LAPORAN PRAKTIKUM
PENENTUAN KADAR PROTEIN
NAMA
: YULIANTI
NIM
: H311 12 014
KELOMPOK
: II (DUA)
HARI/ TGL. PERC.
: KAMIS/27 FEBRUARI 2014
ASISTEN
: SARTIKA
LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein mengandung pula fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Anwar dan sulaeman, 1992). Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven
organik,
garam,
logam
berat,
radiasi
sinar
radioaktif
(Sudarmadji dkk., 1989). Penetapan
protein
secara
akurat
merupakan
pekerjaan
yang
sulit
dilaksanakan. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain adalah protein membentuk grup yang sangat beragam dan luar biasa kompleksnya baik dalam [[
komposisi maupun dalam sifat sehingga sulit untuk memisahkan, memurnikan atau mengekstrak, sifat amfoterik dari protein, kemampuan mengabsorbsi yang tinggi, dan sensitifitas terhadap elektrolit, panas, pH, dan pelarut. Oleh karena itu analisa protein dalam makanan pada umumnya lebih kepada kadar total protein
dan bukan pada kadar protein tertentu (Anwar dan Sulaeman, 1992). Kadar protein yang terkandung dalam setiap bahan berbeda-beda. karena itu percobaan ini dilakukan untuk mengukur kadar protein menggunakan metode Lowry.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini adalah untuk memahami dan mempelajari cara penentuan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan metode Lowry.
1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan spektrofotometer menggunakan metode Lowry.
1.3 Prinsip Percobaan
Menentukan kadar protein dalam beberapa sampel cair yang telah dibuat terlebih dahulu dengan menggunakan metode Lowry dimana pada s ampel tersebut ditambahkan Lowry B dan Lowry A kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Kata protein berasal dari kata protos atau protos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu berperan dalam pembentukkan dan pertumbuhan tubuh. Dalam kehidupan protein memegang peranan yang penting pula. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalis. Di samping itu hemoglobin dalam butir-butir darah merah atau eritrosit yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh [[[[
bagian tubuh adalah salah satu jenis protein. Demikian pula zat-z at yang berperan untuk melawan bakteri penyakit atau yang disebut antigen, juga suatu protein (Poedjiadi,1994). Protein adalah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang berhubungan
satu
dengan lainnya melalui ikatan amida (peptida). Protein
memainkan berbagai peranan dalam sistim biologis. Beberapa protein merupakan komponen utama dari jaringan struktur (otot, kulit, kuku, rambut). Protein lain mengangkut molekul dari satu bagian ke bagian lain dalam makhluk hidup, juga ada yang bertindak sebagai katalis dalam banyak reaksi biologis yang diperlukan untuk mempertahankan hidup (Hart dkk., 2003). Kita memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan yang berasal dari tumbuhan disebut protein nabati. Beberapa makanan sumber protein adalah daging, telur, susu, ikan, beras kacang, kedelai, gandum, jagung
dan buah-buahan (Poedjiadi, 1994). Molekul protein sendiri merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai asam-asam amino. Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (-COOH) dan satu atau lebih gugus amino (-NH 2) yang salah satunya terletak pada atom C tepat sebelah gugus karboksil (atau atom C [[
alpha). Asam-asam amino yang berbeda-beda (ada 20 jenis asam amino dalam protein alamiah) bersambung melalui ikatan peptida yaitu ikatan antara gugus karboksil suatu asam amino dengan gugus amino dari asam amino yang di sampingnya (Sudarmadji dkk., 1989). Ada empat struktur dasar dari protein, yaitu struktur primer, sekunder, tersier dan kuarterner. Struktur primer menunjukkan jumlah jenis dan urutan sama amino dalam molekul protein. Oleh karena ikatan antar asam amino ialah ikatan peptida maka struktur primer protein juga menunjukkan ikatan peptida yang urutannya diketahui. Untuk mengetahui jumlah, jenis dan urutan asam amino dalam protein dilakukan analisis yang terdiri dari beberapa tahap yaitu (Poedjiadi, 1994) : 1. Penentuan jumlah rantai polipeptida yang berdiri sendiri 2. Pemecahan ikatan antara rantai polipeptida 3. Pemecahan masing-masing rantai polipeptida 4. Analisis urutan asam amino pada rantai polipeptida. Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam dua golongan besar yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Yang dimaksud dengan protein sederhana adalah protein yang hanya terdiri atas molekul-molekul asam amino, sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri atas protein dan
gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas karbohidrat, lipid atau asam nukleat. Protein sederhana dapat dibagi dalam dua bagian menurut bentuk molekulnya yaitu protein fiber dan protein globular. Protein fiber mempunyai bentuk molekul panjang seperti serat atau serabut sedangkan protein globular berbentuk bulat (Poedjiadi, 1994). Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif.
Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi
Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV (Poedjiadi, 1994). Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode, bergantung pada jenis sampel dan ketersediaan alat serta bahan (pereaksi). Metode yang umum digunakan adalah metode Kjedahl, Lowry dan Biuret. Penentuan kadar protein dengan metode biuret didasarkan atas pengukuran absorban dari senyawa kompleks antara protein dengan pereaksi biuret yang berwarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga (salah satu komponen dari biuret) dalam suasana basa. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ dari CuSO4 (Reagen Lowry B) menjadi Cu + oleh tirosin, triptofan dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat [
yang terkandung dalam reagen Folin membentuk warna biru yang dapat diserap oleh spektrofotometer (Septiani dkk, 2004). Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur jumlah penyerapan zat suatu senyawa. Penyerapan cahaya pada senyawa larutan
tersebut, dalam spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi larutan atau senyawa secara kuantitatif.
Dalam
pratikum
dalam
ini
penggunaan
KMnO 4 bertujuan
untuk
memudahkan
pengenalan dan latihan awal spektrofotometri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret. Beberapa metode yang sering digunakan antara lain (Sudarmadji dkk., 1996): 1. Metode Spektrofotometer UV Kebanyakan protein mengabsorbsi sinar ultraviolet maksimum pada 280 nm. Hal ini terutama untuk mengidentifikasi adanya asam amino tirosin, triptofan, dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein berdasarkan absorbsi sinar UV adalah cepat, mudah dan tidak merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan digunakan pula kurva standar. 2. Metode Turbidimetri atau Kekeruhan Metode ini didasarkan pada kekeruhan yang terbentuk pada larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic Acid (TCA), kalium ferri sianida [K 4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. 3. Metode Pengecatan Beberapa bahan pewarna misalnya Orange G. Orange 12 dan Amido Black dapat membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan kolorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengan cepat.
BAB III METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan induk (BSA 1 mg/mL), Lowry B (Na 2CO3 2 % dalam NaOH 0,1 N, larutan Na-K Tartrat 2 % dan larutan CuSO4.5H2O), Lowry A (larutan Follin Clocalteus dan akuades), larutan standar (0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12) M , larutan sampel, blanko, akuades, tissue roll dan kertas label.
3.2 Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah rak tabung, tabung reaksi, gelas kimia 100 mL, gelas kimia 400 mL, pipet skala 0,2 mL, pipet skala 1 mL, pipet skala 5 mL, filler pipet, corong, labu semprot, neraca analitik, sendok tanduk, batang pengaduk, labu takar 25 mL, pipet tetes, spektrofotometer 20 D+ dan bulb.
3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Pembuatan Larutan Induk
Dalam percobaan ini tidak ada pembuatan larutan induk, karena larutan induk BSA telah tersedia di laboratorium.
3.3.2 Pembuatan Larutan Standar
Larutan standar dibuat dengan cara melakukan pengenceran terhadap larutan induk BSA. Terlebih dahulu dihitung banyaknya volume yang ingin dipipet dan volume yang ingin ditambahkan yang telah diketahui konsentrasinya dan volume
totalnya. Setelah diketahui disediakan 6 buah tabung reaksi yang bersih dan kering. Kemudian dengan menggunakan pipet skala 0,2 mL, larutan induk dipipet sesuai dengan volume yang telah dihitung masing-masing dengan konsentrasinya. Lalu ditambahkan akuades dengan volume yang telah dih itung.
3.3.3 Pembuatan Reagen Lowry
Pada pembuatan pereaksi Lowry A yaitu dengan pencampuran antara follin dengan akuades dengan perbandingan 1 : 1, digunakan follin sebanyak 2 mL dan akuades 2 mL. Kemudian dengan menggunakan pipet skala 5 mL, follin dan akuades dipipet lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia 10 mL. Lalu larutan dihomogenkan. Pembuatan Lowry B dilakukan dengan mencampurkan Na 2CO3 dalam NaOH 0,1 N, larutan CuSO4.5H2O 1 %, dan larutan Na-K-Tartrat 2 % dengan perbandingan 100 : 1 : 1. Diambil larutan Na 2CO3 dalam NaOH 0,1 N sebanyak 25 mL, ditambahkan dengan 0,25 mL larutan CuSO 4.5H2O 1 % dan ditambahkan lagi dengan 0,25 mL Na-K-Tartrat 2 %, lalu dihomogenkan.
3.3.4 Preparasi Sampel
3.3.5 Penentuan Kadar Protein
Disediakan 6 buah tabung reaksi yang telah berisi 2 mL larutan standar pada konsentrasi berturut-turut 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 dan 1,2 mg/mL, 1 buah tabung reaksi yang diisi blanko sebanyak 2 mL dan 1 buah tabung reaksi yang diisi 2 mL larutan sampel, masing-masing ditambah dengan 2,75 mL reagen Lowry B, kemudian dikocok dan didiamkan selama 10 menit. Setelah itu ditambah lagi
dengan 0,25 mL larutan Lowry A, dikocok dan didiamkan pada suhu kamar selama 20 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer 20D+ pada panjang gelombang maksimum tertentu (ditentukan terlebih dahulu).
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Pada percobaan ini digunakan spektrofotometer untuk menentukan kadar protein yaitu dengan cara mengukur absorbansinya. Sebelum mengukur absorban dari masing-masing larutan, terlebih dahulu dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum. Data panjang gelombang dapat dilihat pada tabel di bawah ini : Tabel 2. Data Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum λ (nm)
Absorban
610
0.044
620
0.057
630
0.055
Grafik 1. Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
0.06 0.05 i 0.04 s n a b r 0.03 o s b A0.02
0.01 0 605
610
615
620
625
Panjang Gelombang
630
635
Setelah didapatkan panjang gelombang maksimum, dengan menggunakan panjang gelombang ini kita dapat menentukan kadar protein pada masing-masing konsentrasi dengan menggunakan spektrofotometer. Sehingga didapatkan data di bawah ini. Tabel 2. Data Hasil Pengamatan Penentuan Kadar Protein Konsentrasi
Absorban
0,02
-0.009
0,04
0,009
0,06
0,057
0,08
0,065
0,10
0,097
0,12
0,073
Sampel
0,041
Blanko
0
Grafik 2. Hasil Pengamatan Penentuan Kadar Protein 0.12
y = 0.9743x - 0.0195 R² = 0.814
0.1 0.08 i s n a b r o s b a
0.06 0.04 0.02 0 0 -0.02
0.02
0.04
0.06
0.08
Konsentrasi
0.1
0.12
0.14
Pada percobaan ini ditentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan metode Lowry. Penentuan kadar protein ini didasarkan pada reaksi protein dengan asam fosfotungstat-fosfomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang mana intensitas dari warnanya bergantung pada konsentrasi dari protein tersebut. Berdasarkan hal inilah sehingga kita dapat mengukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer. Prinsip metode Lowry adalah reaksi antara Cu 2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil fosfomolibdat dan fosfotungstat. Oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung dari tirosin dan triptofan yang terdapat dalam protein. Larutan Lowry yang digunakan pada percobaan ini ada dua macam yaitu Lowry A dan Lowry B. Asam fosfotungstat dan fosfomolibdat dari larutan Lowry A berfungsi memberikan warna pada larutan yaitu warna biru, dimana intensitas warnanya bergantung pada konsentrasi dari protein itu sendiri. Sedangkan pada pembuatan pereaksi Lowry B, bahan-bahan dalam pereaksi Lowry ini memiliki fungsi yang berbeda-beda. CuSO 4 berfungsi untuk mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, Na-K-Tartrat berfungsi untuk mencegah terjadinya pengendapan kupro oksida dalam pereaksi Lowry B, sedangkan Na 2CO3 digunakan sebagai garam yang mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama dengan NaOH. Pereaksi Lowry B diteteskan pada larutan sampel, larutan sampel dan blanko kemudian dikocok perlahan agar bercampur dengan baik dan didiamkan selama 10 menit agar reaksi berlangsung sempurna. Setelah itu ditambahkan pereaksi Lowry A, dihomogenkan lalu didiamkan selama 20 menit pada suhu
kamar. Hal ini dilakukan agar reaksi berlangsung sempurna. Reagen Lowry B ditambahkan terlebih dahulu agar larutan CuSO 4 dapat mereduksi asam fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada Lowry A. Asam fosfotungstat dan fosfomolibdat inilah yang memberikan warna biru pada larutan ini. Setela h itu diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer.
4.2 Reaksi
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan
5.2 Saran 5.2.1 Percobaan
Waktu yang digunakan untuk percobaan ini sangat lama, sebaiknya digunakan metode penentuan kadar protein yang lain yang menggunakan waktu tidak terlalu lama.
5.2.2 Laboratorium
Alat-alat yang dibutuhkan dalam praktikum seharusnya diperbanyak, agar praktikum be rjalan lancar dan cepat.
5.2.3 Asisten
Sebaiknya menjelaskan prosedur secara keseluruhan sebelum memulai praktikum, agar kita tida bingung.
DAFTAR PUSTAKA
Anwar, F dan Sulaeman, A., 1992. Penetapan Zat Gizi Dalam Makanan, PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor. Hart, H., Craine, L.E., dan Hart, J.D., 2003, Kimia Organik edisi kesebelas, diterjemahkan oleh Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta. Poedjadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta. Septiani, Yona., Tjahjadi P., Artini P., 2004, Kadar Karbohidrat, Lemak, dan Protein pada Kecap dari Tempe (online), (http://kadar-karbohidrat-,lemakdan-protein-pada--kecap-dari-tempe,pdf , diakses tanggal 1 Maret 2014 pukul 22.35 WITA). Sudarmadji, S., 1989, Analisa Bahan Makanan dan Pertanian, Liberty Yogyakarta, Yogyakarta.
Lampiran I Bagan Kerja
1. Pembuatan Larutan Induk BSA 1 mg/mL 10 mg BSA
- Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL - Dilarutkan dengan akuades hingga tanda garis - Dihomogenkan Hasil
2. Pembuatan Larutan Standar a. Larutan Standar 0,02 mg/mL Larutan BSA 1 m /mL
Dipipet sebanyak 0,04 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,96 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
b. Larutan Standar 0,04 mg/mL Larutan BSA 1 mg/mL
Dipipet sebanyak 0,08 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,92 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
c. Larutan Standar 0,06 mg/mL Larutan BSA 1 mg/mL
Dipipet sebanyak 0,12 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,88 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
d. Larutan Standar 0,08 mg/mL Larutan BSA 1 mg/mL
Dipipet sebanyak 0,16 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,84 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
e. Larutan Standar 0,10 mg/mL Larutan BSA 1 mg/mL
Dipipet sebanyak 0,20 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,80 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
f. Larutan Standar 0,12 mg/mL Larutan BSA 1 mg/mL
Dipipet sebanyak 0,24 mL ke dalam tabung reaksi
Ditambahkan akuades sebanyak 1,76 mL
Dihomogenkan
Diberi label
HASIL
3. Pembuatan Reagen Lowry a. Pembuatan Reagen Lowry A 2 mL follin
Ditambahkan akuades sebanyak 2 mL
Dihomogenkan
HASIL
b. Pembuatan Reagen Lowry B 25 mL Na 2CO3 dalam NaOH
HASIL
Ditambahkan 2,5 mL CuSO 4 Ditambahkan 2,5 mL K-Na-Tartrat Dihomogenkan
4.
Preparasi Sampel Larutan Sampel
Dipipet 0,2 mL ke dalam tabung reaksi
Dilarutkan dengan akuades hingga 2 mL
Dihomogenkan
HASIL
5.
Preparasi Kadar Protein 2 mL blanko
2 mL larutan standar
2 mL larutan sampel
Dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi
Ditambahkan dengan 2,75 mL larutan Lowry B
Didiamkan selama 10 menit
Ditambahkan dengan 0,25 mL larutan Lowry A
Didiamkan selama 20 menit
Diukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer 20 D+
Data
Lampiran II Perhitungan
