LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
ISOLASI BAKTERI
Oleh: Sri Lestari Nim.11630052
JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALIK IBRAHIM MALANG 2014
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk u ntuk mengetahui sifat fisiologisnya fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian penelitian-p enelitian mikrobiologi. Oleh karena itu praktikum ini dilakukan agar dapat mengetahui dan mengerti cara mengisolasi, pertumbuhan, serta morfologi bakteri selulolitik dengan cara yang benar.
1.2 Rumusan Masalah 1.Bagaimana isolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat murni ? 2.Bagaimana menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk menghasilkan enzim selulase? 3.Bagaimana mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik dengan pewarnaan gram?
1.3 Tujuan 1.Untuk mengisolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat murni. 2
Untuk menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk menghasilkan enzim selulase.
3
Untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik dengan pewarnaan gram.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Isolasi Bakteri Dari Bekatul Bekatul
mempunyai
kandungan
komponen-komponen
nutrisi
yang
dibutuhkan bakteri proteolitik. Bekatul mengandung protein tinggi, karbohidrat, lemak, vitamin, asam lemak esensial, serat pangan, oryzanol, dan asam ferulat (www.gizi.net, 15 Februari 2006). Bekatul mempunyai sumber karbon dan nitrogen lebih kompleks dibandingkan media lain. Keunggulan lain yaitu harganya lebih murah, mudah diperoleh dan tersedia secara melimpah, bahkan merupakan limbah yang dapat mencemari lingkungan. Isolasi Bakteri adalah proses pemurnian bakteri dari sekelompok bakteri yang terdapat dalam habitat yang sama. Pemurnian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri murni yang hanya terdiri dari satu species saja. Bakteri yang sudah dimurnikan, kemudian akan dibiakkan dalam media buatan u ntuk mendapatkan kultur bakteri murni dalam jumlah banyak. Fardiaz (1988) menyebutkan bahwa terdapat tiga jenis isolasi yang umum dilakukan yaitu isolasi pada media cawan, isolasi pada medium cair, dan isolasi sel tunggal. Isolasi agar cawan dilakukan dengan menggunakan goresan kuadran atau metode agar tuang. Keberhasilan metode ini sangat tinggi karena kebanyakan bakteri, kapang dan khamir dapat membentuk koloni pada media padat sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan sel – sel tersebut pada agar cawan sehingga timbul koloni – koloni yang terpisah. Isolasi medium cair digunakan untuk beberapa bakteri yang ukuran selnya besar, tidak dapat tumbuh pada agar cawan, hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode yang digunakan adalah metode pengenceran. Metode ini mempunyai kelemahan karena hanya dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba yang jumlahnya dominan dalam suatu campuran populasi mikroba. Isolasi sel tunggal digunakan untuk mengisolasi sel mikroba yangukurannya besar serta tidak dapat diisolasi dengan metode cawan maupun pengenceran.
2.2 Bakteri Selulolitik Selulolitik merupakan aktivitas bakteri dalam perombakan selullosa dengan bantuan
enzim
selulase.
Enzim
selulolitik
dibentuk
oleh
sebagian
besar
mikroorganisme. Mikroorganisme banyak ditemukan pada fungi, actinomycetes, myxobacteria dan bakteri sejati (Enari, 1983 dalam(Widyastuti,2005). Beberapa mikroorganisme mengeluarkan enzim selulase didalam media kultur. Enzim selulase benar-benar ekstra selular dalam banyak kasus tingginya aktivitas selulase ditemukan didalam filtrat pada fase pertumbuhan strasioner dan dapat diduga bahwa enzim dilepaskan secara otomatis. Secara jelasnya bahwa enzim harus berada diluar sel tetapi enzim ini masih terikat pada permukaan. Hal ini meimbulkan dugaan bahwa degradasi selulosa lebih efisien ketika kontak secara langsung antara sel mikroba dan substrat. Dengan maksud ini konsentrasi enzim dan kondisi ruang yang baik telah terpenuhi. Pemanfaatan bakteri selulolitik sebagai penghasil enzim selulase digunakan untuk menghidrolisis selulosa karena bakteri tersebut menghasilkan enzim selulase sebagairespon terhadap adanya selulosa pada lingkungannya. Proses ini berlangsung apabila terjadi kontak langsung antara sel bakteri dan permukaan selulosa (Hartanti, 2010). Enzim selulase dapat dihasilkan oleh bakteri dan fungi. Salah satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus sp. (Sadhu et al., 2013). Selulase dapat diaplikasikan untuk memperhalus bubur kertas pada industri kertas, menjaga warna kain agar tetap cemerlang pada industi tekstil, meningkatkan kualitas pada industri pangan, sebagai dekomposer bahanbahan organik, meningkatkan nutrisi pakan ternak, berperan penting dalam biokonversi selulosa menjadi berbagai komoditas senyawa kimia dan dapat mengurangi dampak negatif dari polusi limbah terhadap lingkungan(Hartanti, 2010). Enzim selulase merupakan enzim ekstrakseluler yang dihasilkan di dalam sel kemudian dikeluarkan ke media tumbuhnya. Selulase dapat menghidrolisis ikatan β-1,4- glikosidikpada selulosa. Enzim Selulase dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaituendo-1,4-β-Dglukanase,eksoo-1,4-β-Dglukanase, dan β-D-glukosidase. Ketiga komponen enzim tersebut bekerjasama
dalam menghidrolisis selulosa yang tidak dapat larut menjadi glukosa (Fikrinda, 2000). 2.3 Pewarnaan Gram Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 – 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (violet kristal) 2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. 3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. 4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali selsel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam 3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. 4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. 5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. 6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. 7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. 8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat 9. Peka terhadap streptomisin 10. Toksin yang dibentuk Endotoksin b. Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. 3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat secara nyata o leh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut 8. Tidak peka terhadap streptomisin 9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin.
BAB IV PEMBAHASAN
4.1 Data Pengamatan 4.1.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul
1. 2.
3. 4.
5.
6.
Perlakuan Ditimbang 11 gr serbuk bekatul Dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media Nutrient Broth (pH 8-11) dengan cara : Dibuka tutup kapas erlenmeyer Dibakar mulut erlenmeyer (proses berlangsung dalam laminar) Dimasukkan bekatul sebanyak 11 gram Dibakar kembali mulut erlenmeyer Ditutup kembali dengan kapas Di wraping 0 Diinkubasi pada suhu 45 C selama 48 jam Dibuat media (CMC) untuk penanaman bakteri pada cawan petri Diambil sampel bekatul yang telah melalui proses dalam inkubator Dilakukan pengenceran -1 bertingkat dari 10 sampai -5 10 dengan cara : Dibuka tutup kapas tabung reaksi Dibakar mulut tabung
Hasil Diperoleh 11 gr bekatul Bekatul
bercampur dengan Nutrien
Broth Nutrien broth
berwarna bening
Sampel dalam inkubator CMC siap digunakan sebagai media
penanaman bakteri Bekatul keluar dari inkubator
Pengenceran dengan konsentrasi -1
bertingkat dari 10 sampai 10
-2
reaksi diatas bunsen Dibuka tutup kapas erlenmeyer yang berisi bekatul Dipanaskan mulut erlenmeyer Diambil 1 ml sampel bekatul Dimasukkan sampel bekatul dalam tabung reaksi yang berisi NaCl Di vortex Diulangi langkah yang -1 sama dari dari 10 sampai -5 10 7. Di ambil sampel yang sudah bercampur dengan NaCl 8. Dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi media CMC agar untuk ditanam secara pour plate o 9. Diinkubasi pada suhu 70 C selama 24 jam 10.Diambil cawan petri yang berisi sampel dari inkubator 11.Diamati bakteri yang muncul pada masing-masing cawan petri 12.Dilakukan pemurnian dengan cara : Disiapkan kawat ose dan disterilkan dengan disemprot menggunakan alkohol Dibakar kawat ose pada nyala api bunsen spiritus sampai kawat berwarna merah Diambil satu ose isolat mikroba yang terpisah dari koloni dengan
Sampel bercampur dengan NaCl
Penanaman
bakteri dengan media CMC agar dalam cawan petri
Cawan
petri dalam inkubator
Cawan petri
keluar dari inkubator
Bakteri yang
-1
-2
-4
muncul 10 , 10 ,10 , -5 -3 10 . bakteri yang tidak muncul 10
Kawat
ose steril
Kawat ose
panas
Didapat satu isolat mikroba
menggunakan kawat ose Di taruh dalam tabung reaksi yang berisi media CYPE – agar dengan metode streak kuadran (zig-zag) Ditutup kembali tabung reaksi
Satu isolat mikroba berada dalam
media CYPE – agar
Tabung reaksi tertutup
Di dapat
isolat murni
Disimpan isolat murni yang didapatkan pada media miring CYPE –agar untuk perlakuan selanjutnya
4.1.2 Uji Bakteri Selulolitik secara Kualitatif
1.
2. 3. 4. 5.
6.
Perlakuan Diambil satu ose isolat dengan kawat ose yang telah dibakar pada nyala api bunsen sampai berwarna merah Dimasukkan kedalam 25 ml media CMC broth Dishaker selama 24 jam Dimasukkan kertas cakram dalam biakan isolat bakteri Diletakkan kertas cakram tersebut diatas media CMC agar dalam cawan petri Diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37⁰C 7. Ditambahkan congo red 0,3 % dengan pipet tetes secukupnya (jangan sampai terkena kertas cakram) 8. Didiamkan selama 15 menit 9. Dibilas dengan NaCl 1 M sampai terendam
Hasil Satu ose isolat terambil
Satu ose isolat dalam CMC broth Homogen Kertas cakram dalam isolat bakteri Kertas cakram berada diatas media CMC
Sampel dalam inkubator
Congo red berwarna merah , sampel putih keruh
10. Dibuang hasil sisa pencucian NaCl 11. Diukur zona bening dan diameter koloni dengan menggunakan jangka sorong
Zona bening tampak
4.1.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik dengan Pewarnaan Gram
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
Perlakuan Disemprot alkohol Ditetesi aquades -1 Dimasukkan bakteri ( 3 10 b) Difiksasi sampai kering Ditetesi dengan 1 tetes kristal violet Ditunggu sampai 60 s Dibilas dengan aquades dan dikeringkan Ditetesi 1 tetes iodin Ditunggu sampai 60 s Dibilas dengan aquades dan dikeringkan Ditetesi 1 tetes etil alkohol Ditunggu sampai 30 s Dibilas dengan aquades dan dikeringkan Ditetesi 1 tetes safranin Ditunggu sampai 60 s Dibilas dengan alkohol dan dikeringkan Diberi minyak imersi jika tidak bisa terlihat dalam mikroskop Diamati pada mikroskop Dilakukan ulang dengan perlakuan -2 yang sama pada bakteri (3 10 a, 3 -1 -4 -1 10 4, 1 10 , 3 10 a)
Hasil
Bakteri selesai difiksasi Bakteri berwarna ungu
Bakteri tetap berwarna ungu
Bakteri tetap berwarna ungu
Bakteri tidak berwarna
Bakteri berwarna merah
Bakteri uji gram negatif
4.2 Pembahasan 4.2.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul Isolasi bakteri selulolitik dari bekatul ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri selulolitik dari bekatul, sehingga diperoleh isolat murni. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam suatu media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Adapun langkah-langkah yang dilakukan dalam isolasi bakteri selulolitik yaitu, pertama menimbang 11 gram serbuk bekatul dengan neraca analitik. Bekatul digunakan sebagai sampel yang akan diisolasi bakteri selulolitiknya untuk diambil isolat murninya yang nantinya akan dilakukan beberapa uji untuk menguji kemampuannya menghasilkan enzim selulase dan mengetahui morfologi dari isolat bakteri tersebut. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan sampel ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml Nutrient Broth dalam laminar dengan cara membuka tutup kapas erlenmeyer yang berisi nutrient broth, kemudian membakar
mulut
erlenmeyer.
Fungsi
pembakaran
disini
adalah
untuk
mensterilkan. Selanjutnya memasukkan 11 gram bekatul, membakar kembali mulut erlenmeyer dan menutupnya dengan kapas lalu diwrapin agar sampel tidak terkontaminasi dengan lingkungan luar. Nutrient broth merupakan media yang berfungsi sebagai nutrisi untuk mencukupi kebutuhan hidup dari bakteri. Berikut gambar dari nutrient broth sebelum dan sesudah bercampur dengan sampel.
Sebelum bercampur dengan sampel
Sesudah bercampur dengan sampel o
Setelah bercampur dengan sampel, diinkubasi pada suhu 45 C selama 48 jam. Inkubator digunakan sebagai tempat mempercepat pert umbuhan bakteri. Langkah selanjutnya yaitu membuat media CMC (Carboxyl Metil Celulose) untuk media penanaman bakteri atau biasa disebut dengan inokulasi pada cawan petri. Kemudian memasukkan CMC cair ke dalam cawan petri, meratakannya ke seluruh cawan dan menunggu hingga CMC memadat. Dalam praktikum ini digunakan metode tuang (pour plate method) yaitu metode penuangan media cair yang akan di padatkan ke dalam wadah uji yang diratakan keseluruh medium.Berikut gambar pembuatan media CMC
Sebelum
dilakukan
penanaman,
terlebih
dahulu
dilakukan
pengenceran
bertingkat untuk mengetahui perbedaan pertumbuhan bakteri dengan konsentrasi -1
-5
antara 10 sampai 10 . Berikut langkah-langkah dalam pengenceran, pertama mengambil 1 ml sampel bekatul dengan mikro pipet dan memasukkannya ke -1
dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 10 sebagai pengencer yang telah
disediakan. Setelah itu, memvortex agar didapatkan campuran yang homogen. Setelah di vortex, mengambil 1 ml sampel dalam tabung reaksi dan memasukkanya ke dalam cawan petri yang berisi media CMC. Inilah yang -1
-
disebut dengan penanaman (inokulasi). NaCl 10 dimasukkan kedalam NaCl 10 2
-5
, mengulangi langkah-langkah seperti sebelumnya sampai 10 . Setelah itu, o
diinkubasi pada suhu 70 C selama 24 jam. Mengambil cawan petri yang berisi sampel dari inkubator dan mengamati bakteri yang muncul pada masing-masing cawan petri. Berikut data hasil pengamatan baik bentuk koloni, tepi koloni, dalam koloni dan elevasi. No
1.
2.
Nama
III 10
-
III 10-
Bentuk
Tepi
Dalam Koloni
Elevasi
Koloni
Koloni
Melingkar
Seperti
Transparan (tidak
Cembung
Rambut
tembus cahaya)
Tidak
Tidak
Tidak Transparan
Cembung
Beraturan
Beraturan
3.
III 10-
Melingkar
Rata
Tidak Transparan
Cembung
4.
I
-
Melingkar
Rata
Transparan
Rata
10
Tembus Cahaya 5.
-
IV 10
Tidak Beraturan
Berombak
Transparan
Cembung
Tembus Cahaya
Selanjutnya dilakukan pemurnian dengan cara mempersiapkan kawat ose dan mensterilkannya dengan menyemprot menggunakan alkohol. Kemudian membakar kawat ose pada nyala api bunsen spiritus sampai kawat berwarna merah menyala. Lalu, mengambil satu ose isolat mikroba yang terpisah dari koloni dengan menggunakan kawat, saat pengambilan. Usahakan kawat ose ditempelkan dulu pada media. Agar pada waktu pengambilan, bakteri tidak mati akibat tingginya suhu (panas) dan menaruhnya dalam tabung reaksi yang berisi media CYPE-agar dengan metode streak kuadran (zig-zag) yang mana ujung kawat ose yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan petri sampai meliputi seluruh permukaan. Metode ini yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan
menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Berikut gambar metode metode streak kuadran :
4.2.2 Uji Bakteri Selulolitik Secara Kualitatif Pengujian zona bening dilakukan dengan menggunakan larutan congo red 0,1% sebagai larutan penguji dan NaCl 1% sebagai larutan pencuci. Sebanyak 2 ml larutan congo red 0,1% dituangkan ke dalam media yang berisi isolat, kemudian didiamkan selama 20 – 30 menit. Larutan dibuang dan dibilas dengan larutan NaCl 1%, kemudianbdiamati keberadaan zona bening (Clear zone). Hasil positif dinyatakan dengan adanya zona bening (clear zone) di sekitar koloni. Pengamatan bentuk sel dan pewarnaan cat gram merupakan langkah awal dalam melakukan identifikasi. Bakteri diberi pewarnaan cat gram untuk mengetahui sifat bakteri tersebut berkenaan dengan kandungan peptidoglikan di dalam dinding sel bakteri yang dapat berikatan kuat dengan salah satu komponen cat gram yang akan diberikan yaitu kristal violet sebagai pewarna utama, sedangkan sebagai pewarna pembanding yaitu safranin. Maka akan diketahui bakteri tersebut termasuk gram positif jika berwarna ungu, menunjukkan kandungan peptidoglikannya tinggi, dan sebaliknya jika kandungan peptidoglikannya rendah maka sel bakteri akan berwarna merah sebagai gram negatif. Selain itu, pengamatan morfologi koloni dan karakteristik lain. Jika spesies suatu mikroorganisme itu diketahui dengan jelas, tentunya penyediaan kondisi pertumbuhan yang sesuai dapat dipenuhi, sehingga laju pertumbuhan akan maksimal dan hasil yang diperoleh pun akan optimal.
Langkah-langkah yang dilakukan dalam pengujian ini yang pertama yaitu mengambil satu ose isolat dengan kawat ose yang telah dibakar pada nyala api bunsen sampai berwarna merah menyala. Kemudian memasukkannya kedalam 25ml media CMC broth. Media CMC broth ini berwujud cair yang digunakan sebagai media penanaman bakteri untuk menghasilkan bakteri selulolitik. Untuk menghomogenkan antara CMC broth dan sampel dilakukan dalam shaker selama 24 jam. Lalu memasukkan kertas cakram dalam biakan isolat bakteri dan meletakkan kertas cakram diatas media CMC agar dalam cawan petri. Kertas cakram digunakan untuk membantu pengukuran indeks bias . Kemudian menginkubasinya selama 24 jam pada o suhu 37 C dan menambahkan congo red 0,3% dengan pipet tetes secukupnya, usahakan dalam penambahan congo red jangan sampai terkena kertas cakram. Selanjutnya mendiamkannya selama 15 menit dan membilasnya dengan NaCl 1 M sampai terendam yang selanjutnya membuang hasil sisa pencucian NaCl. Hasil pencucian sampel tersebut siap untuk diukur zona bening dan diameter koloni yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong. Uji aktivitas selulase dilihat dari indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Adanya zona bening menandakan adanya enzim selulose pada bakteri selulolitik. Indeks selulase memperlihatkan besar kecilnya enzim selulase. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan semakin besar enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut. Berikut data hasil pengukuran indeks selulase : Nama -
Indeks selulase
III 10 A
0,25
III 10- A
0,45
-
0,35
-
Tak terbentuk
-
0,15
III 10 B
-
0,25
I 10-
0,35
III 10 A III 10 B III 10 B
-
0,45
-
0,1
I 10 I 10
Dari hasil pengukuran diatas, indeks selulase yang terbentuk paling besar -2
-2
yaitu pada III 10 A dan I 10 yang menghasilkan enzim selulase terbesar.
Berikut gambar koloni bakteri sebelum dan sesudah ditambahkan congo red. Adanya zona bening yang tampak :
Zona Bening
4.2.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik a. Pewarnaan Gram Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
Tahap yang dilakukan dalam identifikasi ini antara lain pertama menyemprot kaca preparat dengan alkohol agar steril, kemudian menetesinya dengan aquades dan -1
meletakkan bakteri ( 3 10 b) diatas kaca preparat. Penambahan aquades disini bertujuan agar bakteri yang akan diamati merata pada kaca preparat. Karena apabila sampel menggumpal, sulit diamati dalam mikroskop. Tahap selanjutnya memfiksasi untuk melengketkan bakteri pada kaca preparat diatas nyala api sampai kering. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa merusak sel bakteri. Kemudian menetesi sampel pada kaca preparat dengan 1 tetes kristal violet ditunggu sampai 60 detik, dibilas dengan air dan ditiriskan. Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing,dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991). Langkah selanjutnya menetesi preparat dengan setetes iodin sampai 1 menit, membilasnya dengan aquades dan mengeringkannya. Iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri. Sampel bakteri dalam preparat tetap berwarna ungu. Kemudian menetesi setetes atil alkohol untuk melunturkan warna sebelumnya sampai 30 detik, sehingga didapatkan hasil bakteri preparat tak berwarna. membilasnya dengan aquades dan mengeringkannya. Langkah selanjutnya yaitu menetesinya dengan satu tetes safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target sehingga bakteri berubah warna menjadi merah selama 60 detik yang kemudian membilasnya dengan alkohol dan mengeringkannya. Setelah dilakukan pewarnaan gram diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000 X agar terlihat dengan jelas bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif berwarna ungu dan gram negatif berwarna merah. hasil yang diperoleh pada praktikum pewarnaan gram ini adalah sebagai berikut :
nama
Warna
Jenis gram
bakteri -
Merah
Negatif
-
Tak terdeteksi
Tak terdeteksi
III 10 4
-
Merah
Negatif
-
Merah
Negatif
III 10 b
III 10 a
I 10
Gambar dalam mikroskop
III 10- a
Merah
Negatif
-2
Dilakukan ulang dengan perlakuan yang sama pada bakteri (III 10 a, III -1 -1 -4 -1 10 b , III 10 4, I 10 , dan III 10 a ).
BAB V KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat di simpulkan bahwa isolasi adalah dengan cara mengisolasi (menuang) sampel untuk mendapatkan isolat campuran dengan cara menuangkan sampel yang telah diencerkan ke dalam cawan petri, lalu ditambahkan media, digoyang dan diinkubasi selama 48 jam, sehingga dapat diamatikoloni bakteri dalam cawan petri. Uji aktivitas selulase dilihat dari indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase memperlihatkan besar kecilnya enzim selulase. Dari hasil pengukuran diatas, indeks -2
-2
selulase yang terbentuk paling besar yaitu pada III 10 A dan I 10 yang menghasilkan enzim selulase terbesar. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan semakin besar enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut. Pengecatan Gram adalah suatu pewarnaan diferensial yang mengelompokkan bakteri menjadi gram positif dan gram negatif bergantung kepada kemampuan bakteri yang bersangkutan untuk menahan pewarna primer (ungu kristal) ketika mengalami perlakuan dengan bahan pengecat. Hasil pengamatan yang kami lakukan diperoleh bakteri gram negatif dengan indikator warna merah.
5.2 SARAN Terimakasih kepada assisten yang telah banyak membantu, semoga ilmunya bermanfaat.
DAFTAR PUSTAKA Fikrinda, 2000. Isolasi dan karakterisasi Bakteri Penghasil Selulase Ekstermofilik dari Ekosistem Air hitam. Tesis Program Pascasarjana IPB, Bogor. Hartanti, 2010. Isolasi dan Seleksi Bakteri Selulolitik Termofilik dari Kawah Air Panas Gunung Pancar , Bogor. Skripsi FMIPA IPB, Bogor. Sadhu, S., Saha, P., Sen, S.K., Mayilraj, S., & Miti, T. 2013. Production, Purification and Characterization of Novel Thermotolerant Endoglucanse (CMCase) from Bacillus Strain Isolated from Cow Dung .Spingerplus Jurnal . India.
