LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA ISOLASI PIPERIN DARI FRUCTUS Piperis nigri Atau Piperis albi
Oleh:
Nabila Fatin Aisiah M0614026 S1 Farmasi 2014
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta 2016
Percobaan I
ISOLASI PIPERIN DARI FRUCTUS Piperis nigri ATAU Piperis albi
I.
Tujuan 1. Dapat memahami prinsip dan melakukan isolasi piperin dari fructus Piperis nigri atau Piperis albi 2. Dapat melakukan analisis kualitatif hasil isolasi dengan metode KLT
II.
Dasar Teori Piperin terdapat dalam lada hitam dan diketahui memiliki aktivitas antimikroba. Terdapat beberapa senyawa pada lada hitam baik sebagai perasa maupun tidak dan memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan Sclerotium rolfsi dan Fusarium solani sepenuhnya. Terdapat aktivitas antimikroba ekstrak lada hitam terhadap beberapa mikroorganisme dan ditemukan bahwa senyawa fenolik hadir dalam ekstrak lada hitam. Ditemukan bahwa ekstrak lada hitam dapat mengontrol mikroorganisme. Beberapa senyawa seperti minyak yang terdapat dalam lada sangat efektif untuk mengontrol Phomopsis vsexans. Piperin memiliki aktivitas fungisida dan insektisida. Melalui studi mikrosomal hati manusiadiketahui bahwa piperin merupakan konstituen utama lada hitam yang dapat menghambat P-glikoprotein manusia (Saha et al, 2013). Peran biologis piperine yang umum dikenal adalah antioksidan, antikanker, antipiretik, anti-inflamasi, agen anti-mikroba dan banyak lagi. Peran lain piperine yang paling banyak dikaitkan dengan peningkatan kesehatan adalah fungsinya sebagai bioenhancer. Sebagai bioenhancer, piperin dapat meningkatkan bioavailabilitas obat pendamping baik dengan menghambat enzim metabolisme obat atau dengan meningkatkan permeabilitas mukosa usus dan menyebabkan efek di tingkat plasma yang lebih tinggi dari obat (Sutyarso et al, 2015). Salah satu sifat alkaloid yang paling penting adalah kebasaannya. Metode pemurnian dan pencirian umumnya mengandalkan sifat fisiknya, dan pendekatan khusus harus dikembangkan untuk beberapa alkaloid yang tidak bersifat basa. Alkaloid biasanya diperoleh dengan cara mengekstraksi bahan tumbuhan memakai air yang diasamkan dengan melarutkan alkaloid sebagai garam atau bahan tumbuhan dapat dibasakan dengan
natrium bikarbonat dan sebagainya. Basa bebas diekstraksi dengan pelarut organik seperti kloroform, eter dan sebagainya. Radas untuk ekstraksi sinambung dan pemekatan khususnya berguna untuk alkaloid yang tidak tahan panas. Pelarut atau pereaksi yang telah sering dipakai seperti kloroform, aseton, amonia dan metilena klorida dalam kasus tertentu harus dihindari. Beberapa alkaloid yang dapat menguap dapat dimurnikan dengan cara penyulingan uap dari larutan yang dibasakan. Larutan dalam air yang bersifat asam dan mengandung alkaloid dapat dibasakan lalu alkaloid diekstraksi dengan pelarut organik sehingga senyawa netral dan asam yang mudah larut tertinggal dalam air (Underwood, 1981). Metode yang digunakan untuk mengisolasi piperin dari lada hitam adalah ekstraksi soxhlet yang merupakan pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan dengan menggunakan bantuan pelarut. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran/pemilihan jenis pelarut ini didasarkan atas beberapa factor, yaitu selektivitas, kelarutan, kemampuan tidak saling campur, reaktivitas, titik didih, dan kriteria lainnya (Bernasconi, 1995). Ekstraksi serbuk kering jaringan tumbuhan dapat dilakukan secara maserasi, refluks, atau sokletasi dengan menggunakan pelarut yang tingkat kepolarannya berbeda-beda Proses isolasi dengan sokletasi memanfaatkan sirkulasi pelarut dalam sistem secara berulang sehingga penggunaan pelarut lebih efektif.. Oleh karena itu, pada penelitian proses ekstraksi dilakukan menggunakan metode sokletasi. Dalam proses sokletasi pelarut diuapkan ke dalam labu soxhlet dan turun secara berkala sesuai dengan titik didih pelarut sehingga terjadi pergantian pelarut secara berkala (Tonius et al, 2016).
III.
Alat dan Bahan a. Alat 1. Alat Sokhlet
1 buah
2. Statif dan klem
1 buah
3. Heating mantle
1 buah
4. Penangas air
1 buah
5. Batang pengaduk
1 buah
6. Timbangan Analit
1 buah
7. Corong
1 buah
8. Flakon
1 buah
9. Mortir dan stamfer
1 buah
10. Plat KLT
1 buah
11. Gelas beker
3 buah
12. Lampu UV
1 buah
13. Kertas saring
1 buah
14. Batu didih
2 buah
15. Pipet tetes
1 buah
16. Cawan porselin
1 buah
b. Bahan 1. Serbuk merica
50 gram
2. Etanol 96%
162 ml
3. KOH-etanolik 10%
10 ml
4. Diklorometan
9 ml
5. Etil Asetat
3 ml
6. Piperin pembanding qs
c. Gambar Alat
IV.
Cara Kerja Isolasi Piperin
50 gram serbuk merica dibungkus kertas saring dimasukkan ditambah
Alat sokhlet
Etanol 96% 162ml dan batu didih
Disari 2 jam
Hasil soklet
Diambil dalam flakon
3 ml sari jernih
Hasil sokletasi disaring filtrat Diuapkan ekstrak Didinginkan Ekstrak dingin
ditambah
10 ml KOH-Etanolik 10%
Diaduk endapan disaring Sari jernih Disimpan lemari es Kristal Dicuci Kristal bersih Dikeringkan Kristal kering ditimbang Rendemen
Etanol 96%
KLT
Sampel dalam flakon (cair)
Sampel kristal, standar piperin Dilarutkan Etanol 96 % Ditotolkanpada plat KLT
Diklorometana : etil asetat
Totolan
3:1
Di elusi hasil Diamati sinar UV 254 Hasil
dragendorf Disemprotkan
hasil Dihitung Nilai Rf
V.
Hasil dan Pembahasan a. Hasil Tabel Organoleptis Indikator
Hasil
Bentuk
Serbuk hablur
Bau
Bau khas tidak enak
Warna
Putih kekuningan
Tekstur
Lembut
Rendemen Berat bahan
Berat hasil
Rendemen
50 gram
0,64 gram
1,28%
Tabel Rf Sampel Piperin Standar
Piperin Kristal
Sari piperin cair
b.
Spot
Rf
1. 5,7cm
1.
0,71
2. 3,5cm
2.
0,44
1. 5,7cm
1.
0,71
2. 3,7cm
2.
0,46
3. 1,4cm
3.
0,17
1,4cm
0,17
Pembahasan Pada percobaan, dilakukan uji isolasi piperin dari fructus Piperis nigri atau
piperis albi dimana digunakan sampel merica pada praktikum. Tujuan dari percobaan ini ialah unutuk dapat memahami prinsip dan melakukan isolasi piperin dari fructus Piperis nigri atau Piperis albi dan dapat melakukan analisis kualitatif hasil isolasi yang didapat dengan menggunakan KLT. Isolasi dari piperin pada sampel merica menggunakan metode sokletasi. Sokletasi adalah metode pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyarian berulang menggunakan pelarut tertentu sehingga seluruh komponen dapat terisolasi. Prinsip dari sokletasi ialah penyarian berulang sehingga hasil yang didapat sempurna dan pelarut yang digunakan relatif lebih sedikit. Bila proses penyarian telah selesai, maka pelarut akan diuapkan kembali dan sisanya adalah zat yang tersari. Metode sokletasi menggunakan suatu pelarut yang mudah menguap dan dapat melarutkan senyawa organik yang terdapat pada bahan tersebut, tapi tidak melarutkan zat padat yang tidak diinginkan. Sokletasi digunakan pada pelarut organik tertentu. Dengan cara pemanasan, sehingga uap yang timbul setelah dingin secara kontinu akan membasahi sampel, secara teratur pelarut tersebut dimasukkan kembali kedalam labu dengan membawa senyawa kimia yang akan diisolasi tersebut. Pelarut
yang telah membawa senyawa kimia pada labu distilasi diuapkan dengan rotari evaporator sehingga pelarut tersebut dapat diangkat lagi bila suatu campuran organik berbentuk cair atau padat ditemui pada suatu zat padat, maka dapat diekstrak dengan menggunakan pelarut yang diinginkan (Drastinawati, 2013). Pada alat sokletasi, terdiri dari beberapa komponen diantaranya kondensor, timbal/slongsong, pipa f, sifon, dan labu alas bulat. Kondensor berfungsi sebagai pendingin balik dan juga untuk mempercepat proses pengembunan. Uap dari pelarut yang telah melewati pipa f akan di embunkan pada kondensor dan berubah menjadi tetesan dan jatuh pada sampel. Pipa f berfungsi sebagai tempat lewatnya uap bagi pelarut yang menguap dari proses penguapan. Sifon berfungsi sebagai indikator perhitungan siklus dimana bila pada sifon telah penuh larutan maka akan jatuh ke labu alas bulat dan menandai telah terjadi 1 siklus. Timbal/slongsong berfungsi sebagai wadah untuk sampel yang akan diambil zatnya dan labu alas bulat berfungsi sebagai wadah untuk pelarut dan senyawa yang telah tersari. Pada isolasi piperin, digunakan metode sokletasi dikarenakan terdapat beberapa kelebihan pada metode tersebut. Pada isolasi piperin dapat menggunakan pelarut etanol yang mudah menguap sehingga sesuai bila digunakan metode sokletasi dimana pada metode tersebut pelarut harus dapat dengan mudah menguap agar dapat menyari sampel pada tabung selongsong. Selain itu, dengan penggunaan sokletasi, pelarut yang digunakan tidak terlalu banyak dan tidak mudah jenuh karena setiap kali selesai menyari, pelarut akan diuapkan kembali dari labu alas bulat dan meninggalkan senyawa tersari yang memiliki titik didih yang berbeda dari pelarut. Hal ini menyebabkan senyawa yang dapat tersari akan lebih maksimal. Proses isolasi dengan sokletasi juga memakan waktu yang lebih sedikit dibandingkan metode lain seperti maserasi karen tidak perlu melakukan perendaman hingga berjam-jam. Selain itu, senyawa piperin merupakan senyawa yang tahan terhadap pemanasan sehingga cocok bila digunakan metode sokletasi. Pada percobaan, digunakan sampel merica sebanyak 50g yang kemudian ditumbuh hampir halus. Penumbukan bertujuan untuk memperkecil ukuran dari sampel sehingga luas permukaan kontak dengan penyari semakin besar dan senyawa aktif dapat tersari dengan lebih mudah. Namun proses penumbukan tidak sampai halus
untuk mencegah terbentuknya serbuk dimana justru dapat merusak senyawa-senyawa yang terdapat pada sampel karena membran selnya yang telah rusak. Setelah proses penyerbukan, sampel dimasukkan ke dalam kertas saring dan ditaruh pada pipa slongsong yang berfungsi sebagai tempat menaruh sampel. Hal ini dilakukan agar serbuk merica tidak menyumbat pipa sifon dari alat soxhlet sehingga proses ekstraksi dapat berlangsung dengan lancar. Sampel kemudian dialiri dengan etanol yang berfungsi sebagai penyari. Pengaliran dilakukan sampai terjadi 2 siklus dimana 1 siklus ditandai dengan jatuhnya pelarut dari permukaan pipa sifon masuk ke dalam labu alas bulat. Digunakan pelarut etanol 96% yang merupakan pelarut semi polar cenderung non polar hal ini dikarenakan selain mudah menguap dan cocok untuk metode sokletasi, Piperin juga memiliki sifat sedikit larut dalam air dan lebih larut dalam alkohol, eter atau kloroform sehingga digunakan etanol sebagai pelarut yang sesuai. Pada labu alas bulat, dilakukan penambahan batu didih dimana fungsi dari batu didih ialah untuk mempercepat proses pemanasan. Selain itu, batu didih juga berfungsi menghomogenkan suhu panas pada seluruh bagian dari labu alas bulat sehingga etanol dapat mudah menguap. Setelah proses dua siklus, heating mantel dinyalakan untuk memulai melakukan pemanasan dimana etanol akan kembali menguap melewati pipa f menuju kondensor untuk kemudian diembunkan dan menetes pada sampel merica dan akan terkumpul pada slongsong hingga pipa sifon terpenuhi dan turun dari permukaan pipa menuju labu alas bulat kembali membawa senyawa yang diekstrak yang menandai terjadinya satu siklus. Proses mencapai satu siklus dilakukan cukup lama hal ini dikarenakan sampel yang cukup pekat sehingga proses penyarian lebih lama. Pada percobaan, hanya dilakukan 4 sirkulasi dimana umumnya pada proses sokletasi dapat dilakukan hingga 6-8 siklus untuk memaksimalkan penyarian. Namun pada hasil penyarian sudah didapatkan hasil yang cukup pekat yang ditandai dengan warna larutan yang mulanya putih berubah menjadi kuning tua karena adanya hasil sarian senyawa aktif. Hasil yang didapat kemudian didinginkan terlebih dahulu untuk mengendapkan resin pengotor yang dapat larut dalam keadaan panas namun mengendap bila pendinginan. Kemudian sampel disaring dengan kertas saring untuk memisahkan
sampel dari pengotor tersebut. Langkah selanjutnya ialah penguapan pelarut. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan pelarut yang masih berapa pada sampel agar hanya didapatkan ekstrak kentalnya saja. Namun sebelum diuapkan, diambil 3ml sari jernih dari sampel untuk diuji KLT. Penguapan dilakukan sampai konsentrasi sampel berkurang dan terjadi pengentalan. Etanol yang memiliki titik didih lebih rendah akan menguap meninggalkan zat aktif pada cawan. Ekstrak kental yang telah didapat kemudian di dinginkan kembali dan diberikan KOH etanolik 10% sebanyak 10ml. Tujuan dari pemberian KOH etanolik ialah untuk menghidrolisis senyawa yang didapat agar menghasilkan kalium piperinat dan piperin. Piperin yang didapatlah yang kemudian akan diambil. Selain itu, penambahan KOH etanolik juga bertujuan untuk memisahkan senyawa piperin dari resin pengotor. Setelah penambahan KOH etanolik, dilakukan penyaringan kembali dengan kertas saring untuk memisahkan filtrat dan endapan resin akibat pemberian KOH etanolik. Filtrat jernih yang telah didapat kemudian dimasukkan ke dalam lemari es untuk proses kristalisasi. Tujuan dari proses kristalisasi ialah untuk memurnikan sampel dari pengotornya. Prinsip dari kristalisasi ialah senyawa padat akan mudah terlarut dalam pelarut panas bila dibandingkan pada pelarut yang lebih dingin. Jika suatu larutan senyawa
tersebut
dijenuhkan
dalam
keadaan
panas
dan
kemudian
didinginkan,senyawa terlarut akan berkurang kelarutannya dan mulai mengendap, membentuk kristal yang murni dan bebas dari pengotor. Kemurnian zat ini disebabkan oleh pertumbuahan kristal zat telarut, sehingga za-zat ini dapat dipisahkan dari pengotornya. Kristal kemudian ditimbang dan didapatkan rendemen hasil sebesar 1,54% dimana hanya didapat berat kristal sebesar 0,77 gram dari sampel 50gram. Proses selanjutnya ialah uji analisis kualitatf dengan metode KLT. KLT (kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode kromatografi yang didasarkan pada prinsip adsorbsi. KLT dilakukan untuk uji kualitatif berdasarkan perbandingan nilai Rf sampel dan standar. Prinsip dari KLT ialah pemisahan yang terjadi didasarkan pada perbedaan distribusi dan migrasi senyawa dimana kecepatan distribusi tergantung pada interaksi antara senyawa dengan dua fase yang berbeda yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa yang terikat kuat oleh fase diam akan tertahan dan terelusi lebih lama dibandingkan dengan senyawa yang terikat lemah dimana senyawa yang terikat lemah
akan lebih mudah terbawa oleh fase gerak dan terelusi pada plat. Daya ikatan antara senyawa dan kedua fase didasari pada sifat polaritasnya. Pada percobaan, digunakan KLT fase normal dimana fase diam cenderung lebih polar dari pada fase gerak. Fase diam yang digunakan adalah silika gel sedangkan fase gerak yang digunakan adalah campuran diklorometan: etil asetat (75:25). Digunakan fase gerak tersebut karena sifat piperin yang cenderung non polar sehingga akan terbawa oleh fase gerak sedangkan zat lain dan pengotor yang memiliki polaritas berbeda akan tertahan oleh silika gel. Sebelum proses elusi dimulai, chamber terlebih dahulu harus di jenuhkan dengan pelarut. Tujuan penjenuhan dengan eluen ialah untuk menjaga reprodusibilitas dari proses KLT. Selain itu, untuk menyamakan tekanan uap eluen dalam chamber agar dapat merata sehingga proses elusi dapat seragam kecepatannya dan penjenuhan dilakukan untuk mengoptimalkan proses pengembangan fase gerak. Plat KLT ditotolkan dengan 3 sampel yaitu larutan jernih 3 ml hasil sokletasi awal, sampel kristal yang telah dilarutkan, dan standar piperin. Plat yang sudah ditotolkan kemudian dimasukkan dalam chamber dan dielusi hingga eluen mencapai batas atas plat kemudian dihitung nilai Rf nya untuk membandingkan hasil. Berdasarkan hasil, didapat kan beberapa spot pada standar dan sampel dimana spot-spot tersebut memiliki jarak elusi yang hampir sama. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa sampel merupakan piperin yang telah berhasil di isolasi. Pada standar didapat 2 spot yang memiliki nilai Rf 0,71 dan 0,44. Pada sampel, ditemukan3 spot dimana 2 diantaranya memiliki nilai Rf yang mirip dengan Rf standar. Nilai Rf pada sampel ialah 0,71; 0,46 dan 0,17. Dimungkinkan, spot tambahan pada bagian bawah yang memiliki Rf 0,17 merupakan senyawa pengotor yang belum hilang secara sempurna sehingga masih ikut terelusi atau merupakan senyawa piperin yang belum terhidrolisis sempurna oleh KOH etanolik. Pada sampel larutan jernih, tidak didapatkan spot yang memilki kemiripan dengan standar dimana nilai Rfnya ialah 0,17. Hal ini dimungkinkan karena sampel tersebut belum di hidrolisis dengan KOH etanolik serta belum mengalami pemisahan dari pengotor sehingga senyawa tersebut belum merupakan piperin murni sehingga tidak memiliki nilai Rf yang sama. Pada hasil KLT, spot tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Hal ini dikarenakan struktut piperin yang tidak memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang
cukup banyak sehingga sulit untuk dilihat dalam cahaya tampak. Struktur piperin ialah:
Oleh karena itu perlu digunakan alat bantu berupa lampu UV 254. Pada UV 254, silika gel akan berpendar sedangkan sampel akan menjadi black spot yang menutupi pendaran dari silika gel. Untuk lebih memastikan letak spot makan digunakan reagen dragendorf yang berfungsi sebagai reagen kimia untuk merusak struktur dari piperin sehingga terjadi penambahan ikatan rangkap terkonjugasi pada sampel dan spot dapat dideteksi tanpa alat bantu sinar UV. Setelah proses penyemprotan dapat terlihat jelas spot yang terbentuk dimana spot menunjukkan warna orange.
VI.
Kesimpulan 1. Dapat dilakukan isolasi piperin dari sampel merica menggunakan metode sokletasi dimana prinsip dari sokletasi ialah ialah penyarian berulang sehingga hasil yang didapat sempurna dan pelarut yang digunakan relatif lebih sedikit. Bila proses penyarian telah selesai, maka pelarut akan diuapkan kembali dan sisanya adalah zat yang tersari. Didapatkan hasil isolasi piperin menggunakan pelarut etanol dimana didapat serbuk kristal piperin seberat 0,64g dari 50g sampel merica dengan rendemen sebesar 1,28%. 2. Analisis kualitatif dari sampel menggunakan KLT dimana prinsip dari KLT ialah pemisahan yang terjadi didasarkan pada perbedaan distribusi dan migrasi senyawa dimana kecepatan distribusi tergantung pada interaksi antara senyawa dengan dua fase yang berbeda yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa yang terikat kuat oleh fase diam akan tertahan dan terelusi lebih lama dibandingkan dengan senyawa yang terikat lemah dimana senyawa yang terikat lemah akan lebih mudah terbawa oleh fase gerak dan terelusi pada plat. Didapatkan hasil nilai Rf yang mirip antara sampel dengan standar dimana Rf dari standar ialah 0,71 dan 0,44 sedangkan Rf dari sampel kristal sebesar 0,71; 0,46 dan 0,17. Terdapat tiga spot yang dimungkinkan merupakan spot pengotor pada sampel atau merupakan senyawa
yang belum terhidrolisis sempurna oleh KOH etanolik. Pada sampel larutan jernih tidak didapat Rf yang sesuai dimungkinkan karena larutan tersebut belum terhidrolisis menjadi piperin dengan penambahan KOH etanolik dimana niali Rf nya ialah 0,17.
VII.
Daftar Pustaka Bernasconi. 1995. Teknik Kimia II. Jakarta: Pradya Paramitha Drastinawati, Rozanna S. 2013. Pemanfaatan Ekstrak Nikotin Limbah Puntung Rokok Sebagai Inhibitor Korosi. Jurnal Teknobiologi. Vol. 6. No. 2: 91-97 Saha, K.C., H. P. Seal., M. A. Noor. 2013. Isolation and Characterization of Piperine from The Fruits of Black Pepper (Piper ningrum). J. Bangladesh Agril. Vol. 11. No. 1: 11-16. Sutyarso, M. Kanedi, E. Rosa. 2015. Effects of Black Pepper (Piper ningrum Linn.) Extract on Sexual Drive in Male Mice. Research Journal of Medicinal Plant. Vol 9. No. 1: 42-47. Tonius, J., M. Agus, Nora I. 2016. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Steroid Fraksi n-Heksana Daun Buas-Buas (Premna serratifolia L.). JKK. Vol. 5. No. 1: 1-7. Underwood, A.L, Day, R.A. 1981. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
Mengetahui, Asisten Praktikum
Surakarta, 28/4/2016 Praktikan
Rochman Isham A
Nabila Fatin A
Lampiran Dokumentasi
A
B
A: Penampang KLT pada sinar tampak B: Penampang KLT dibawa sinar UV 254 C: Penampang KLT setelah penyemprotan dragendorf.
C
