LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA MODUL RESPIRASI
KELOMPOK 5
Afiati Faizal Rachman Kiki Rosmayanti Maya Damayanti Muhammad Arif Rahman Muhammad Fahreza Kautsar Seflan Syahrir Ahliadi Siti Nashratul Kamila Tiara Putri Methas Wulan Roudotul Zanah
PROGRAM STUI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
DAFTAR ISI 1
Daftar Daftar Isi…………… Isi……………………… …………………… …………………… …………………… …………………… …………………… ………………. ……. 2 Praktikum I Pengukuran Pengukuran Kadar Peroksida Peroksida Lipid Dalam Dalam Cairan Biologis……………… Biologis…………………………. …………. 3 Praktikum II Uji Oksihemoglobin Oksihemoglobin & Deoksihemoglob Deoksihemoglobin…………………… in……………………………………………… ………………………… 6 Praktikum III Uji Untuk Methemoglobin……… Methemoglobin…………………………………… ……………………………………………………… ………………………….. 9 Praktikum IV Hemolisis Hemolisis Sel Darah Merah………………………………… Merah……………………………………………………………… …………………………… 13 Praktikum V Pengaruh Pengaruh Pelarut Organik Terhadap Terhadap Sel Darah Merah……………………………… Merah……………………………….. 17
Praktikum 1 2
PENGUKURAN KADAR PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS
A. Tujuan
Menetapkan Kadar Peroksida Lipid Dalam Cairan Biologis B. Dasar Teori
1. Radikal Bebas
Radikal bebas adalah suatu atom, gugus, atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit paling luar, termasuk atom hidrogen, logam-logam transisi, dan molekul oksigen. Adanya ‘elektron tidak berpasangan’ ini, menyebabkan radikal bebas secara kimiawi menjadi sangat aktif. Radikal bebas dapat bermuatan positif (kation), negatif (anion), atau tidak bermuatan . Sumber radikal bebas bisa berasal dari proses metabolisme dalam tubuh (internal) dan dapat berasal dari luar tubuh (eksternal). Dari dalam tubuh mencakup superoksida (O2*), hidroksil (*OH), peroksil (ROO*), hidrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen (O2), oksida nitrit (NO*), dan peroksinitrit (ONOO*). Dari luar tubuh antara lain berasal dari: asap rokok, polusi, radiasi, sinar UV, obat, pestisida, limbah industri, dan ozon .Radikal bebas pada umumnya dapat mempunyai efek yang sangat menguntungkan, seperti membantu destruksi sel-sel mikroorganisme dan kanker. Akan tetapi, produksi radikal bebas yang berlebihan dan produksi antioksidan yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel-sel jaringan dan enzimenzim. Kerusakan jaringan dapat terjadi akibat gangguan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas asam lemak atau dikenal sebagai peroksidasi lipid. Aktivitas radikal bebas dapat menjadi penyebab atau mendasari berbagai keadaan patologis. Di antara senyawa-senyawa oksigen reaktif, radikal hidroksil (‘OH) merupakan senyawa yang paling berbahaya karena mempunyai tingkat reaktivitas sangat tinggi. Radikal hidroksil dapat merusak tiga jenis senyawa yang penting untuk mempertahankan integritas sel yaitu: 3
(1) Asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) yang merupakan komponen penting fosfolipid penyusun membran sel (2) DNA, yang merupakan piranti genetik dari sel. (3) Protein, yang memegang berbagai peran penting seperti enzim, reseptor, antibodi, pembentuk matriks, dan sitoskeleton . Regulasi jumlah radikal bebas secara normal dalam sistem biologis tubuh dilakukan oleh enzim-enzim antioksidan endogenous seperti enzim SOD, GPx, dan CAT. Pengukuran radikal bebas di dalam tubuh sangat sulit dilakukan karena radikal bebas bereaksi sangat cepat sehingga seringkali dilakukan pengukuran tidak langsung melalui produk turunannya seperti MDA dan 4-hidroksinonenal. Kedua senyawa tersebut sering digunakan untuk pengukuran reaksi radikal bebas lipid . 2. Malondialdehida (MDA)
MDA
merupakan
produk
enzimatis
dan
nonenzimatis
dari pemecahan
prostaglandin endoperoksida dan produk akhir dari lipid peroksidasi. MDA merupakan molekul reaktif yang memiliki rumus molekul C3H4O2 dan dikenal sebagai penanda (marker) peroksidasi lipid. Pengukuran MDA banyak dilakukan oleh para peneliti sebagai indeks tidak langsung dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipid. prinsip pengukuran MDA adalah rekasi satu molekul MDA dengan dua molekul asam tiobarbiturat (TBA) membentuk kompleks senyawa MDA-TBA yang berwarna pink dan kuantitasnya dapat dibaca dengan spektrofotometer. C. Alat dan Bahan •
tabung sentrifuge 6 buah
•
kit 2 buah
•
spektofotometer
•
rak tabung 4
•
darah EDTA dari OP 1
•
darah EDTA dari OP 2
•
TCA 0,67%
•
TBA
•
aquades
D. Cara Kerja
1. Ambil darah OP kedalam 2 tabung sentrifuge masing-masing 25 ml (beri tanda 1 untuk darah OP 1, beri tanda 2 untuk darah OP 2)dan 1 tabung sentrifuge lain sebagai blanko diisi oleh 25ml aquades (sebagai kontrol) 2. Tetesi 0,75 ml TCA 0,67% kedalam 3 tabung diatas, kocok dulu sebentar mencampur bahan 3. Letakan tabung sentrifuge kedalam alat senftrifuge lalu atur kecepatan alat sentrifuge dan tunggu sampai alat sentrifuge berhenti 4. Setelah berhenti, lalu ambil masing-masing tabung sentrifuge tersebut. 5. Ambil supernatan dari masing-masing tabung sentrifuge lalu masukan kedalam tabung sentrifuge baru yang telah diisi oleh TCA, lalu beri label S1 untuk darah dari sampel 1, S2 untuk darah dari, dan B untuk blanko. 6. Masukan masing-masing sampel kedalam kit secara bergantian lalu Spektofotometer pada gelombang 560nm.
baca di
7. Setelah itu hitung kadar MDA.
E. Hasil
5
Bahan
Absorban
Kadar MDA
Blanko
0,023 A
1,5 x 10-7
S1
0,085 A
5,5 x 10-7
S2
0,136
8,8 x 10-7
Rumus menghitung kadar MDA : Kadar MDA = Ɛ
= 153.000
F. Kesimpulan
Seharusnya nilai MDA normal itu nol. Namun, pada kedua OP yang diuji ternyata memiliki nilai MDA>0. Karena MDA merupakan salah satu hasil dari reaksi radikal bebas dengan lipid, berarti terdapat radikal bebas didalam tubuh para OP yang melebihi kadar antioksidan. Praktikum II UJI OKSIHEMOGLOBIN & DEOKSIHEMOGLOBIN A. Tujuan
Membuktikan hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin (HbO2) dan dapat terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin.
6
B. Dasar Teori
Hemoglobin merupakan pembawa 02 yang baik. Hemoglobin merupakan protein yang tersusun dari empat subunit yang masing-masing berisis heme yang separuhnya menempel pada rantai polipeptida. Pada orang dewasa yang normal, kebanyakan hemoglobin berisi dua rantai alfa dan dua rantai beta. Heme merupakan komplek cincin porfrin yang meliputi satu atom ferrous besi. Masing-masing atom besi tersebut secara reversible dapat mengikat satu molekul oksigen. Besi tersebut selalu dalam bentuk ferrous sehingga reaksi tersebut dinamakan oksigenasi. Reaksi hemoglobin dengan oksigen adalah: Hb(Fe2+) + O2
Hb(Fe2+)O2
Karena berisi empat deoksihemoglobin, molekul hemoglobin juga dipresentasikan sebagai Hb4 dan beraksi dengan empat oksigen untuk membentuk Hb4O8. Reaksinya berjalan sangat cepat hanya kurg dari 0,01 detik Hemoglobin berfungsi untuk : 1.Mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru keseluruh jaringan tubuh 2.Mengikat dan membawa karbondioksida dari seluruh jaringan tubuh ke paru-paru 3.Memberi warna merah pada darah 4.Mempertahankan keseimbangan asam basa dari tubuh Pengujian kali ini bertujuan untuk memperlihatkan bahwa hemoglobin dapat mengikat oksigen menjadi HbO2 dan senyawa ini dapat terurai kembali menjadi deoksi Hb dan O2. Dalam keadaan tereduksi, Fe dalam hemoglobin dapat mengikat O2 menjadi HbO2. Dan HbO2 akan melepas 02 pada penambahan reaksi stokes. C. Alat dan Bahan •
Darah segar
•
Pereaksi Stokes
•
Larutan NH4OH
7
D. Cara Kerja •
OksiHb 1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 1 mL darah dengan 5 ml air suling. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksiHb yang terbentuk. 2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing – masing tabung berisi 3 mL. Gunakan tabung 1 sebagai control.
•
Pembentuk deoksiHb 1. Isi tabung ketiga dengan 1 mL pereaksi stokes dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan untuk melarutkan endapan yang akan segera terbentuk. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat. 2. Masukkan beberapa tetes larutan stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.
8
•
Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb
1. Kocok kuat – kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasidari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk. 2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang –ulang.
E. Hasil Hasil
Tabung 1
Tabung 2
Warna yang terbentuk
Merah terang
Merah gelap
F. Kesimpulan
Hemoglobin dapat mengikat oksigen dalam bentuk oksihemoglobin dan dapat terurai menjadi deoksihemoglobin
Pertanyaan : Peristiwa faal apakah yang ditiru dari percobaan ini? Jawab: Peristiwa yang ditiru adalah peristiwa pertukaran gas O2 dialveolus di mana setelah O2 berhasil masuk ke aliran darah akan diikat oleh hemoglobin menjadi oksihemoglobin dan ketika sampai dijaringan yang membutuhkan O2, ikatan Hb dan O2 dilepas dan akan membentuk deoksihemoglobin. G. Daftar Pustaka 9
Barret KE, Barman SM, Boitano S, Brooks HL. 2010. Ganong’s Review of Medical Physiology: gas Transport dan pH dalam Paru. 23rd . United States: Mc Graw Hill.
Praktikum III UJI UNTUK METHEMOGLOBIN
A. Tujuan
Memperlihatkan bila besi (Fe2+) dalam molekul hemoglobin dioksidasi menjadi Fe3+, maka terbentuk metHb yang tidak bisa lagi mengikat oksigen.
B. Dasar Teori 1. Methemoglobin
Pada
methemoglobinemia,
besi
heme
adalah
ferri
bukan
ferro.
Jadi,
methemoglobin tidak dapat mengikat atau mengangkut O2. Secara normal, enzim methemoglobin reduktase mereduksi Fe3+ methemoglobin menjadi Fe2+. Methemoglobin dapat terbentuk oleh oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ sebagai efek samping obat, seperti sulfonamide, dari hemoglobin M herediter atau akibat berkurangnya aktivitas enzim methemoglobin reduktase. Pada hemoglobin M, histidin F8 (His F8) diganti oleh tirosin. Besi pada HbM membentuk kompleks ionic ketat dengan anion fenolat tirosin yang menstabilkan bentuk 10
Fe3+. Di varian hemoglobin M rantai alfa, keseimbangan R-T menguntungkan keadaan T. Afinitas oksigen berkurang, dan efek Bohr tidak dijumpai. Varian hemoglobin M rantai beta memperlihatkan pertukaran R-T sehingga terjadi efek Bohr. Mutasi yang menguntungkan keadaan R (misalnya hemoglobin Chesapeake) meningkatkan afinitas O2. Jadi, hemoglobin tidak dapat menyalurkan O2 secara memadai ke jarigan perifer. Hipoksia jaringan yang terjadi menyebabkan polisitemia, suatu peningkatan konsentrasi eritrosit. 2. Reaksi
Hb (Fe2+) + K 3Fe(CN)6 Hb
Oksidator
Hb(Fe3+) + K 4Fe(CN)6 MetHb
MetHb ini tidak dapat lagi mengikat oksigen.
C. Alat dan Bahan
1. Darah segar 2. Pereaksi K 3Fe(CN)6 3. Pereaksi Stokes 4. Tabung reaksi 5. Pipet
D. Cara Kerja
1. Ambil sample darah sebanyak 1 mL, lalu encerkan dengan menambahkan 9 mL aquades dalam tabung reaksi. 11
1ml darah+ 9ml aquades
2. Bagilah darah yang telah diencerkan tersebut ke dalam 2 tabung reaksi, masingmasing sebanyak 5 mL. Menjadi tabung A dan tabung B. 3. Salah satu tabung (Tabung A) tambahkan 5 mL dari K 3Fe(CN)6 33% lalu kocok tabung dengan kuat. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Lalu tambahkan peraksi Stokes ke dalam tabung tersebut dan kocok kuat-kuat. Perubahan yang terjadi diperhatikan dan dicatat. 4. Tabung yang lain (Tabung B) dipanaskan sebentar, lalu tambahkan 5 mL K 3Fe(CN)6. Campurkan dengan membalik-balikkan tabung (tutup tabungnya terlebih dahulu). Perhatikan perubahan warna yang terjadi dan adakah gelembung- gelembung oksigen yang terbentuk.
Dipanaskan
E. Hasil
12
Tabung A Setelah + K 3Fe(CN)6 Setelah pengocokkan kuat Setelah + Stokes Setelah pengocokkan kuat
Perubahan (Warna darah dan gelembung) Warna coklat tua Ada gelembung (+) Warna hitam Ada banyak gelembung (+++)
Tabung B Setelah dipanaskan Setelah + K 3Fe(CN)6 Setelah pengocokkan kuat
Perubahan (Warna darah dan gelembung) Warna coklat muda Warna coklat tua Ada gelembung-gelembung (++)
F. Kesimpulan
Pada percobaan ini, terbentuk methemoglobin akibat oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ oleh K 3Fe(CN)6 dan penambahan stokes karena stokes menghomogenkan pereaksi stokes dengan darah,
sehingga
oksigen
akan
dilepas. Oleh
karena telah
terbentuk
methemoglobin, maka tidak bias lagi mengikat oksigen. Lepasnya oksigen ini terlihat dari adanya gelembung-gelembung diatas campuran darah, K 3Fe(CN)6, dan pereaksi stokes.
G. Daftar Pustaka
13
Murray, Robert K. 2009. Biokimia Harper Edisi 27 . Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
14
Praktikum IV HEMOLISIS SEL DARAH MERAH
A. Tujuan
Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonil terhadap membran sel darah merah.
B. Dasar Teori
Dalam larutan Hipotonis sel darah merah akan menggembung karena cairan dari luar sel akan masuk ke dalam sel darah merah. Bila pembengkakan SDM akan larut dalam cairan hipotonik sehingga larutan akan berwarna merah jernih. Di dalam larutan hipertonik terhadap tekanan osmotik plasma darah maka cairan dari SDM akan keluar dari sel sehingga SDM akan mengkerut (crenated).
C. Alat dan Bahan •
Darah segar
•
Larutan NaCl 2% 15
D. Cara Kerja
1. Ke dalam 10 tabung reaksi isikan campuran berikut : Tabung
Air (ml)
NaCl 2% (ml)
% NaCl
Teori
Praktikum
1
10
-
0
100
2
9
1
0,2
90
3
8
2
0,4
80
4
7,5
2,5
0,5
75
5
7
3
0,6
70
6
6,5
3,5
0,7
65
7
6
4
0,8
60
8
5,5
4,5
0,9
55
9
5
5
1,0
50
10
4,5
5,5
1,1
45
2. Campur dengan baik 3. Tambahkan 2 tetes suspensi ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalik balikan tabung perlahan. Diamkan selama satu jam. 4. Perhatikan dan catatlah derajat hmolisis pada tiap tabung.
E. Hasil Tabung
%NaCl
Hemolisis
Tabung
%NaCl
Hemolisis
1
0
+
6
0,7
+
2
0,2
+
7
0,8
+ 16
3
0,4
+
8
0,9
-
4
0,5
+
9
1
-
5
0,6
+
10
1,1
-
Pembahasan
Dari data yang tertera pada tabel diatas dapat diketahui bahwa beberapa tanbung telah terjadi hemolisis. Dengan dibuktikan adanya larutan yang berwarna lebih merah dari yang lainnya, hal tersebut terjadi karena hemoglobin yang ada pada eritrosit tersebut keluar ke media disekelilingnya yang diakibatkan pecahnya plasma darah, hal tersebut akibat pecahnya membran eritrosit, sehingga hemoglobin bebas ke dalam medium sekelilingnya (plasma). Kerusakan membran eritrosit dapat disebabkan oleh antara lain penambahan larutan hipotonis, hipertonis kedalam darah, penurunan tekanan permukaan membran eritrosit, zat/unsur kimia tertentu, pemanasan dan pendinginan, rapuh karena ketuaan dalam sirkulasi darah dll.
17
Apabila medium di sekitar eritrosit menjadi hipotonis (karena penambahan larutan NaCl hipotonis) medium tersebut (plasma dan lrt. NaCl) akan masuk ke dalam eritrosit melalui membran yang bersifat semipermiabel dan menyebabkan sel eritrosit menggembung. Bila membran tidak kuat lagi menahan tekanan yang ada di dalam sel eritrosit itu sendiri, maka sel akan pecah, akibatnya hemoglobin akan bebas ke dalam medium sekelilingnya. Sebaliknya bila eritrosit berada pada medium yang hipertonis, maka cairan eritrosit akan keluar menuju ke medium luar eritrosit (plasma), akibatnya eritrosit akan keriput (krenasi). Keriput ini dapat dikembalikan dengan cara menambahkan cairan isotonis ke dalam medium luar eritrosit (plasma). Jika phi cairan < phi darah, maka cairan bersifat hipotonik terhadap plasma darah. Hal ini menyebabkan aliran pelarut air dari cairan ke plasma darah. Akibatnya sel darah merah akan mengembang dan dapat pecah. Adanya hemoglobin dalam darah menimbulkan timbulnya warna merah dalam darah dan hemoglobin tersebut merupakan suatu senyawa organik yang kompleks yang terdiri dari empat pigmen porfirin merah. Fragilitas sel darah merah mencerminkan kemampuan sel darah merah untuk memasukkan sejumlah larutan sebelum sel darah merah tersebut lisis akibat membran selnya tertekan oleh larutan di dalam sel yang memiliki tekanan osmotik lebih tinggi dibandingkan dengan diluar sel. Larutan yang memiliki tekanan osmotik lebih rendah dibandingkan dengan tekanan osmotik di dalam sel darah merah disebut larutan hipotonis Jika sel darah merah berada dalam larutan hipertonis, yaitu larutan yang memiliki tekanan osmotik lebih tinggi jika dibandingkan dengan tekanan osmotik di dalam sel, maka sel darah merah akan mengalami krenasi karena cairan di dalam sel darah merah keluar ke cairan di sekitarnya Sedangkan Jika sel darah merah berada pada larutan hipertonis,yaitu larutan yang memiliki tekanan osmotik lebih rendah jika dibandingkan dengan tekanan osmotik di
dalam
sel,maka
sel
darah
merah
akan
bertambah
volumenya
hingga
pecah(hemolisis).adanya hemolisis ini akan menyebabkan larutan menjadi berwarna keruh karena isi sel darah merah keluar.
F. Kesimpulan 18
Peristiwa hemolisis terjadi pada larutan yang hipotonis, yaitu air hingga larutan NaCl 0,8 % . Adanya hemolisis menyebabkan cairan dan zat-zat lain dalam sel darah merah akan keluar menuju larutan sehingga larutan akan berwarna keruh.
Praktikum V PENGARUH PELARUT ORGANIK TERHADAP SEL DARAH MERAH
A. Tujuan
Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam pelarut organik tertentu.
B. Dasar Teori
Membran SDM antara lain mengandung lipid. Pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak anak menyebabkan lipid membran larut sehingga terjadi hemolisis. Dinding sel darah merah adalah suatu lipoprotein. Lemak merupakan pelarut organik. Dalam pelarut lemak, dinding ini akan larut, sehingga bila sel darah merah dimasukkan dalam pelarut lemak akan terjadi hemolisis. Oleh karena itu, lemak termasuk larutan hipotonis karena dapat membuat sel darah merah menjadi lisis.
C. Alat dan Bahan 19
•
Tabung reaksi
•
Pipet
•
Darah segar
•
Larutan NaCl 0,9%
•
Kloroform
•
Eter
•
Aseton
•
Alkohol
•
Toluen
D. Cara Kerja
1. Ke dalam 5 tabung reaksi, masukkan setiap 10ml larutan NaCl 0,9%. 2. Tambahkan setiap 2 tetes klororfom (tabung 1), eter (tabung 2), aseton (tabung 3), toluen (tabung 4) dan alkohol (tabung 5) secara berurutan 3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam (30 menit) 4. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan tabung lainnya
E. Hasil Nomor tabung 1 2 3 4 5
Pelarut Kloroform Eter Aseton Toluen Alkohol
Hemolisis + + + + +
20
1. Pada hasil percobaan ini didapatkan bawah larutan yang terdapat didalam tabung yang awalnya berwarna merah, lama kelamaan berubah menjadi pucat perlahan-lahan mulai dari bagian atasnya 2. Keadaan tersebut dipengaruhi oleh kadar zat pelarut organik yang diberikan ke dalam larutan 3. Pada percobaan yang ini, zat pelarut organik yang diberikan sedikit, sehingga efek hemolisis yang muncul pun juga sedikit
F. Kesimpulan
Sel darah merah akan mengalami lisis jika bereaksi dengan zat pelarut organik, yang bersifat melarutkan lemak.
G. Daftar Pustaka
Murray, Robert K. 2009. Biokimia Harper Edisi 27 . Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
21
