i*ebut salting out . Bila garam netral $ang &itambakan berkon*entra*i tinggi' maka protein akan mengen&ap. Pengen&apan teru* ter7a&i karena kemampuan ion garam untuk mengi&ra*i' *eingga ter7a&i kompeti*i antara garam anorganik &engan molekul protein untuk mengikat air. arena garam anorganik lebi menarik air maka 7umla air $ang ter*e&ia untuk molekul protein akan berkurang 8Winarno' 2002. Protein &apat &ien&apkan &engan penambaan alkool. Pelarut organik akan menguba 8mengurangi
kon*tanta &ielektrika &ari air' *eingga kelarutan protein berkurang' &an 7uga karena alkool akan berkompeti*i &engan protein tera&ap air 8Wiraa&iku*umma 195. Protein akan mengalami koagula*i apabila &ipana*kan pa&a *uu 50o+ atau lebi. oagula*i ini an$a ter7a&i bila larutan protein bera&a titik i*oli*trikn$a 8Poe&7ia&i' 1994. Pa&a pH i*oelektrik 8pH larutan tertentu bia*an$a berki*ar 4C4'5 &i mana protein mempun$ai muatan po*iti% &an negati% *ama' *eingga *aling menetralkan kelarutan protein *angat menurun maupun mengen&ap' &alam al ini pH i*oli*trik albumin a&ala 4'554'90. Pa&a temperatur &iata* !0o+ kelarutan protein akan berkurang 8koagula*i karena pa&a temperatur $ang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat *eingga ter7a&i getaran $ang @ukup kuat untuk meru*ak ikatan atau *truktur *ekun&er' ter*ier &an kuartener $ang men$ebabkan koagula*i 8;ebremi@ael et al. 2005. Pa&a u7i koagula*i' penambaan a*am a*etat bertu7uan agar larutan albumin men@apai pH i*oli*trikn$a *eingga bi*a terkoagula*i. Ha*il u7i kelarutan en&apan &engan air menun7ukkan a*il negati%. Setela en&apan &iu7i &engan pereak*i millon' -arna beruba men7a&i mera bata $ang artin$a ter7a&i reak*i po*iti%. Pengu7ian en&apan $ang &ia*ilkan &engan pereak*i milon bertu7uan untuk mengetaui a&a ti&akn$a kan&ungan tiro*in 8Poe&7a$a&i 200!. Praktikum ini bertu7uan mempela7ari beberapa reak*i u7i tera&ap protein &an mengetaui *i%at *erta *truktur protein melalui u7i C u7i kualitati%. METODE PRAKTIKUM
Praktikum ini &ilakukan &i Laboratorium Biokimia 1 epartemen Biokimia akulta* (atematika &an "lmu Pengetauan )lam "n*titut Pertanian Bogor. Waktu pelak*anaan $aitu pa&a ari Aabu' 30 September 2014 pukul 13.00 C 1!.00 W"B. )lat $ang &igunakan pa&a praktikum ini iala tabung reak*i' penanga* air' pipet tete*' gela* piala' pipet mor 10 ml' pipet mor 25 ml' batang penga&uk' lemari pen&ingin' ,rlenme$er 100 ml' ti**ue' kerta* *aring' pen7epit tabung reak*i. )&apun baan $ang &igunakan &alam praktikum ini iala larutan albumin' pereak*i (illon' pereak*i Biuret' larutan Hg+l2 2D' larutan )gEF3 5D' larutan Pb)*etat 5D' larutan protein 8EH 42SF4' a*am a*etat 1 (' H+l 0.1 (' EaFH 0.1 (' bu%%er a*etat pH 4.G' etanol 95D. Pen&en%a'an oleh lo&a(. Seban$ak 3ml albumin &ima*ukkan ke &alam tabung reak*i
lalu &itamba 5 tete* larutan Hg+l2 2D. Per@obaan $ang *ama &ilakukan &engan larutan Pb a*etat 5D &an )gEF3 5D.
Pen&en%a'an oleh &ara(. Seban$ak 10 ml larutan protein &i7enukan &engan
8EH42SF4 $ang &itambakan *e&ikit &emi *e&ikit. emu&ian larutan ter*ebut &ia&uk &an &i*aring. elarutan &iu7i &engan air' en&apan &iu7i &engan pereak*i (illon' &an %iltrat &iu7i &engan pereak*i Biuret. U)i *oa&ula+i. Seban$ak 2 tete* a*am a*etat 1 ( &itambakan ke &alam 2.5 ml larutan
protein. abung &iletakkan &alam air men&i&i *elama 5 menit. emu&ian &i*aring lalu en&apan &iambil &engan batang penga&uk. elarutan &iu7i &engan air &an en&apan &iu7i &engan pereka*i (illon Pen&en%a'an oleh al*ohol. Seban$ak 4 bua tabung reak*i &i*e&iakan &an ma*ing
ma*ing &ibuat @ampuran larutan' tabung ke 4 &igunakan *ebagai kontrol. abung 1 &ima*ukkan 2.5 ml larutan albumin' 0.5 ml H+l 0.1 (' 3 ml etanol 95D. abung 2 &ima*ukkan 2.5 ml larutan albumin' 0.5 ml EaFH 0.1 (' 3 ml etanol 95D. abung 3 &ima*ukkan 2.5 ml larutan albumin' 0.5 ml bu%%er a*etat pH 4.G' 3ml etanol 95D. abung 4 *ebagai kontrol' &ima*ukkan 2.5 ml larutan albumin &an 3.5 ml larutan etanol 95D. Denatura+i 'rotein. Seban$ak 3 tabung reak*i &i*e&iakan &an ma*ingma*ing &ibuat
@ampuran larutan. abung 1 &ima*ukkan 4.5 ml larutan albumin & an 0.5 ml H+l 0.1 (. abung 2 &ima*ukkan 4.5 ml larutan albumin &an 0.5 ml EaFH 0.1 (. abung 3 &ima*ukkan 4.5 ml larutan albumin &an 0.5 ml bu%%er a*etat pH 4.G. etiga tabung &itempatkan &i air men&i&i *elama 15 menit &an &i&inginkan pa&a temperatur kamar. abung 1 &an 2 &itambakan 5 ml bu%%er a*etat pH 4.G.
!ASIL DAN PEMBA!ASAN
Per@obaan reak*i u7i protein &ilakukan &engan beberapa u7i' &iantaran$a pengen&apan ole logam' pengen&apan ole garam' u7i koagula*i' pengen&apan ole alkool' &an u7i &enatura*i protein. abel 1 Pengen&apan ole logam Logam
Pengamatan
Hg Pb )g
eterangan : I J Se&ikit en&apan II J Ban$ak en&apan
;ambar
III J Sangat ban$ak en&apan Prin*ip u7i pengen&apan ole logam $aitu pembentukan *en$a-a tak larut antara protein &an logam berat berupa en&apan logam proteinat. "katan $ang terbentuk amat kuat &an akan memutu*kan 7embatan garam' *eingga protein mengalami &enatura*i. Se@ara ber*ama gugu* C +FFH &an gugu* CEH2 $ang ter&apat &alam protein &apat bereak*i &engan ion logam berat. "on ion $ang &apat membentuk en&apan logam proteinat antara lain )g' +a' n' Hg' e' +u' +o' (n' &an Pb. Selain gugu* C +FFH &an gugu* C EH2' gugu* C A pa&a molekul a*am amino tertentu &apat pula menga&akan reak*i &engan ion atau *en$a-a lain. ;ugu* *ul%ii&ril 8SH pa&a molekul *i*tein akan bereak*i &engan ion )gI atau HgII 8Poe&7ia&i 1994. (enurut Sumar&7o 8200!' pro&uk &enatura*i &i*ebut protein terkoagula*i $ang ti&ak larut &alam air tetapi larut &alam larutan ba*a kuat &an a*am mineral kuat karena teri&roli*i* men7a&i bagianbagian $ang lebi *e&erana. #umla en&apan $ang &ia*ilkan &ipengarui ole kereakti%an logam berat $ang &itambakan. Logam Hg lebi reakti% &aripa&a logam Pb karena merupakan logam tran*i*i pa&a *i*tem perio&ik. aktor lain $ang 7uga memengarui ban$akn$a en&apan a&ala kon*entra*i garamgaram anorganik $ang tinggi &alam larutan protein. Prin*ip per@obaan pengen&apan ole garam a&ala pembentukan *en$a-a tak larut' antara larutan protein &engan garam ammonium *ul%at 8Sumar&7o 199. Bia*an$a &alam air murni' protein *ukar larut. engan a&an$a penambaan garam' kelarutan protein akan meningkat. Hal ini &i*ebabkan ole ion anorganik $ang teri&ra*i *empurna akan mengikat permukaan protein &an men@ega penggabungan 8agrega*i molekul protein' pro*e* ini &i*ebut salting in. Pa&a kon*entra*i garam $ang tinggi' garam akan lebi @en&erung mengikat air &an men$ebabkan agrega*i *eingga molekul protein mengalami pre*ipita*i, peristiwa ini &i*ebut salting out . 8Leninger 192. Ber&a*arkan a*il per@obaan pengen&apan ole logam' en&apan proteinat ter7a&i karena albumin $ang terkoagula*i *etela &itambakan )gEF3' Hg+l' &an Pba*etat. Larutan )gEF3 menga*ilkan paling ban$ak en&apan *e&angkan larutan $ang paling *e&ikit menga*ilkan en&apan a&ala Pba*etat. Urutan ban$akn$a en&apan $ang terbentuk menurut a*il per@obaan a&ala )gEF3' kemu&ian Hg+l' &an $ang paling *e&ikit a&ala Pba*etat. (e*kipun kon*entra*i garam Hg+l lebi ke@il &iban&ingkan Pba*etat tetapi 7umla en&apan proteinat Hg+l lebi ban$ak &iban&ing Pba*etat karena pengaru perbe&aan kereakti%an &ari logam ter*ebut. abel 2 Pengen&apan protein ole garam
Logam
Pengamatan
;ambar
Penambaan 8EH42SF4 elarutan &alam air U7i (ilon U7i Biuret
eterangan : I J )&a en&apan J i&ak a&a en&apan elarutan protein akan berkurang bila ke&alam larutan protein &itambakan garamgaram anorganik. Pengen&apan teru* ter7a&i karena kemampuan ion garam untuk mengi&ra*i' *eingga ter7a&i kompeti*i antara garam anorganik &engan molekul protein u ntuk mengikat air. arena garam anorganik lebi menarik air maka 7umla air $an g ter*e&ia untuk molekul protein akan berkurang 8Siman7untak &an Silalai 2003. er&apat en&apan puti &ilapi*an ba-a larutan protein 8albumin' en&apan puti itu a&ala en&apan garam $ang ti&ak larut akibat &itambakan &engan ammonium *ul%at' peri*ti-a pemi*aan protein ini &i*ebut salting out . Hal ini ter7a&i karena ammonium *ul%at memiliki tingkat kelarutan $ang lebi tinggi &aripa&a protein. Seingga pa&a *aat penambaan ammonium *ul%at' garam ter*ebut akan melarut &alam air atau pelarutn$a &an akan men&e*ak protein keluar kembali &alam bentuk *oli&n$a' *eingga terbentukla protein $ang teren&apkan. ,n&apan puti ter*ebut &i*aring menggunakan kerta* *aring' lalu ma*ingma*ing a*il *aring &an %iltrat &ari protein ter*ebut &ilarutkan menggunakan air' kemu&ian &iu7i menggunakan pereak*i (illon &an Biuret. ,n&apan garam larut &alam air karena *i%at garam $ang i&ro%obik' 7a&i *aat garam &ilarutkan pa&a air' garam akan men$erap air *eingga garam mu&a larut &alam air. Bila garam $ang &itambakan berkon*entra*i tinggi' maka protein akan mengen&ap. Pengen&apan teru* ter7a&i karena kemampuan ion garam untuk men&ei&ra*i' *eingga ter7a&i kompeti*i antara garam anorganik &engan molekul protein untuk mengikat air. ;aram anorganik lebi kuat menarik air *eingga 7umla air $ang ter*e&ia untuk melekul protein akan berkurang 8Winarno 2002.
Pengen&apan protein &engan ammonium *ul%at a&ala @ara $ang paling ban$ak &igunakan. Hal ini &i*ebabkan karena ammonium *ul%at mu&a &i&apatkan' argan$a relati% mura' ber*i%at men*tabilkan en?im *erta &apat men@ega aktiita* en?im proteolitik. ;aram ammonium *ul%at kon*entra*i 23 ( &apat men*tabilkan en?im *elama beberapa taun.
elemaann$a a&ala ti&ak &apat mengen&apkan *eluru protein $ang tela larut &an bila mengan&ung logam maka akan &apat meru*ak en?im 8S@ope* 1994.
abel 3 oagula*i protein Logam
Pengamatan
;ambar
(illon Biuret
eterangan : I J )&a en&apan
-
J i&ak a&a en&apan
oagula*i merupakan penurunan &a$a larut molekulmolekul protein atau perubaan bentuk &an @airan 8*ol men7a&i bentuk pa&at atau *emi pa&at 8gel. Protein akan mengalami koagula*i apabila &ipana*kan pa&a *uu 50o atau lebi. oagula*i an$a ter7a&i 7ika protein bera&a pa&a titik i*oli*trikn$a. itik i*oli*trik a&ala *uatu ke&aan &imana ion negati% &an ion po*iti% $ang a&a pa&a *uatu molekul 7umlan$a *ama &an &an mengin&ika*ikan kenetralan &an pH protein mengen&ap. itik i*oli*trik bera&a pa&a pH 4'G 8Poe&7ia&7i 1994. Ha*il praktikum $ang &i&apatkan iala *emua larutan mengen&ap *etela &itamba a*am a*etat. Penambaan a*am a*etat &alam albumin bila &ireak*ikan &engan pereak*i millon memberikan a*il po*iti% begitu 7uga bila %iltrat &ien&apkan &engan biuret. Ha*ill ini membuktikan ba-a en&apan ma*i ber*i%at protein an$a *a7a tela ter7a&i perubaan *truktur ter*ier ataupun k-artener' *eingga protein ter*ebut mengen&ap. Perubaan *truktur ter*ier albumin ini ti&ak &apat &i uba kembali ke bentuk *emula. Per@obaan ini bera*il karena protein ti&ak ter&apat &alam %iltrat.
abel 4 Pengen&apan ole alkool Logam 1 2 3
Pengamatan
;ambar
4
eterangan : I J Se&ikit en&apan I IJ Ban$ak en&apan III J Sangat ban$ak en&apan U7i pengen&apan alkool pa&a reak*i &iata* untuk mengetaui pengaru alkool tera&ap larutan protein. )lkool ber%ung*i untuk menurunkan kon*tanta &ielektrik pa&a larutan *eingga ga$a tarikmenarik antar molekul 7a&i *emakin kuat' alkool 7uga akan mengkon&i*ikan gugu* po*iti% pa&a a*am amino untuk bereak*i &engan gugu* negati% $ang a&a &alam larutan' *eingga pa&a *ua*ana tertentu mampu membentuk en&apan. )lbumin &engan penambaan larutan pen$angga 8bu%%er pH 4'G paling ban$ak menga*ilkan en&apan' al ini ter7a&i &ikarenakan pH $ang &imiliki merupakan titik i*oelektrik protein *eingga en&apan $ang terbentuk merupakan 7umla $ang paling mak*imal. )lbumin &engan penambaan EaFH ti&ak menga*ilkan en&apan. Bu%%er a*etat pH 4'G ber%ung*i untuk mengen&apkan protein' karena protein mempun$ai &a$a kelarutan mKnimum pa&a titik i*oli*trikn$a 8Poe&7ia&7i 1994. abel 5 enatura*i protein Logam
Pengamatan
;ambar
1 2 3
eterangan : I J Se&ikit en&apan I IJ Ban$ak en&apan III J Sangat ban$ak en&apan Ha*il $ang &i&apatkan &ari u7i &enatura*i pa&a *eluru tabung *ebelum pemana*an a&ala belum menun7ukkan a&an$a en&apan karena protein belum ter&enaruta*i. Setela pemana*an' tabung 1 8pelarutan ole H+l &an tabung 2 8pelarutan ole EaFH menun7ukkan a*il negati% menan&akan ti&ak terbentukn$a en&apan. abung 3' protein $ang &ilarutkan bu%%er a*etat' menun7ukkan a&an$a en&apan $ang @ukup ban$ak. Bu%%er a*etat menga*ilkan en&apan karena memiliki pH $ang *ama &engan pH albumin $aitu 4.G4.9. Hal ini membuktikan ba-a protein albumin mengen&ap pa&a titik i*oli*trikn$a $aitu *ekitar pH 4.G. Setiap protein mempun$ai i*oli*trik $ang berbe&abe&a' titik i*oli*trik protein mempun$ai arti penting karena pa&a umumn$a *i%at %i*ika &an kimia erat ubungann$a &engan pH i*oli*trik. (enurut teori $ang a&a
pH &iata* titik i*oli*trik maka protein bermuatan negati% *e&angkan &iba-a titik i*oli*trik proteinn$a bermuatan po*iti%. enatura*i protein a&ala pro*e* perubaan *truktur lengkap &an karakteri*tik bentuk protein akibat &ari gangguan interak*i *ekun&er' ter*ier' &an kuartener *truktural' *eperti *uu' penambaan garam' en?im &an lain C lain. arena %ung*i biokimia protein tergantung pa&a tiga &imen*i bentukn$a atau *u*unan *en$a-a $ang ter&apat pa&a a*am amino. Ha*il &enatura*i a&ala ilangn$a aktiita* biokimia $ang ter7a&i &i &alam *en$a-a protein itu *en&iri. enatura*i protein 7uga ti&ak mempengarui kan&ungan *truktur utama protein $aitu' +' H' F' &an E 8Poe&7ia&7i 1994. oagula*i merupakan pro*e* lan7utan $ang ter7a&i ketika molekul protein $ang &i &enatura*i membentuk *uatu ma**a $ang *oli&. oagula*i ter7a&i *elama rentang -aktu temperatur $ang lama &an &ipengarui ole' pana*' pengo@okan' pH' &an 7uga menggunakan gula &an garam. Ha*il &ari pro*e* koagula*i protein bia*an$a mampu membentuk karakteri*tik $ang &iinginkan. Aenatura*i merupakan pro*e* pembentukan kembali *truktur untai gan&a &ari kea&aan ter&enatura*i. Pro*e* ini &apat ter7a&i *e@ara inio maupun initro. Aenatura*i in itro a&ala *uatu %enomena untuk anali*i* molekuler' mi*aln$a' untuk mengetaui ke*amaan atau ke&ekatan geneti* antara *uatu organi*me &engan organi*me lain 8Poe&7ia&7i 1994.
SIMPULAN Aeak*i u7i protein &ilakukan &engan beberapa per@obaan $aitu pengen&apan ole logam' pengen&apan ole garam' u7i koagula*i' pengen&apan ole alkool &an u7i &enatura*i protein. Prin*ipn$a *eluru per@obaan menun7ukan %aktor ter7a&in$a pengen&apan atau &enatura*i protein' namun &engan perlakuan $ang berbe&abe&a. Pengen&apan ole logam menun7ukan ter7a&in$a pembentukan *en$a-a
tak larut antara protein &an logam berat berupa en&apan logam proteinat &engan ikatan $ang @ukup kuat &an akan memutu*kan 7embatan garam' *eingga protein mengalami &enatura*i. Pengen&apan ole garam a&ala pembentukan *en$a-a tak larut antara larutan protein &engan garam ammonium *ul%at. Pengen&apan ole alkool menun7ukan a&an$a pembentukan *en$a-a
tak larut antara protein &an alkool. U7i koagula*i menun7ukkan perubaan bentuk $ang irreversible &ari protein akibat pengaru pemana*an. Per@obaan $ang terakir a&ala &enatura*i protein $ang &itun7ukkan &engan a&an$a en&apan pa&a larutan *etela pemana*an. Protein $ang ter&enatura*i akan berkurang kelarutann$a &an akan ter7a&i bila protein men&ekati pH i*oelektrik atau i*oli*trik. Setiap protein mempun$ai i*oli*trik $ang berbe&abe&a' titik i*oli*trik protein mempun$ai arti penting karena pa&a umumn$a *i%at %i*ika &an kimia erat ubungann$a &engan pH i*oli*trik.
DAFTAR PUSTAKA
,nglan&' #erem$ L an& ;ila& Haran. 2011. Aole o% *olation e%%e@t* in protein &enaturation: %rom termo&$nami@* to *ingle mole@ule an& ba@k. onlineM. )ailable: ttp://[email protected].go/pm@/arti@le*/P(+3211090/ 25 (aret 2014M. ;ebremi@ael ' ;unaratna ' Henrik**on H' Brumer H' alammar ;. 2005. ) *imple puri%i@ation an& a@tiit$ a**a$ o% te @oagulant protein %rom Moringa oleifera *ee&. onlineM. )ailable: ttp://[email protected].go/pubme&/15921G19 10 Fktober 2014M. Leninger. 192. a*ara*ar Biokimia #ili& 1. #akarta 8": ,rlangga.
Fpart +,. 2003. irtual +embook. "nternetM. )ailable: ttp://---.elmur*t.e&u/N@m/@embook/ 10 Eoember 2009M. Poe&7ia&i ). 1994. a*ar&a*ar Biokimia. #akarta 8": Unier*ita* "n&one*ia Pre**. Poe&7i$a&i et al. 200!. a*ar a*ar Biokimia. #akarta 8": U"Pre**. Aia-an S. 1990. imia Frganik ,&i*i 1. #akarta 8": Binarupa )k*ara. S@ope*' A.. 1994. Protein Purification, Principles, and Practice 3rd edition. Ee-
