LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA SEMESTER GENAP 2015 – 2016 2016
Uji Aktivitas Amilase (Metode Kolorimetri dengan Pereaksi Lugol)
Hari / Jam Praktikum : Selasa / 13.00-16.00 Tanggal Praktikum
: 17 Mei 2016
Kelompok
:5
Asisten
: 1. Alicia Ima Dara 2. Hendita Faradina
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN JATINANGOR 2016
I.
TUJUAN
1.1 Mengetahui aktivitas enzim amilase menggunakan metode kolorimetri dengan pereaksi lugol
II.
PRINSIP
2.1 Absorbansi Merupakan banyaknya cahaya atau energy yang diserap oleh partikel – partikel – partikel partikel dalam larutan ( Martin Mart in , 1983). 2.2 Ikatan Glikosidik Sebuah ikatan kovalen yang terbentuk antara molekul karbohidrat dan molekul lain (dalam hal ini antara dua monosakarida) dikenal sebagai ikatan glikosidik (Sridianti , 2016). 2.3 Metode Kolorimetri Suatu teknik pengukuran yang berdasarkan diabsorbsina cahaya oleh zat bewarnanya baik warna yang berasal dari zat itu sendiri maupun warna yang terbentuk akibat reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990). 2.4 Metode Caraway-Somogyi Metode yang berdasarkan pada daya reduksi sederhana terhadap ion tembaga menjadi kuprooksida dan senyawa- senyawa gula lain (Suhardi , 1997).
III.
REAKSI
E +
S
(Enzim)
(Substrat)
[ES]
E
+
(Enzim)
P (Produk)
(Winarno, 1985).
IV.
TEORI DASAR
Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk berbagai reaksi kimia dalam sistem biologik. Hampir tiap reaksi kimia dalam sistem biologis dikatalisis oleh enzim. Sintesis enzim terjadi didalam sel dan sebagian besar enzim dapat diekstraksi dari sel tanpa merusak fungsinya (Sadikin, 2001). Sebagian besar protein dicerna menjadi asam amino, selebihnya menjadi tripeptida dan dipeptida. Pencernaan atau hidrolisis protein di mulai di dalam lambung. Asam klorida lambung membuka gulungan protein (proses denaturasi), sehingga enzim pencernaan dapat memecah ikatan peptida. Asam klorida mengubah enzim pepsinogen tidak aktif yang dikeluarkan oleh mukosa lambung menjadi bentuk aktif pepsin. Makanan hanya sebentar berada di dalam lambung, pencernaan protein hanya terjadi hingga di bentuknya campuran polipeptida, protese dan pepton (Yuniastuti, 2007). Disakarida (di-= “dua”) terbentuk ketika dua monosakarida mengalami reaksi dehidrasi (juga dikenal sebagai reaksi kondensasi atau sintesis dehidrasi). Selama proses ini, gugus hidroksil dari satu monosakarida mengkombinasikan dengan hidrogen dari monosakarida lain, melepaskan molekul air dan membentuk ikatan kovalen. Sebuah ikatan kovalen terbentuk antara molekul karbohidrat dan molekul lain (dalam hal ini, antara dua monosakarida) dikenal sebagai ikatan glikosidik. Ikatan glikosidik (juga disebut glikosidik) dapat dari alpha atau jenis beta (Sridianti, 2016). Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi didalam sel maupun diluar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat dari pada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis ( Poedjadi, 2006). Amilaseadalah enzim yang mengkatalisis pemecahan pati me njadi gula. Enzim amilase terbagi menjadi α-Amilase, β-Amilase, γAmilase. Enzim Amilase merupakan komponen yang sangat penting
pada proses pencernaan makanan. Enzim ini mengubah karbohidrat menjadi gula yang pada akhirnya diubah menjadi ATP. Enzim amilase yang terkandung dalam saliva dapat menghidrolisis ikatan 1,4glikosidik yang terdapat dalam amilum menghasilkan dextrin, maltosa, dan sejumlah kecil glukosa dengan konfigurasi gula (Endah dan Nafizah, 2011). Amilase
mencerna
karbohidrat
(polisakarida)
menjadi
disakarida yang lebih sederhana, bahkan mengkonversi mereka menjadi monosakarida seperti glukosa. Amilase tidak hanya mencerna karbohidrat, tetapi juga mencerna sel darah putih yang mati (pus). Amilase juga terlibat dalam reaksi antiinflamasi seperti yang disebabkan oleh pelepasan histamine dan zat-zat lain yang serupa. Respon inflamasi biasanya terjadi pada organ yang berhubungan dengan lingkungan luar (Kimball, 1991). Amilase adalah enzim yang dapat memecah (mencerna) zat tepung hidro karbon (nasi, roti, singkong, jagung, terigu, sagu, dan lainlain) menjadi zat tepung lain yang lebih halus dengan tujuan mencernanya, sehingga nantinya dapat diserap oleh dinding usus halus. Hidro karbon seperti nasi, roti, singkong, jagung, terigu, sagu, dan lainlain itu dalam ilmu kimia susunannya disebut polisakarida. Setelah dicerna oleh amilase akan berubah manjadi disakarida, yakni zat tepung yang susunan kimianya lebih sederhana. Bila masuk lambung dan usus akan dicerna lagi menjadi lebih sederhana lagi, menjadi monosakarida, yakni glukosa atau zat gula darah. Itulah sebabnya jika kita makan singkong, dikunya agak lama, akan terasa manis. Hal ini disebabkan karena zat tepung bila dicerna oleh amilase akan menjadi zat yang makin manis rasanya (Machfoedz, 2008). Kolorimetri merupakan metode analisa yang didasarkan pada tercapainya kesamaan besarnya warna antara sampel dengan larutan standar, dengan menggunakan sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. Prinsip dari metode kolorimetri dengan pembandingan warna
yang dihasilkan oleh zat dalam kuantitas yang tak diketahui dengan warna yang sama yang dihasilkan oleh kuantitas yang diketahui dari zat yang
akan
ditetapkan
itu.
Intensitas
warna
kemudian
dapat
dibandingkan dengan yang diperoleh dengan menangani kuantitas yang diketahui dari zat itu (Bassett dkk, 1994). Keuntungan metode kolorimmetri adalah bahwa metode ini memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat. Selain itu hemat biaya tentunya, sedangkan kerugiannya yaitu hanya dapat menentukan kuantitas suatu zat yang sangat kecil (Bassett dkk, 1994). Variasi warna suatu sistem berubah dengan berubahnya konsentrasi suatu komponen, membentuk dasar apa yang lazim disebut analisis
kolorimetrik.
Warna
itu
biasanya
disebabkan
oleh
pembentukan suatu senyawa berwarna dengan ditambahkannya reagensia yang tepat, atau warna itu dapat melekat dalam penyusun yang diinginkan itu sendiri. Intensitas warna kemudian dapat dibandingkan dengan yang diperoleh dengan menangani kuantitas yang diketahui dari zat itu. Kolorimetri dikaitkan dengan penetapan konsentrasi suatu zat denganmengukur absorpsi realtif cahaya sehubungan dengan konsentrasi tertentu zat itu (Bassett dkk, 1994). Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer . Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang di absorpsi. Spektrofotometer bekerja berdasarkan penyerapan sinar yang dihasilkan oleh sampel yang bewarna pada panjang gelombang tertentu. Spektrofotometer dapat mengidentifikasi logam yang ada dalam sampel bila sampel itu bewarna, namum sulit diidentifikasi pada sampel yang tidak menghasilkan perubahan warna atau kadar logam dalam sampel sangat kecil sekali (Praharyawan, 2012).
V.
ALAT DAN BAHAN
5.1 Alat 5.1.1
Batang Pengaduk
5.1.2
Gelas Kimia
5.1.3
Labu Ukur
5.1.4
Mikropipet
5.1.5
Mikroplate
5.1.6
Mikroplate reader
5.1.7
Penangas air
5.1.8
Pipet tetes
5.1.9
Spatel
5.2.1
Amilum
5.2.2
Aquades
5.2.3
Larutan HCl
5.2.4
Larutan Iodium
5.2.5
Larutan Sampel Kubis
5.2 Bahan
5.3 Gambar Alat 5.3.1
Batang Pengaduk
5.3.2
Gelas Kimia
5.3.3
Labu Ukur
5.3.4
Mikropipet
5.3.5
Mikroplate
5.3.6
Mikroplate reader
5.3.7
Penangas air
5.3.8
Pipet tetes
5.3.9
Spatel
VI.
PROSEDUR
Pada pembuatan kurva baku amilase disiapkan microplate reader, kemudian dibuat larutan amilum dari 100 mg amilum dan 20 mL aquades atau setara dengan 5000 ppm. Dimasukkan 100 mikroliter amilum kedalam kolom A1-A3, 20 mikroliter amilum dan 80 mikroliter aquades ke dalam B1-B3, 40 mikroliter amilum dan 60 mikroliter aquades kedalam kolom C1-C3, 60 mikroliter amilum dan 40 mikroliter aquades kedalam kolom D1-D3, 80 mikroliter amilum dan 20 mikroliter aquades kedalam kolom E1-E3, dan 100 mikroliter amilum kedalam kolom F1-F3. Kemudian diinkubasi selama 7 menit dan dibaca absorbansinya pada gelombang 600 nm. Kemudian pada pengujian sampel disiapkan microplate reader kemudian dimasukkan 40 mikroliter kubis dan dimasukkan pada microplate reader kolom D1-D5 lalu setiap kolomnya ditambah 75 mikroliter amilum dan kemudian diinkubasi selama 7 menit. Setelah it u ditambahkan 10 mikroliter HCl dan 20 mikroliter lugol ke dalam tiap sampel. Setelah itu absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 630 nm.
VII.
DATA PENGAMATAN
7.1 Pembuatan Kurva Baku No. 1.
Perlakuan Microplate
reader Microplate reader
disiapkan 2.
Dibuat
Hasil
siap digunakan larutan Larutan
amilum
amilum dari 100 mg
5000 ppm telah
amilum dan 20 mL
dibuat
aquades (5000 ppm)
Foto
3.
Dimasukkan
100
Amilum
dan
amilum aquades
dengan
kedalam kolom A1- berbagai
variasi
mikroliter
A3,
20
mikroliter
amilum
dan
volume
80 berada
telah pada
mikroliter aquades ke microplate reader dalam
B1-B3,
mikroliter dan
60
amilum mikroliter
aquades kolom
kedalam C1-C3,
mikroliter dan
40
amilum
kedalam D1-D3,
mikroliter dan
20
aquades
60
mikroliter
aquades kolom
40
80
amilum mikroliter kedalam
kolom E1-E3, dan 100 amilum
mikroliter kedalam
kolom F1-F3 4.
Diinkubasi selama 7 Baku terinkubasi menit
5.
Dibaca absorbansinya
Didapatkan pada
gelombang 600 nm
nilai
absorbansi: A1= 0,555; A2= 0,479 B1= 0,870; B2= 0,907
C1= 1,017; C2= 0,946 D1= 1,158; D2= 1,019 E1= 1,039; E2= 0,933 F1= 0,905; F2= 1,022
7.2 Uji aktivitas amilase sampel kubis No. 1.
2.
Perlakuan
Hasil
Microplate
Microplate
reader
reader
disiapkan
digunakan
Dimasukkan
Sampel
40
mikroliter berada
sampel pada
kubis
dalam
kolom microplate
D1-D5 3.
siap
Sampel
reader yang Sampel
berada didalam tidak microplate
berubah
ditambahkan
warna
amilum sebanyak
75
mikroliter 4.
Diinkubasi
Sampel
selama 7 menit
terinkubasi
Foto
5.
Dimasukkan 10
Sampel
mikroliter berubah
HCl
dan
20
warna
mikroliter
menjadi
lugol pada tiap
warna ungu
sampel
saat penambahan lugol
6.
Absorbansinya
D1= 1,466
dibaca
D2= 1,409
pada
gelombang
D3= 1,352
630 nm.
D4= 0,879 D5= 1,158
VIII. PERHITUNGAN
8.1 Perhitungan Blanko Absorbansi kolom A1: 0,555 Absorbansi kolom A2: 0,479 Rata-rata absorbansi =
,+,49
= 0,517 ≈ 0,52
8.2 Perhitungan pembuatan amilum dan pengenceran 100 mg/ml = 1 ppm 100 mg/20 ml->100mg/200ml = 5000 ppm Pengenceran: 1 × 1 = 2 × 2
a. 5000 ppm x 20 mikroL=N2 x 100mikroL N2 =1000 ppm b. 5000 ppm x 40 mikroL=N2 x 100 mikroL N2 =2000 ppm. c. 5000 ppm x 60 mikroL=N2 x 100 mikroL N2 = 3000 ppm d. 5000 ppm x 80 mikroL=N2 x 100 mikroL N2 = 4000 ppm 8.3 Pembuatan Kurva Baku Kolom
Absorbansi rata-rata (Sumbu Y)
Konsentrasi amilum (sumbu X)
F
0,96
5000
E
0,99
4000
D
1,09
3000
C
0,98
2000
B
0,89
1000
A
0,52
BLANKO
1,2 1 0,8 0,6 0,4 y = 1E-04x + 0,7867 R² = 0,9967
0,2 0 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Persamaan baku standar amilum : 1×10 -4x + 0,7867 Nilai R2 mendekati satu yaitu 0,9967 sehingga merupakan garis lurus.
8.4 Perhitungan Konsentrasi Amilase Akhir y = 0,0001x + 0,7867 y = Absorbansi sampel – absorbansi blanko a. y= 1,446 - 0,52 = 0,926 b. y= 1,409- 0,52 = 0,889 c. y= 1,352 - 0,52 = 0,832 Dengan rata-ratanya 0,8823 IX.
PEMBAHASAN
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi seb agai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Enzim amilase merupakan enzim yang mampu bertindak sebagai katalis dalam reaksi hidrolisis pati oleh air membentuk gula. Gula merupakan produk konstituen utama dalam industri makanan dan minuman. Enzim amilase merupakan salah satu jenis enzim pencernaan yang dihasilkan oleh kelenjar ludah dalam mulut. Amilase (alfa, beta dan glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Saat ini sejumlah enzim amilae telah diproduksi secara komersial. Penggunaan mikrobia dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh, cepat menghasilkan dan kondisi lingkungan dapat dikendalikan. Amilase hadir pada manusia air liur , di mana ia memulai proses kimia pencernaan . Makanan yang mengandung pati banyak, tetapi sedikit gula, seperti beras dan kentang , rasa sedikit manis karena mereka mengunyah karena ternyata beberapa amilase pati mereka menjadi gula di dalam mulut. Para pankreas juga membuat amilase ( amilase alfa ) untuk menghidrolisis pati makanan menjadi disakarida
dan trisaccharides yang dikonversi oleh enzim lain untuk glukosa untuk memasok tubuh dengan energi. Tumbuhan dan beberapa bakteri juga menghasilkan amilase. Sebagai diastase , amilase adalah enzim pertama yang ditemukan dan diisolasi oleh Anselme Payen pada tahun 1833. Semua amilase adalah hidrolisis glikosida dan bertindak atas α-1, 4 glikosidik. Dalam fisiologi manusia, baik amilase saliva dan pankreas adalah α-Amilase. α-Amilase juga dapat ditemukan pada tanaman yaitu jamur (ascomycetes dan Basidiomycetes) dan bakteri (Bacillus). Bentuk lain dari amilase, yaitu β-amilase yang bisa juga disintesis oleh bakteri , jamur, dan tanaman lain. β-amilase bekerja dengan cara mengkatalisis hidrolisis dari α- 1,4 glikosidik dan membelah menjadi maltosa pada suatu waktu. Selama pematangan dari buah , β-amilase pati pecah menjadi maltosa, sehingga muncul rasa manis dari buah masak. Dalam praktikum biokimia ini dilakukan uji menggunakan sampel yaitu kubis. Kubis mempunyai nama ilmiah yaitu Brassica oleracea L. Memiliki daun yang tersusun sangat rapih dan membentuk bulatan yg pipih. Tanaman ini memiliki kandungan amilum sebesar 3,2 gram tiap 100 gramnya. Dilihat dari kandungan gulanya, kubis dapat berguna sebagai penurun kadar gula dalam tubuh pasien diabetes. Hal ini karena kandungan pada kubis dapat menurunkan kadar gula dalam darah dan mengendalikannya agar tidak naik kembali secara drastis. Cara kerja kubis dalam mengendalikan diabetes yaitu sel beta pankreas akan diperbaiki sehingga pankreas dapat menghasikan zat insulin seperti sediakala. Pengujian aktivitas enzim memiliki satuan yang berbeda tergantung deskripsi dan metode pengujiannya. Hal ini menyebabkan besarnya aktivitas enzim hasil percobaan tidak dapat dibandingkan dengan aktivitas enzim yang tertera pada data enzim produsen.Hal ini bisa terjadi karena jenis kubis juga menentukan persentase kandungan yang ada didalamnya. Selain itu, teknik selama
pengolahan dan penanganan panen juga ikut menentukan. Oleh karena itu terdapat kemungkinan perbedaan kandungan pati antara jenis kubis yang berbeda. Menurut Biogen (2008), amilase dalam kubis merupakan contoh dari enzim β-amilase atau disebut juga α-l,4-glukan malto hidrolase, dimana enzim ini bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti. Membandingkan aktivitas enzim dalam unit yang berbeda mustahil dilakukan karena setiap unit aktivitas enzim memiliki metode dan cara perhitungan yang berbeda.Proses hidrolisis pada reaksi diatas memecah pati menjadi amilosa dan amilopektin. Penambahan amilase akan
memutus
ikatan
α-1,4glikosida
pada
amilosa
sehingga
menghasilkan dekstrin dan apabila reaksi diteruskan amilase akan memutusikatan α-1,4 glikosida pada dekstrin sehingga dihasilkan maltosa dan glukosa. Pengujian
aktivitas
enzim
biasanya
dilakukan
untuk
menentukan aktivitas enzim α-amilase yang telah disimpan terlalu lama. Metode yang digunakan menggunakan bantuan spektrofotometer sebagai alat pengukur absorbansi. Metode untuk analisa enzim amilase di atas memiliki prinsip yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu. Prinsip utama dalam praktikum ini adalah enzim amilase adalah mengambil enzim amilase yang terdapat pada sampel dengan pelarut. Enzim amilase diharapkan dapat larut sempurna padapelarut yang digunakan
Alat yang digunakan adalah Microplate Reader. Microplate reader adalah alat instrumen yang memiliki prinsip kerja yang sama dengan spektrofotometer UV-Vis yaitu bertujuan untuk menganalisis nilai absorbansi. Nilai absorbansi ini dilihat dan dibandingkan dengan sampel sayur dan buah yang lain. Buah yang digunakan antara lain yaitu apel, jeruk, buncis, wortel, kacang. Setiap buah memberikan warna absorbansi yang berbeda-beda. Namun,dari semuanya bisa disimpulkan bahwa jika nilai absorbansinya turun maka warna akan lebih muda dibandingkan sebelumnya. Hubungan antara nilai absorbansi dan aktivitas enzim amilase yaitu berbanding terbalik. Semakin tinggi nilai absorbansi maka semakin menurun aktivitas dari amilase. Metode caraway-somogyi terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara konsentrasi glukosa dalam berbagai macam konsentrasi dan absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Serapan pada sampel yang terbentuk diukur pada panjang gelombang tertentu. Jika menggunakan larutan I2 atau indikator iodinkalium iodida diukur pada panjang gelombang 600 nm.Konsentrasi yang terbaca kemudian ditentukan dari nilai absorbansi yang terbaca pada kurva kalibrasi. Jika nilai absorbansi tidak terbaca pada kurva kalibrasi, maka sampel diencerkan hingga nilai absorbansi terbaca pada kurva kalibrasi. Salah satu langkah Spektrofotometri yang penting adalah pembuatan kurva standart. Kurva standar terdiri atas sederetan konsentrasi dari senyawa yang diukur.Menurut hukum Beer, suatu grafik dari absorbsi terhadap kadar zat pengabsorbsian merupakan garis lurus dengan slope sebesar b. Tetapi sering kali dijumpai bahwa
hasilnya tidak berupa garis lurus tetapi suatu garis lengkung, ini berarti terjadinya penyimpangan positif/negatif. Dalam prosesnya pertama-tama dibuat terlebih dahulu larutan standar yang berfungsi sebagai blanko. Blanko juga digunakan sebagai faktor koreksi, karena kosentrasi sampel akan dikurangkan dengan kosentrasi blanko pada akhirnya. Selain itu hal lain yang harus diperhatikan adalah kebersihan dari microplatenya
karena dapat
mempengarui kepada hitungan dari absorbansinya. Dalam melakukan pengujian aktivitas amilase, hal yang terlebih dahulu dilakukan adalah membuat kurva baku. Kurva baku merupakan standar dari sampel tertentu yang digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk parameter kadar sampel tersebut dalam percobaan. Pembuatan kurva standar juga bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansi sehingga nilai konsentrasi dari sampel dapat diketahui. Cara yang dilakukan dalam pembuatan kurva baku adalah dengan mencampurkan amilum dengan akuades, konsentrasi amilum yang dipakai sama dengan yang dipakai dalam pengujian aktivitas amilase sampel, hal tersebut supaya dapat diamati perubahan dari jumlah amilum pada larutan baku dan sampel. Selain itu perlakuan yang diberikan pada baku disamakan dengan yang dilakukan pada sampel supaya hasil pengamatan tidak dipengaruhi oleh perlakuan yang berbeda. Dasar dari teknik pengujian ini adalah dengan mencampurkan amilum dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim akan bekerja menghidrolisis amilum menjadi dimer atau monomer pentose. Dari hal tersebut selanjutnya diuji kembali kadar amilum dalam sampel dengan menggunakan microplate reader. Apabila ditemukan kadar dari amilum yang berkurang maka diketahui terdapat aktivitas amilase dalam sampel. Setelah didapat nilai absorbansi dari baku, selanjutnya dilakukan penguijian aktivitas enzim amilase dalam sampel. Sampel
yang digunakan adalah ekstrak kubis. Ketika pencampuran dari sampel dan amilum telah dilakukan, selama 7 menit dilakukan inkubasi. Inkubasi ini dilakukan supaya enzim yang terdapat pada sampel bekerja menghidrolisis amilum. Dalam pelaksanaannya juga diperhatikan kondisi suhu karena salah satu dari sifat enzim adalah termolabil atau bergantung pada suhu, sehingga suhu yang dipakai adalah 370C karena pada suhu tersebut enzim bekerja optimum. Setelah inkubasi selama 7 menit, ke dalam campuran ditambahkan larutan HCl. Penambahan ini dilakukan supaya menghentikan aktivitas enzim dalam menguraikan amilum. Penghambatan dilakukan supaya perlakuan pada sampel dan baku sama dengan sampel tidak dipengaruhi oleh waktu yang berbeda beda. Setelah diinkubasi ke dalam larutan ditambahkan lugol. Lugol merupakan pereaksi spesifik terhadap amilum. Lugol terdiri dari KI dan I2 dengan perbandingan tertentu. Ketika ditambahkan dengan amilum ion I- akan berikatan dengan amilum dan menghasilkan warna khas biru. Ketika penambahan pereaksi lugol, apabila tidak terjadi perubahan warna saat dicampurkan zat tersebut belum terhidrolisis dan sampel belum memiliki aktivitas amilase. Namun, apabila dari sampel sudah memberikan perubahan warna maka dapat dianggap sampel ini memiliki aktivitas amilase. Kemudian microplate dimasukkan kedalam microplate reader dan dibaca nilai absorbansinya dengan panjang gelombang 600 nm. Alasan mengabsorbansi dengan menggunakan panjang gelombang 600 nm karena warna sampel ini sesuai dan dapat dibaca dengan panjang gelombang tersebut. Penggunaan panjang gelombang spesifik adalah karena pada panjang gelombang tersebut diserap
warna
monokromatis
merah
yang
merupakan
warna
komplementer dari warna biru hasil dari reaksi lugol. Warna yang ditangkap oleh mata yaitu warna biru merupakan warna yang dipantulkan oleh larutan sementara warna yang diserap adalah warna
merah. Sehingga digunakan cahaya merah yang memiliki panjang gelombang sekitar 600 nm. Terakhir didapat nilai absorbansi dari sampel yaitu ekstrak kubis. Dan dilakukan perhitungan kadar dari amilum dalam campuran dengan membandingkan dengan kurva baku. Sehingga didapat nilai aktivitas dari amilase dalam sampel ekstrak kubis. Dari nilai tersebut dibandingkan dengan nilai dari sumber literature sebagai perbandingan hasil dan dibuat grafik seperti grafik dibawah ini.
Saat dibaca nilai absorbansinya didapatkan bahwa sampel kubis memiliki nilai absorbansi rata-rata yaitu sebesar 1,09 dengan konsentrasi amilumnya sebesar 3000 dan persamaan baku standar amilum : 1×10 -4 x + 0,7867 dengan nilai R2 sebesar 0,9967. Dari nilai ini dapat disimpulkan bahwa grafik ini dapat dianggap bagus karena nilai dari R2 mendekati 1. X.
SIMPULAN
10.1 Dapat mengetahui aktivitas enzim amilase dengan metode kolorimetri dengan peraksi lugol, dengan konsentrasi amilase akhir adalah 0,8823
DAFTAR PUSTAKA
Basset, J, et al. 1994. Buku Ajar Vogel: Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik . Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Endah, R, dan Nafizah Z. 2011. Aktivitas immobilizer β-amilase dan free β-amilase dari Zoogloearamigera ABL 1 dalam medium pati cair dengan perlakuan faktor lingkungan. Biota. 16(1) : 95-98. Khopkar , S.M . 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik . Jakarta : UI Press Kimball, John W 1991. Biologi Edisi Kelima Jilid Tiga. Jakarta: Erlangga. Machfoedz, Ircham. 2008. Gigi dan Mulut . Yogyakarta: Fitramaya Martin .1983. Farmasi Fisik . Jakarta : UI Press Poedjiadi, A., 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Praharyawan,Swastika. 2012. Spektrofotometri-Absorbansi dan Konsentrasi (Hukum
Lambert-
Beer).
Tersedia
online
di
informasitips.com/spektrofotometeri-absorbansi-dan-konsentrasi-hukumlambert-beer.html [Diakses pada tanggal 26 Februari 2016]. Sadikin, Mohammad. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta: Widya Sridianti
.
Medika.
2016.
Struktur
Molekul
Karbohidrat
.
Tersedia
http://www.sridianti.com/struktur-molekul-karbohidrat.html
Online
di
(diakses
tanggal 9 Mei 2016) Suhardi. 1997 . Analisis Kualitas dan Kuantitatif Karbohidrat Bahan Makanan Pertanian. Yogyakarta : UGM Press Winarto. F.G. 1985. Enzim Pangan . Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama. Yuniastuti, Ari. 2007. Gizi dan Kesehatan. Yogyakarta: Graha Ilmu.
