Isolasi DNA Darah 1. Tujuan Mengisolasi DNA dari darah vena dengan menggunakan kit Wizard genomic DNA purification. . Alat lat dan dan !ah !ahan a. Alat 1." Microcentrifu Microcentrifuge ge tu#e tu#e 1$% ml ." Micropipet Micropipet &$%'1& &$%'1& (l$ 1&'1&& 1&'1&& (l$ 1&&'1& 1&&'1&&& && (l )." )." Tip #iru #iru *." *." Tip kuni kuning ng %." %." Tip puti putih h +." +." ,orterte." Microc Microcent entrifu rifugat gator or /." /." Inku Inku#a #ato tor r 0." puit puit dispo disposa# sa#le le % ml #. !ahan 1." 1." Wizard zard 2 3enomic DNA 4urification 5it 1&& isolations All &$ 6ang terdiri dari 7 a." 8ell 8ell 96sis 96sis olu olutio tion n #." Nuclei 96sis 96sis olution c." 4rotein 4rotein 4recipitation 4recipitation olution olution d." DNA :eh6dratio :eh6dration n olution olution e." e." :nase :nase ol olut utio ion n ." ." Isop Isopro ropa pano noll )." )." Alko Alkoho holl & ; *." *."
purifikasi DNA dari sel7 a. Melisis Melisiskan kan sel sel dengan dengan cell cell 96 96sis olut olution ion #. Melisiskan inti sel dengan Nuclei 96sis 96sis olution$ kemudian =optional" menguraikan>merusakan molekul :NA dengan :nase solution. c. Mempresipitas Mempresipitasikan ikan protein protein dengan dengan 4rotein 4rotein 4recipit 4recipitation ation olution. olution. d. Mengkonsen Mengkonsentrasika trasikan n DNA DNA genom 6ang diperoleh. diperoleh. ?rutan 8ara 5erja 7 1." Masukan 0&& (l 8ell 96sis 96sis olution ke dalam ta#ung microcentrifuge steril. ." Tam#ahkan Tam#ahkan )&& (l darah dan ta#ung diputar #olak'#alik %'+ kali untuk homogenasi. homogenasi. )." Inku#a Inku#asi si campur campuran an di atas selama selama 1& menit dalam suhu ruang ruang =#olak =#olak'#a '#alik lik ') kali *." %." +." ."
selama inku#asi". entrifugasi dengan kecepatan kecepatan 1).&&& rpm pada suhu ruang selama menit. !uang supernat supernatan an tanpa menggan mengganggu ggu pellet. pellet. Tam#ahkan Tam#ahkan +&& (l 8ell 96sis 96sis olution ke pellet dan dan vorte- se#entar. ?langi ?langi tahap * dan % sampai sampai pellet pellet terlihat putih. putih.
/." Tam#ahkan )&& (l Nuclei 96sis olutio ke pellet. 4ipet larutan %'+ kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. 9arutan harus #enar'#enar jadi kental. @ika masih terlihat #utiran'#utiran kecil setelah pencampuran$ inku#asi campuran terse#ut pada suhu ) o 8 sampai #utiran terse#ut hilang. 0." ptional 7 Tam#ahkan 1$% (l :nase olution dan campurkan dengan cara mem#olak #alik ta#ung. Inku#asi campuran pada suhu )
o
8 selama 1% menit$ lalu dinginkan
pada suhu ruang. 1&." Tam#ahkan 1&& (l 4rotein 4recipitation olution ke dalam lisate dan vorte- selama & detik. etelah divorte-$ akan terlihat #utiran'#utiran protein halus. 11." entrifugasi dengan kecepatan 1).&&& rpm selama * menit pada suhu ruang. Akan terlihat pellet dengan Barna cokelat terang. !ila supernatan masih #erBarna cokelat$ am#il supernatan terse#ut$ pindahkan ke ta#ung microcentrif uge #ersih$ ulangi langkah 1& dan 11. 1." 4indahkan supernatan ke dalam ta#ung microcentrifuge #ersih 6ang sudah #erisi 1 ml isopropanol. 1)." !olak #alik ta#ung secara perlahan sampai terlihat #enang'#enang putih halus =DNA". 1*." ?ntuk optimalisasi$ simpan ta#ung pada suhu ' & o 8 selama 1 jam. 1%." entrifugasi pada kecepatan 1).&&& rpm pada suhu ruang selama ) menit. Akan terlihat pellet putih. 1+." !uang supernatan$ cuci dengan *&& (l alkohol & ; dingin. 1." entrifugasi dengan kecepatan 1).&&& rpm selama ) menit pada suhu ruang$ sampai DNA #eru#ah menjadi transparan. 1/." !uang supernatan$ kering anginkan DNA pada suhu ruang. 10." 9arutkan DNA dengan 1&& (l :eh6dration olution. &." :ehidrasi DNA pada suhu +% o 8 selama 1 jam atau pada suhu * o 8 overnight . 1." impan DNA pada suhu C & o 8.
Deo-6ri#onucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari #er#agai sum#er. um#er untuk isolasi DNA sangat #eragam. 4ada dasarn6a dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. um#er'sum#er umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah$ ram#ut$ sperma$ tulang$ kuku$ jaringan$ noda darah$ air liur$ #ukal =pipi" kapas$ sel epitel$ urin. Metode 6ang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sum#er$ umur$ dan ukuran sampel. Meskipun #er#agai metode 6ang digunakan ada #e#erapa kesamaan di antara mereka. ecara umum$ mereka #ertujuan untuk men6ajikan DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainn6a. Isolasi DNA #iasan6a dimulai dengan lisis atau rusakn6a jaringan atau sel. 4roses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat dari inti. 9isis dilakukan dalam larutan garam$ deterjen 6ang mengandung protein denaturasi atau protease =enzim mencerna protein"$ seperti proteinase 5.
Metode tertua pemurnian DNA di la#oratorium$ masih sering digunakan juga$ mengandalkan campuran pelarut organik. ampel 6ang sudah lisis dicampur dengan fenol$ kloroform$ dan isoam6lalcohol untuk pemisahan DNA dan protein. 4rotein didenaturasi dengan campuran organik. 5etika sampel disentrifugasi$ DNA dipertahankan dalam air lapisan$ fenol di #agian #aBah ta#ung$ dan protein didenaturasi mem#entuk antarmuka #eraBan. Metode ini sangat efisien$ tetapi sa6angn6a han6a dapat digunakan jika jumlah #ahan aBal cukup melimpah. elain itu$ pelarut organik 6ang digunakan mem#aBa masalah kesehatan dan keselamatan. 5ualitas DNA dari prosedur ini #iasan6a tidak cukup untuk #e#erapa teknik analitis le#ih sensitif =terutama sequencing dan kadang'kadang 48:". e#uah modifikasi metode menggunakan garam tinggi =natrium klorida$ Na8l" konsentrasi untuk menurunkan DNA. etelah denaturasi protein selular 6ang menggunakan deterjen dan protease untuk #e#erapa jam atau semalam$ garam ditam#ahkan dan dicampur dengan solusin6a. Aki#atn6a$ garam asam nukleat ter#entuk dan di hadapan alkohol dapat dipulihkan dengan sentrifugasi. 5adang'kadang$ denaturasi alkali sampel digunakan untuk melepaskan DNA dari sel. ?sapan #ukal dan kadang'kadang noda darah dapat ditempatkan dalam ta#ung plastik kecil =eppendorfs" dan mengalami denaturasi dengan sodium hidroksida =Na<". olusi terse#ut kemudian kem#ali ke p< netral ekuili#rasi dengan larutan #uffer le#ih asam dan siap untuk 48:. Meskipun metode 6ang cepat dan sederhana$ kualitas DNA tidak selalu cukup untuk semua aplikasi. e#uah metode 6ang mirip dengan #asa denaturasi adalah denaturasi panas$ dicapai dengan mere#us sampel. 4emanasan sampel untuk 1&& E 8 DNA rilis ke solusi$ tetapi juga denaturasi dengan memisahkan kedua untai. Dalam #e#erapa kasus prosedur ini mem#erikan asam nukleat 6ang memadai 6ang dapat diamplifikasi dengan 48:. Namun$ se#agian #esar masih ada sisa inhi#itor dalam #entuk protein terdegradasi$ senyawa organik lainn6a$ atau ion. e#uah metode terkait digunakan di la#oratorium forensik umumn6a menggunakan resin pertukaran ion 8hele- 6ang mengikat ion logam multivalent dan ini #ermanfaat dalam menghilangkan inhi#itor dari DNA.
untuk menghapus materi terikat. Asam nukleat kemudian pulih dengan menggunakan air atau larutan garam p< netral untuk memecah ikatan resin'DNA. 4enggunaan kolom memungkinkan peningkatan throughput sampel$ Baktu 6ang le#ih singkat di#andingkan dengan isolasi ekstraksi pelarut #er#asis tradisional$ peningkatan hasil panen DNA pulih$ dan peningkatan kualitas DNA dimurnikan. elain kolom dan resin telah dijelaskan se#elumn6a$ ada juga resin cair 6ang digunakan. 4rinsipn6a adalah sama seperti untuk manik'manik magnetik$ tapi pada langkah terakhir sampel harus #erputar ke DNA terpisah dari resin. emua metode ini #erhasil digunakan di #er#agai la#oratorium dan dengan #er#agai contoh. Metode harus #enar dipilih untuk mengoptimalkan hasil dan kualitas DNA diekstraksi.
http://www.moleculardevices.com/pages/reagents/picopure_dna.html
