Laporan Tdl Mikro Andrew

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK DASAR LABORATORIUM (TDL) MIKROBIOLOGI UJ IHEMA MAGLUTI NASI( HA) UJ IHEMA MAGLUTI NASII NHI BI TI ON ( HI ) UJ IELI S A

Oleh:

Makbruri NPM.

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK  FAKULT FAKULTAS AS KEDOKTERAN KEDOKTER AN UNIERSITAS UNI ERSITAS INDONESIA INDONES IA !AKARTA "#$% PRAKTIKUM $

U&i 'eA*lu+i,a-i ('A)

A. ak+u ak+u Pela Pelak-a k-a,aa ,aa, ,

Selasa, 15 Maret 2016, Pukul 11.00 11.00 WIB

B. Tu&ua,

Tujuan praktikum ini untuk mengukur titer HA seiaan !irus "ang akan igunakan untuk uji Ham#atan aglutinasi $HI%.

/. Pri,-i0

Be#erapa !irus manusia mempun"ai kemampuan untuk #erikatan engan  permukaan sel ara& mera& ari spesies #er#ea. Aan"a ikatan antara !irus $anti $antige gen% n% eng engan an sel ara ara& & mera& mera& $erit $eritr' r'si sit% t% akan akan men" men"e#a e#a#k #kan an terja terjai i &emaglutinasi.

Gabar $: (eaksi )ji &emaglutinasi

D. La,1 La,1aa-a, a, +e2 +e2ri ri

*irus *irus aala& suatu gen'm "ang tertutup alam selu#ung selu#ung pr'tekti+. pr'tekti+. 1  *irus &an"a menganung sala& satu asam nukleat saja $-A atau (-A%. (eplikasi !iru !iruss meme memerlu rluka kan n asam asam nukl nukleat eat saja. saja. *irus rus meme memerl rluk ukan an &'st &'st untu untuk k #ias #ias  #erkem#ang #iak 2. Paa luar &'spes, !irus terapat se#agai partikel !irus, "aitu virion. virion. Virion teriri Virion teriri ari, atas asam nukleat an selu#ung pr'tein "ang ise#ut kaps kapsi i.. Part Partik ikel el !iru !iruss ini ini ise# ise#ut ut nukleocapsid . *irus irus apat apat merusa merusak k seluru& seluru& k'mpleks sel an menim#ulkan kerusakan jaringan, #er/ak#er/ak nekr'sis an keping kepingan an lisis. lisis. )mumn" )mumn"aa &'spes &'spes !irus, !irus, "aitu "aitu tum#u& tum#u&tum tum#u& #u&an, an, &ean &ean an mikr''rganisme. )ji Hemaglutinasi Hemaglutinasi $HA% atau  Hemaglutination Test  Test  $HA  $HA Test% terjai paa !irus "ang memiliki &emaglutinin paa permukaan partikel !irus, jika #erikatan engan resept'r k&usus paa eritr'sit. Hasil ari uji HA apat iper'le& engan /epat, &asil ari tes ini iasarkan aa3tiakn"a ikatan &emaglutinasi eritr'sit paa  partikel !irus $virion%. virion%. Terka erkaang ang alam alam uji HA, ikatan ikatan &emagl &emaglutin utinasi asi apat apat ika ika/a /auk ukan an 'le& 'le& si+a si+att elus elusii !iru !iruss ika ikare rena naka kan n ter terap apat at akti akti!i !ita tass en4i en4im m neuraminiase ari !irus "ang apat merusak ikatan antara eritr'sit engan !irus . Akti!itas Akti!itas &emaglutina &emaglutinasi si an neuramini neuraminiase ase iperankan iperankan 'le& ua glik'pr'tei glik'pr'tein n utama paa permukaan !irus, "aitu &emaglutinin $HA% an neuraminiase $-A% 5. en Hemagl Hemagluti utinin nin $HA%, $HA%, aala& aala& m'leku m'lekull glik'p glik'pr'te r'tein in selu#un selu#ung g !irus !irus "ang "ang

 #er+ungsi untuk meningkatkan !irus ke resept'r sel target an mengaali terjain"a in+eksi. en neuraminiase $-A%, aala& en4im "ang i#utu&kan !irus untuk melepas &asil replikasi !irus ari sel "ang in+eksi. 6 Hemagl Hemagluti utinasi nasi,, aala& aala& a"a a"a pengik pengikatan atan antige antigen n !irus !irus engan engan eritr'si eritr'sitt &ean tertentu, karena !irus iikat 'le& resept'r eritr'sit. Bila !irus iikat 'le& eritr'sit #e#erapa jenis !irus, an ilepaskan kem#ali se/ara sp'ntan 'le& eritr'sit "ang mengikat !irus se&ingga terjai elusi. Sesua& terjai elusi, !irus ilepaskan an !irus !irus masi& masi& #isa #isa menga mengaakan akan &emaglu &emaglutin tinasi asi engan engan eritr' eritr'sit sit lain, lain, tetapi tetapi eritr'sit "ang tela& ilepaskan !irus tiak #isa mengikat !irus lain, se#a# resept'r  eritr'sit sua& rusak 'le& !irus "ang pertama. Hemaglutinasi terjai alam tiga ta&ap, "aitu $1% a#s'rpsi !irus paa resept'r !irus, $2% aglutinasi ari k'mpleks !irus eritr'sit, $% an elusi !irus se/ara sp'ntan. 7 Titer !irus apat iketa&ui engan meli&at well  terak&ir   terak&ir paa mikr'plate,  paa pengen/eran tertinggi $end point % "ang menunjukkan aan"a &emaglutinasi  p'siti+. Hal itu itanai engan aan"a agregatagregat i asar sumur.8 )ji HA igunakan untuk mengeta&ui titer aal antigen "ang akan igunakan alam uji &am#at &am#atan an &emagl &emagluti utinas nasii $uji $uji HI%. Selain Selain itu juga juga iguna igunakan kan untuk untuk retitr retitrasi asi anti antige gen n eng engan an tuju tujuan an mema memasti stika kan n tite titerr anti antigen gen "ang "ang igu iguna naka kan. n. 7 Titer  &emaglutin &emaglutinasi asi HA, "aitu pengen/eran pengen/eran !irus tertinggi tertinggi "ang apat men"e#a#ka men"e#a#kan n &emaglutinasi t'tal, semakin tinggi pengen/eran !irus maka akan semakin ke/il kekuatan !irus untuk men"e#a#kan &emaglutinasi t'tal. 7

E. Ala+ Ala+ 1a, 1a, bah baha, a, $. Alatalat "ang igunakan paa praktikum ini "aitu

i. ii. ii.

Mikr Mikr'p 'pla late te $96 $96 ell ell%% en enga gan n asa asarr * Mikr Mikr'p 'pip ipet et 25:l 25:l an an 100:l 00:l..

iii.

;ell' tip

i!.

Timer3jam

!.

Waa& pem#uangan

2. Ba&an#a&a Ba&an#a&an n "ang "ang igunakan igunakan paa praktikum praktikum aala& i. ii.

Sel ar araa& mer meraa& $S $SM% a" a"am Suspensi !irus H1-1

iii.


F. /ara ker&a $. Alat an #a&an "ang akan igunakan isiapkan terle#i& a&ulu. ". Menggunakan AP $Alat Pelinung iri% engan lengkap an #enar. 3. itam#a&kan 50:l larutan PBS paa mikr'plate well B1 s. H1 4. itam#a&kan 50:l larutan PBS paa mikr'plate well B2 s. H2 5. itam#a&kan 100:l antigen paa mikr'plate well A1 an A2 %. itam#a&kan 50 :l larutan PBS paa mikr'plate well  A an A $ se#agai

k'ntr'l% 6. ilakukan pengen/eran #erseri paa suspensi !irus H1-1, "aitu a. ari mikr'plate well A1 iam#il 50:l suspensi !irus H1-1, kemuian

ipina&kan ke well B1 i&'m'genkan= ari well B1 iam#il 50:l suspensi !irus H1-1, an ipina&kan ke well >1 i&'m'genkan, an  pengen/eran iatas ilakukan seterusn"a sampai ke well H1, setela& suspensi paa well H1 &'m'gen, iam#il 50:l an i#uang. b. ari mikr'plate well A2 iam#il 50:l suspensi !irus H1-1, kemuian

ipina&kan ke well B2 i&'m'genkan= ari well B1 iam#il 50:l suspensi !irus H1-1, an ipina&kan ke well >2 i&'m'genkan, an  pengen/eran iatas ilakukan seterusn"a sampai ke well H2, setela& suspensi paa well H2 &'m'gen, iam#il 50:l an i#uang. 7. Mikr'plate paa well A1 s. H1= A2 s. H2= an A s. A iisi engan

50:l SM. 8. Mikr'plate ig'"ang untuk men/ampurkan semua /ampuran SM engan

suspensi H1-1 $#. Mikr'plate iinku#asi selama 0menit s. 60menit, paa su&u ruang $22 0

250>%. $$. Mikr'plate paa well   k'ntr'l iamati untuk meli&at apaka& SM tela&

mengenap semua $". iamati &asil reaksi paa semua well mikr'plate, an &asiln"a i/atat

G. 'a-il 0rak+iku

$. Interpretasi &asil

P'siti+ $?%

 Terjai aglutinasi 3 SM alam #entuk terlarut $B%

 -egati+ $%

 Terjai pengenapan SM $A%

Gabar ": Interpretasi Hasil )ji HA

Titer HA !irus in"atakan se#agai nilai ke#alikan ari pengen/eran tertinggi antigen $!irus% "ang masi& menim#ulkan reaksi aglutinasi $p'siti+%.

". Hasil

Paa praktikum uji HA iapatkan &asil, se#agai #erikut

Gabar 3: Hasil praktikum uji HA

@'ntr'l

1

2

ari gam#ar uji HA iatas $gam#ar %, isajikan alam #entuk ta#el, se#agai #erikut Tabel $. Hasil praktikum uji HA $

"

K2,+r2l

K2,+r2l

A $Pengen/eran 1%

?

?





B $Pengen/eran 132%

?

?

/ $Pengen/eran 13%

?

?

D $Pengen/eran 138%

?

?

E $Pengen/eran 1316%

?

?

F $Pengen/eran 132%





G $Pengen/eran 136%





' $Pengen/eran 13128%





16HA)

16HA)

Well 

Hasil

'. Pebaha-a,

Titer anti#'i aala& pengen/eran tertinggi "ang menunjukkan aglutinasi atau presipitasi, untuk menentukan titer anti#'i apat i#uat pengen/eran serial serum, an selanjutn"a itam#a&kan sejumla& antigen "ang k'nstan an /ampuran larutan terse#ut iinku#asi an iperiksa untuk aglutinasi atau  presipitasi.

Paa praktikum ini ilakukan uji &emaglutinasi paa suspensi antigen $!irus H1-1%, tujuan ari uji HA ini aala& untuk mengukur titer HA seiaan !irus "ang akan igunakan untuk uji &am#atan aglutinasi $HI%. Se#ua& suspensi !irus apat mengaglutinasi sel ara& mera&, se&ingga men/ega& !irus menetap an keluar ari suspensi. Sisi partikel !irus "ang spesi+ik apat  #erinteraksi engan resept'r muk'pr'tein paa sel ara& mera& an  permukaan sel lain. Interaksi ari sisi resept'r an !iri'n mem#uat aglutinasi sel ara& mera& menjai tampak. ari &asil pengamatan, iamati reaksi p'siti+ paa uji HA, imana titer  apat in"atakan se#agai ke#alikan ari pengen/er tertinggi !irus "ang masi& menim#ulkan reaksi aglutinasi $p'siti+%. Paa well A1 s. 1, masi& terapat aglutinasi, "ang #erarti paa pengen/eran !irus tertingggi, "aitu paa well 1 $1316% !irus masi& mampu mengaglutinasi SM, paa well A2 s. 2 "ang  #erarti paa pengen/eran !irus tertingggi, "aitu paa well 2 $1316% !irus masi& mampu mengaglutinasi SM, masi& terapat aglutinasi= an well A an A ter#entuk enapan SM, "ang #erarti tiak terapat aglutinasi SM, karena tiak aa !irus paa well A an A, an perlu iingat, #a&a well A an A merupakan k2,+r2l ,e*a+i9 , "ang #er+ungsi untuk mengk'ntr'l  pengerjaan uji HA ter&inar ari kesala&an an k'ntaminasi, #aik ari alat an #a&an praktikum "ang kita gunakan. Aapun +akt'r+akt'r "ang mempengaru&i &asil uji HA aala& ketelitian aktu, k'ntaminasi kimia ari ta#ung, pipet atau #a&an, kelainan ari sel ara& mera& ari ini!iu tertentu, kesala&an pengen/eran atau pemipetan, atau pipet "ang #elum terkali#rasi. ai &asil uji HA ini menapatkan &asil, "aitu $%'AU $HemAglutinasi )nit%.

I. Ke-i0ula,

Hasil titer HA !irus H1-1, aala& 16 HA).

PRAKTIKUM "

U&i 'eA*lu+i,a-i Inhibition ('I)

A. 'ari 1a, +a,**al

(a#u, 16 Maret 2016, Pukul 11.00 WIB

B. Tu&ua,

Praktikum ini #ertujuan, untuk mengeta&ui tingkat keke#alan atau titer  anti#'i ter&aap !irus in+luen4a3H1-1.

/. Pri,-i0

Anti#'i ari pasien akan mengikat !irus an akan meng&am#at  penempelan !irus paa sel ara& mera&, se&ingga aglutinasi tiak ter#entuk. A,+i*e, (iru- '$N$) ; A,+ib21i -0e-i9ik < K20lek- a,+i*e,a,+ib21i K20lek- a,+i*e,a,+ib21i ; SDM < Pe,*e,1a0a, SDM

am#ar .Prinsip )ji HI

D. La,1a-a, +e2ri

*iri'n ari #e#erapa keluarga !irus #erikatan engan sel ara& an men"e#a#kan &emaglutinasi. Bila anti#'i spesi+ik an antigen !irus i/ampur se#elum itam#a&i sel ara& mera&, &emaglutinasi akan i&am#at. )ji peng&am#atan &emaglutinasi tern"ata sensiti+ $ke/uali untuk t'ga!irus% an sangat spesi+ik, karena uji itu mengukur anti#'i "ang #erikatan paa  pr'tein permukaan "ang mua& mengalami peru#a&an antigenik. Selain itu, uji ini seer&ana mengienti+ikasi is'lat ari !irus "ang men"e#a#kan &emaglutinasi.8 Be#erapa !irus mampu mengaglutinasikan sel ara& mera&. @emampuan ini se#agai /'nt'& ari akti!itas #i'l'gik an akti!itas ini apat i&am#at 'le& anti#'i tertentu. Sisi partikel !irus "ang spesi+ik apat  #erinteraksi engan resept'r muk'pr'tein paa sel ara& mera& an  permukaan sel lain. Interaksi ari sisi resept'r an !iri'n mem#uat aglutinasi sel ara& mera& menjai tampak. n4im !irus neuraminiase meme/a& ikatan

antara !irus an sel, an melepas keuan"a ke alam larutan. Antigen aala&  #agian !irus "ang menganung ikatan an antigen ari !irus igunakan untuk  uji &emaglutinasi.9 Tes

aglutinasi apat im'i+ikasi untuk pemeriksaan antigen "ang

terlarut, tes ini ise#ut &emaglutinasi in&i#isi, ise#ut &emaglutinasi in&i#isi karena apat mengukur kemampuan antigen "ang terlarut untuk meng&am#at aglutinasi antara antigen engan eritr'sit 'le& anti#'i. ika sempel menganung antigen, antigen terlarut akan #ersaing engan eritr'sit untuk   #erikatan engan anti#'i, se&ingga meng&am#at aglutinasi sel ara& mera& engan menipiskan atau mengen/erkan sampel, ana apat meng&itung  jumla& antigen melalui titer paa sempel "ang #elum iketa&ui. Hemaglutinasi in&i#isi

merupakan

"ang

iinuksikan 'le&

!irus

se#agai

pr'seur 

untuk mengienti+ikasi &emaglutinasi 'le& !irus atau met'e untuk mengukur  kensentrasi ari antigen terlarut alam spesimen #i'l'gis, imana spesimen iinuksi engan anti#'i "ang spesi+ik an kemuian engan eritr'sit. 10 Anti#'i spesi+ik ter&aap &emaglutinin !irus apat meng&am#at terjain"a

&emaglutinasi.

 peng&am#atan

ini

)ji

kemuian

"ang

igunakan

ise#ut

uji

untuk

meli&at reaksi

&am#atan

&emaglutinasi

$ Haemagglutination Inhibition, HI Test %. (eaksi &am#atan &emaglutinasi ini apat igunakan untuk mem#antu iagn'sis la#'rat'rium alam melakukan ienti+ikasi !irus serta apat igunakan untuk mengukur titer anti#'i ari &asil !aksinasi.7 Se/ara #a&asa haemagglutination inhibition apat iartikan se#agai &am#atan

&aemaglutinasi,

seangkan

&aemaglutinasi

merupakan

 penggumpalan ari sel ara& mera&. @emampuan mengaglutinasi tiak  imiliki 'le& semua !irus atau #akteri "ang men"erang a"am tetapi &an"a  #e#erapa !irus an #akteri "ang memiliki 4at &aemaglutinin, iantaran"a  paramyxovirus $-%, poxvirus $P'C%, adenovirus $S%, orthomyxovirus $AI%,  #akteri  ycoplasma sp.,  Haemophilus paragallinarum, an Salmonella  pullorum. Dat &aemaglutinin "ang terapat alam tu#u& !irus atau #akteri terse#ut #ersi+at antigenik "ang apat merangsang ter#entukn"a anti#'i spesi+ik. Anti#'i "ang ter#entuk terse#ut memiliki kemampuan mengam#at

terjain"a aglutinasi ara& "ang ise#a#kan 'le& &aemaglutinin ari !irus atau  #akteri. Prinsip ari uji HI lam#at, aala& mengeta&ui aan"a anti#'i "ang mampu meng&am#at pr'ses &emaglutinasi 'le& !irus. )ji ini untuk  menentukan titik anti#'i ter&aap &emaglutinasi !irus. Bila terapat anti#'i alam jumla& men/ukupi untuk mem#entuk k'mpleks engan !iri'n, &emaglutinasi i&am#at, an eritr'sit mengenap. Se#alikn"a #ila anti#'i terapat alam jumla& "ang tiak men/ukupi maka eritr'sit iaglutinasi 'le& !irus an mem#entuk enapan. 11 Hemaglutinasi 'le& !irus apat i&itung an i#aa& k'nisi stanar  alam /airan apat ili&at. (eaksi HA apat i&am#at 'le& serum immune $anti#'i% "ang spesi+ik. Be#erapa strain !irus apat itunjukkan !irulensin"a alam akti!itas HA engan eritr'sit mammalia an alam panas "ang sta#il. Antigen "ang tiak signi+ikan tiak apat ilap'rkan. 12

E. Ala+ 1a, baha, $. Peralatan "ang igunakan paa praktikum aala&

i.

Mikr'plate engan asar *.

ii.

Mikr'pipet 25:l an 100:l.

iii.

;ell' tip.

i!.

Timer3am

!.

Waa& pem#uangan.

". Ba&an#a&an "ang igunakan paa praktikum aala&

i. ii.

Sel ara& mera& $SM% a"am. Anti#'i spesi+ik ter&aap !irus H1-1 $ari serum ra##it, "ang iinjeksi !irus H1-1%.

iii.

Anti#'i n'rmal $ari serum ra##it, "ang tiak iinjeksi !irus H1-1%.

i!.

Suspensi !irus H1-1 $"ang tela& ilakukan pengen/eran sesuai engan &asil uji HA "ang se#elumn"a ikerjakan%.

!.


F. /ara ker&a

1. isiapkan alat an #a&an "ang akan igunakan. 2. Menggunakan AP $Alat Pelinung iri% engan lengkap an #enar. . Pemeriksaan uji HI, "aitu a. Paa mikr'plate well B1 s. H1 an B2 s. H2 iisi engan 25:l larutan PBS.  #. Paa mikr'plate well B5 s. H5 an B6H6 iisi engan 25:l larutan PBS. /. Paa mikr'plate well A an A iisi engan 50:l larutan PBS $se#agai k'ntr'l%. . itam#a&kan 50:l serum p'siti+ paa well   A1 an A2, serta 50:l serum negati+ paa well  A5 an A6 e. Pengen/eran #ertingkat paa suspensi serum3anti#'i p'siti+, "aitu 1. ari

mikr'plate

paa

well

A1

iam#il

25:l

suspensi

serum3anti#'i p'siti+, an ipina&kan ke well B1 i&'m'genkan= ari well B1 iam#il 25:l suspensi serum3anti#'i p'siti+, an ipina&kan ke well >1 i&'m'genkan, an pengen/eran iatas ilakukan sampai ke well H1, setela& suspensi paa well H1 &'m'gen, iam#il 25:l an i#uang. 2. ari

mikr'plate

paa

well

A2

iam#il

25:l

suspensi

serum3anti#'i p'siti+, an ipina&kan ke well B2 i&'m'genkan= ari well B2 iam#il 25:l suspensi serum3anti#'i p'siti+, an ipina&kan ke well >2 i&'m'genkan, an pengen/eran iatas ilakukan sampai ke well H2, setela& suspensi paa well H2 &'m'gen, iam#il 25:l an i#uang. +. Pengen/eran #ertingkat paa suspensi serum3anti#'i negati+, "aitu 1. ari

mikr'plate

serum3anti#'i

paa

well

A5

iam#il

negati+,

an

ipina&kan

25:l ke

suspensi well

B5

i&'m'genkan= ari well B5 iam#il 25:l suspensi serum3anti#'i negati+, an ipina&kan ke

well >5 i&'m'genkan, an

 pengen/eran iatas ilakukan sampai ke well H5, setela& suspensi  paa well H5 &'m'gen, iam#il 25:l an i#uang.

2. ari

mikr'plate

serum3anti#'i

paa

well

A6

iam#il

negati+,

an

ipina&kan

25:l ke

suspensi well

B6

i&'m'genkan= ari well B6 iam#il 25:l suspensi serum3anti#'i negati+, an ipina&kan ke

well >6 i&'m'genkan, an

 pengen/eran iatas ilakukan sampai ke well H6, setela& suspensi  paa well H6 &'m'gen, iam#il 25:l an i#uang. g. Mikr'plate paa well A1H1, A2H2, A5H5 an A6H6 itam#a&kan engan 25:l suspensi !irus H1-1 8HA)= iinku#asi paa su&u ruang $25'>%, selama 0 menit. &. Mikr'plate paa well A1H1, A2H2, A, A, A5H5 an A6H6, itam#a&kan engan 50:l SM, kemuian i/ampur engan #aik  i.

Mikr'plate iinku#asi selama 0menit s. 60menit, paa su&u ruang $250>%.

 j.

Mikr'plate iamati, i#a/a &asil reaksi "ang ter#entuk paa aktu inku#asi iatas3paa saat well k'ntr'l sua& ter#entuk enapan, an i/atat.

k. Mem#ersi&kan alat an #a&an "ang igunakan paa praktikum.

G. 'a-il 0rak+iku $. Interpretasi &asil

P'siti+ $?%

 Tiak aa aglutinasi 3terjai pengenapan SM3 &am#atan aglutinasi $>%

 -egati+ $%

 Terapat aglutinasi 3 tiak aa enapan SM $B%

Gabar 5: Interpretasi Hasil )ji HI

Titer HI $anti#'i spesi+ik% in"atakan se#agai ke#alikan ari  pengen/eran tertinggi anti#'i spesi+ik "ang masi& apat mengikat antigen3!irus H1-1, se&ingga ter#entuk enapan SM se/ara sempurna.

". Hasil

Paa praktikum uji HI iapatkan &asil, se#agai #erikut

Gabar %: Hasil praktikum uji HI

ari gam#ar uji HI iatas $gam#ar 6%, isajikan alam #entuk ta#el, se#agai #erikut Well 

A $Pengen/eran 1%

Tabel 3. Hasil praktikum uji HI 4 $ " 3 Seru=A,+ib21i K2,+r2l P2-i+i9  ? ? ? ?

5

%

Seru=A,+ib21i ,e*a+i9 





B $Pengen/eran 132%

?

?





/ $Pengen/eran 13%

?

?





D $Pengen/eran 138%

?

?





E $Pengen/eran 1316%

?

?





F $Pengen/eran 132%









G $Pengen/eran 136% ' $Pengen/eran













13128% Hasil I. Pebaha-a,





E 128

E 128

Prinsip HI aala& engan uji ini i&arapkan reaksi aglutinasi ari !irus an SM apat i/ega& engan anti#'i spesi+ik "ang terapat alam serum. Paa uji HI ini kita meli&at reaksi anti#'i ter&aap &emaglutinasi !irus, #ila terapat anti#'i alam jumla& "ang /ukup untuk mem#entuk k'mpleks engan !iri'n !irus, &emaglutinasi SM akan i&am#at, se&ingga terjai  pengenapan SM $(eaksi P'siti+%, se#alikn"a #ila anti#'i terapat alam  jumla& "ang tiak /ukup maka SM akan iaglutinasi 'le& !irus an tiak  ter#entuk enapan $(eaksi negati+%. ari &asil pengujian ini, iamati paa titer serum3anti#'i p'siti+ paa uji HI, imana titer apat in"atakan se#agai ke#alikan ari pengen/er tertinggi serum3anti#'i p'siti+ "ang masi& apat #erikatan engan !irus H1-1, se&ingga akan ter#entuk enapan SM iasar well! Hasil P'siti+ iapatkan paa well A1 s. 1an A2 s. 2 imana terapat enapan SM iasar well , "ang #erarti serum3anti#'i spesi+ik   #erikatan engan !irus H1-1. Hasil P'siti+ juga terli&at paa well k'ntr'l $A an A%, "ang #erisi SM tanpa antigen an anti#'i, terjai  pengenapan SM . Hasil negati+ iapatkan paa well A5 s. H5 an A6 s. H6 imana tiak  ter#entuk enapan SM i asar well , "ang ise#a#kan karena aan"a aglutinasi SM, karena terjai ikatan antara SM an !irus H1-1. Aglutinasi ini terjai ise#a#kan karena tiak aa3kurangn"a anti#'i spesi+ik ter&aap !irus H1-1. Paa pengerjaan praktikum ini, perlu iteruskan pengen/eran #erseri ari serum3anti#'i spesi+ik untuk menapatkan &asil titer serum3anti#'i spesi+ik  "ang se#enarn"a. Paa praktikum ini, pengerjaan uji HA ilakukan se/ara

upl', &al ini untuk meningkatan ketelitian pengerjaan, se&ingga &asil "ang iapatkan le#i& akurat. Pengen/aran serum3anti#'i spesi+ik perlu ilakukan untuk menapatkan &asil titer serum3anti#'i spesi+ik "ang se#enarn"a. Paa praktikum ini iapatkan &asil uji HI, "aitu $%. !. Ke-i0ula,

Hasil titer uji HI $anti#'i spesi+ik ter&aap !irus H1-1%, aala& 16.

PRAKTIKUM 3

U&i Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)

A. ak+u Pelak-a,aa,

Selasa s. (a#u, 10 s. 11 Maret 2015, Pukul 11.00 WIB s. selesai

B. Tu&ua,

Praktikum ini #ertujuan, untuk 'ptimasi k'nsentrasi anti#'i untuk   pengem#angan sistem 
/. Pri,-i0

"oated antigen $pr'tein M% ? Anti#'i spesi+ik pr'tein M F Inku#asi ? anti anti#'i spei+ik pr'tein M #erla#el #i'tin F Inku#asi ? n4im $Strepta!iineH(P% ? su#tra/t $Gp&en"leneiamine% F ter#entuk arna F iukur paa elisa reader engan 90nm.

Gabar 6: Pr'ses interaksi paa 
D. La,1a-a, +e2ri $. Pengertian

 #n$yme%&inked Immunosorbent 'ssay $
Penggunaan 
se/ara langsung 'le& anti#'i sekuner "ang #erikatan engan

en4im melalui #i'k'njugasi. iantara tiap ta&ap, plate &arus i/u/i engan larutan eterjen lem#ut untuk mem#uang kele#i&an pr'tein atau anti#'i "ang tiak terikat. Setela& ta&ap pen/u/ian terak&ir, alam plate itam#a&kan su#strat en4imatik untuk mempr'uksi sin"al "ang visibel , "ang menunjukkan kuantitas antigen alam sampel. 
Teknik pengerjaan relati+ seer&ana. (elati+ ek'n'mis $karena jenis anti#'i "ang igunakan &an"a satu saja, se&ingga meng&emat #ia"a untuk mem#eli #an"ak jenis anti#'i%.

iii.

Hasil memiliki tingkat sensiti!itas "ang /ukup tinggi.

i!.

apat igunakan untuk meneteksi ke#eraaan antigen, meskipun kaar antigen terse#ut sangat rena& $&al ini ise#a#kan si+at interaksi antara anti#'i atau antigen "ang #ersi+at sangat spesi+ik%.

!.

apat igunakan alam #an"ak ma/am pengujian.

@ekurangan teknik 
enis anti#'i "ang apat igunakan paa uji engan teknik 
ii.

Harga anti#'i m'n'kl'nal relati+ le#i& ma&al aripaa anti#'i  p'likl'nal, se&ingga pengujian teknik 
iii.

Paa #e#erapa ma/am teknik 
i!.

(eaksi antara en4im signal an su#strat #erlangsung relati+ /epat, se&ingga

pem#a/aan

&arus

ilakukan

engan

/epat

$paa

 perkem#angann"a, &al ini apat iatasi engan mem#erikan larutan untuk meng&entikan reaksi%. 2. TeknikTeknik 
 *irect  
Gabar 7: *irect 
ii.

 Indirect  
Gabar 8: Indirect 
iii.

Sandwich 
direct+ ini /enerung

ik&ususkan paa antigen memiliki minimal ua sisi antigenik $sisi interaksi engan anti#'i% atau antigen "ang #ersi+at multivalent , seperti  p'lisakaria atau pr'tein. Paa  sandwich 
pengaplikasiann"a,  sandwich


le#i&

#an"ak 

iman+aatkan untuk meneteksi ke#eraaan antigen multivalent "ang kaarn"a sangat rena& paa suatu larutan engan tingkat k'ntaminasi tinggi. Hal ini ise#a#kan sandwich 
Gabar $#: Sandwich 
i!.

"ompetitive 
Gabar $$: "ompetitive 
E. Ala+ 1a, baha, $. Peralatan "ang igunakan paa praktikum aala&

i. ii.

Mikr'plate 
iii.


i!.

Inku#at'r  

!.

;ell' tip.

!i.

Timer3am.

!ii. !iii.

Pipet Waa& pem#uangan.

". Ba&an#a&an "ang igunakan paa praktikum aala&

i. ii.

"oated% Antigen $pr'tein M% 25:g3m< $tela& isiapkan se#elumn"a% Anti#'i 1, "aitu a. Anti#'i spesi+ik ter&aap pr'tein M  #.

Anti#'i tiak spesi+ik ter&aap pr'tein M $k'ntr'l%,

iii.

-ashing buffer $PBS Teen 0,05J%.

i!.

 Blocking solution $Skim milk 5J%.

!. !i. !ii. !iii. iC.

Anti#'i 2, "aitu anti#'i anti ra##it #erla#el #i'tin 1310000 Strepta!iineH(P $1320000%. Su#strate GP $.%phenylenediamine%. Stop solution $H2SG  2,5-% @ertas tissue

F. /ara ker&a

1.  $Mela#el ell% Mikr'plate iisi "oated% Antigen $pr'tein M% paa ell uji A1A12, B1B12, >1>12, 112

an ell k'ntr'l K1 an K2

engan k'nsentrasi 25 :g3m<. Antigen ilarutkan alam >ar#'nate >'ating Bu++er, pH 9,6 $0,15 M s'ium /ar#'nat= 0,5 M s'ium  #i/ar#'nate= 0,0 M s'ium a4ie%. Mikr'plate iinku#asi 7 '>, selama 1  jam 2. $Pen/u/ian% Mikr'plate i/u/i se#an"ak ua kali menggunakan washing  buffer .

. $Bl'/king% Mikr'plate iisi blocking solution se#an"ak 70 :<. Mikr'plate iinku#asi 7'>, selama 1 jam. . $Pen/u/ian% Mikr'plate i/u/i se#an"ak ua kali menggunakan washing buffer . 5. $Penam#a&an anti#'i 1% 150 :< ien/erkan engan 150 :< dilution buffer $0,1 skim milk alam PBS%. Selanjutn"a anti#'i ien/erkan mulai ari 132= 13= 138= an seterusn"a engan pengen/er PBS $pengen/eran  #erseri%. 50 :< anti#'i #er#agai k'nsentrasi itam#a&kan ke alam ell. Anti#'i paska !aksinasi itam#a&kan alam alam ell A an B, seangkan anti#'i k'ntr'l negati+ alam ell > an . Mikr'plate iinku#asi engan su&u  '>, selama semalam. 6. $Pen/u/ian% Mikr'plate i/u/i se#an"ak ua kali menggunakan washing  buffer . $Penam#a&an anti#'i 2% 50 :< anti#'i anti ra##it #erla#el #i'tin 7. 131000 itam#a&kan i setiap ell uji 8.  $Pen/u/ian% Mikr'plate i/u/i se#an"ak ua kali menggunakan washing  buffer . 9. $Penam#a&an Strepta!iineH(P% 50 :< Strepta!iineH(P $horseradish  peroksidase% alam PBS 135000 itam#a&kan ke setiap ell uji. Mikr'plate iinku#asi 7 '>, selama 1 jam. 10. $Pen/u/ian% Mikr'plate i/u/i se#an"ak ua kali menggunakan washing buffer . 11. $Penam#a&an

su#strat

GP%

50

:<

Su#strat

GP

$G

 p&en"leneiamine% itam#a&kan ke ell. GP i#uat engan melarutkan 10 mg GP alam 10 m< #u++er su#strat itam#a& 20 :< H 2G2 J. Mikr'plate iinku#asi alam su&u ruangan sekitar 15 menit. 12. $St'p s'luti'n% 25 :< H 2SG 2,5 M itam#a&kan paa setiap ell. 1. $Pem#a/aan &asil% Ba/a a#s'r#ansi larutan "ang ter#entuk alam panjang gel'm#ang 90 nm. $4. $Analisis ata% Berasarkan &asil a#s'r#ansi, i#uat kur!a setiap  pengen/eran antigen engan pr'gram eC/el. Sum#u L pengen/eran, sum#u ; anti#'i '. 'a-il 0rak+iku

Paa praktikum uji 
Gabar $": Hasil praktikum uji 
Setela& i#a/a paa 
A B C D E  ! "

1 0.32 5 0.36 9 0.04 9 0.04 8 0.04 8 0.04 6 0.04 3 0.05 6

2 0.37 1 0.42 9 0.04 6 0.04 5 0.04 4 0.05 3 0.03 9 0.05 8

3 0.35 3 0.38 5 0.04 4 0.04 5 0.03 9 0.03 7 0.04 0.04 4

4 0.27 5 0.33 0.04 3 0.04 9 0.03 8 0.03 7 0.03 7 0.04

5 0.53 1 0.33 8 0.04 3 0.04 4 0.04 6 0.03 8 0.03 8 0.03 5

6 0.13 1 0.32 0.04 4 0.05 0.03 6 0.03 8 0.03 7 0.03 8

7 0.21 1 0.27 4 0.04 2 0.05 8 0.04 7 0.03 9 0.03 9

8 0.23 5 0.19 4 0.04 1 0.04 6 0.04 1 0.03 9

0.04

0.04

0.04

9 0.15 5 0.12 8 0.04 4 0.04 8 0.03 6 0.04 5 0.03 9 0.04 8

10 0.05 9 0.08 6 0.04 3 0.04 7 0.03 7 0.04 5 0.05 7 0.05 4

11 0.06 1 0.06 6 0.04 8 0.04 9 0.03 6 0.04 0.04 3 0.05 7

12 0.04 9 0.05 4 0.04 6 0.04 8 0.03 6 0.04 3 0.04 5 0.04 1

1:10 24 0.07 3 0.04 5 0.04 5

1:20 48 0.06 4 0.04 9 0.04 0

Ta#el . Hasil pengukuran paa 
positi f  negat if  kontr ol

1:2 0.34 7 0.04 9 0.04 6

1:4 0.40 0 0.04 6 0.05 3

1:8 0.36 9 0.04 5 0.03 7

1:16 0.30 3 0.04 6 0.03 7

1:32 0.43 5 0.04 4 0.03 8

1:64 0.22 6 0.04 7 0.03 8

1:12 8 0.24 3 0.05 0 0.03 9

1:25 6 0.21 5 0.04 4 0.03 9

1:51 2 0.14 2 0.04 6 0.04 5

Ta#el 5. -ilai (atarata Pem#a/aan engan Mir/'plate (eaer 

1:40 96 0.05 2 0.04 7 0.04 3

1#2

1#4

positi f 0.2975 negat if $0.0005 %ata$ %ata kontrol

1#8 0.36 9 0.04 5

0.4 0.04 6

1#16 0.30 3 0.04 6

1#32 0.43 5 0.04 4

1#64 0.22 6 0.04 7

1#12 8 0.24 3 0.05

1#25 6 0.21 5 0.04 4

1#51 2 0.14 2 0.04 6

1#102 4

1#204 8

1#409 6

0.073

0.064

0.052

0.045

0.049

0.047

0.0495

Ta#el 6. Hasil Pengurangan -ilai (atarata engan (atarata @'ntr'l

ari ta#el iatas , isajikan alam #entuk gra+ik, se#agai #erikut

!ra&k E'()A 0.5 0.4 0.3

,D 490n-

0.2 0.1 0 $0.1

*engen+eran positif

negatif

kontrol

Gra9ik $: A#s'r#ansi anti#'i paa #er#agai titer pengen/eran

I. Pebaha-a,

Paa praktikum ini menggunakan teknik Inire/t 
ari !irus H1-1 $serum p'st !aksinasi% an serum "ang tiak menganung anti#'i spesi+ik ter&aap !irus H1-1 $serum "ang tiak i!aksinasi%. Mikr'plate paa well A1 s. A12, B1 s. B12, >1 s. >12, 1 s. 12, K1 an K2 tela& iisi engan 60:l larutan "oated% Antigen $pr'tein M% 25:g3m<, an

iinku#asi

7'>,

selama

60

menit.

Ba&an

plate

p'l"st"rene

memungkinkan untuk antigen apat menempel engan #aik i asar well  mikr'plate. Mikr'plate kamuian i/u/i se#an"ak tiga kali menggunakan washing  buffer . Hal ini #ertujuan untuk mem#ersi&kan "oated%Antigen $pr'tein M% "ang tiak apat menempel engan #aik iasar well apat i&ilangkan, an untuk meng&ilangkan gelem#ung "ang ter#entuk i asar well   "ang apat mengganggu pem#a/aan &asil  selama 1 jam agar terjai reaksi "ang 'ptimal. Paa ta&apan penam#a&an anti#'i 2 $"aitu anti#'i anti ra##it #erla#el  #i'tin%, #ertujuan agar anti#'" 2 terse#ut apat #erikatan se/ara spesi+ik  engan anti#'i pertama. Inku#asi agar apat terjai interaksi "ang 'ptimal. Ta&apan washing+ setela& inku#asi #ertujuan, mem#ersi&kan anti#'i 2 "ang tiak #erikatan engan anti#'i 1, selain itu ta&apan washing  juga &arus meng&ilangkan gelem#ung uara "ang aa iasar well "ang terjai paa tiap  pr'ses ta&apan pengerjaan uji 
itam#a&kan $Strepta!iineH(P%. n4im H(P $ Horseradish Peroxidase/ "ang #erikatan engan pr'tein Strepta!iine $ari Strept'/'//us a!iin% mem#entuk

k'mpleks Strepta!iineH(P. Ikatan m'lekul #i'tin an

strepta!iine merupakan ikatan n'nk'!alen "ang kuat an spesi+ik, seangkan en4im H(P merupakan en4im "ang akan mengkatalisis su#strat, alam praktikum ini .%phenylenediamine> "ang meng&asilkan pr'uk "ang menim#ulkan k'mpleks arna $kuning%. Paa penam#a&an su#strat reaksi arna segera ter#entuk, se&ingga &arus segera itam#a&kan  stop solution $H2SG 2,5-%, engan tujuan agar reaksi katalis en4im ter&aap su#trat apat i&entikan $mempengaru&i pH larutan, se&ingga en4im tiak apat #ekerja%,  jika tiak maka su#trat akan ikatalis sampai &a#is 'le& su#trat, se&ingga arna "ang ter#entuk menjai le#i& rena& ari se#enarn"a, "ang akan men"e#a#kan nilai absorbance paa pem#a/aan engan elisa reader menjai  juga rena&. Penggunaan asam kuat $H2SG

2,5-%,

se#agai st'p reaksi,

karena substrate .%phenylenediamine> "ang igunakan #ersi+at #asa, se&ingga apat menetralkan reaksi terse#ut. Intensitas arna "ang ter#entuk akan se#aning engan kaar anti#'i alam sampel "ang iperiksa "ang iukur  a#s'r#ansin"a engan #lisa reader  paa panjang gel'm#ang 90 nm. ari &asil pengamatan, ter#entuk arna kuning tua paa well   "ang #erisi anti#'i spesi+ik antigen3pr'tein M ari !irus H1-1 $well A1, B1% "ang semakin ke kanan $ari well A2A12, an B2B12% terjai graasi arna le#i& /era& $ari kuning tua ke kuning /era&% seiring engan penurunan titer  anti#'" spesi+ik $ari titer anti#'" 132 sampai 13096%. Paa well   engan anti#'" tiak spesi+ik $>1>12, 112% tiak ter#entuk arna kuning, &al ini ikarenakan anti#'" 1 tiak #erikatan se/ara spesi+ik engan antigen, se&ingga anti#'" 2 juga #erikatan engan anti#'" 1 an su#trat tiak #isa  #ereaksi engan en4im se&ingga tiak ter#entuk k'mpleks arna. Hasil negati+ juga terjai paa well  k'ntr'l $K1,K2% karena tiak terapat anti#'i. Paa pem#a/aan engan 
tiak #erisi anti#'i spesi+ik menanakan titik 'ptimasi. Paa praktikum ini iapatkan paa titer pengen/eran anti#'i 13 $ Mean a#s'r#ansi anti#'i spesi+ik  0400 mean a#s'r#ansi anti#'i n'nspesi+ik 0.046 selisi&  0.354 /. alam pengerjaan 
0,05, pengen/eran 13512%, nilai

a#s'r#ansin"a terlalu rena& $jau& signi+ikan i#aningkan paa well  A5, A8 an A9. Hal ini tentu akan mempengaru&i nilai ratarata a#s'r#ansi paa pengen/eran terse#ut $132, 13256, 13512%, se&ingga paa saat meng&itung a#s'r#ansin"a tiak irata ratakan tetapi iam#il nilai a#s'r#ansi ari well A5, A8 an A9. @esala&an ini terjai karna paa saat pengisian ell upl' mungkin karena ketiaktelitian alam  pengerjaan, pippeting ataupun karena mikr'pipet "ang tiak terkali#rasi. @eepann"a &al ini &arus i#ena&i.

!. Ke-i0ula,

Titer anti#'i "ang #aik paa k'nsentrasi antigen 25g3m< aala& 13.

DAFTAR PUSTAKA

1.

>amp#ell -A, (ee/e B. Bi'l'g". 6 t& e. San Kransis/' Pears'n u/ati'n In/= 2002

2.

Be/ker WM, @leinsmit&<, Harin . T&e W'rl '+ T&e >ell.  t& e. San Kransis/' Ais'n Wesle" <'ngman, In/= 2000

.

S/&legel H, an @ S/&mit.Mikr'#i'l'gi )mum. ;'g"akarta aja& Maa )ni!ersit" Press= 199,

.

Burles'n K, TM >&am#ers, an < Wie#rauk. *ir'l'g" an
5.

Asmara W. Peran Bi'l'gi M'lekuler alam Pengenalian A!ian In+luen4a an Klu Burung N Piat' Penguku&an uru Besar Kakultas @e'kteran HeanO. ;'g"akarta )ni!ersitas aja& Maa= 2007.

6.

(a&arj' ;, an -i'm >A. A!ian In+luen4a= Pen/ega&an, Pengenalian an Pem#erantasann"a. Hasil In!estigasi @asus
7.

< Amaliani. Pemeriksaan Hemaglutinasi *irus In+luen4a NinternetO. April 2011 N/ite 26 maret 2016O. A!alai#le +r'm &ttp33lestariamaliani.#l'gsp't./'m320113113pemeriksaan&emaglutinasi !irus.&tml.