“Año del buen servicio al cuidadano” ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUS!RIAL INFORME FINAL DEL EXPERIMENTO N°01
CURSO" LA#ORA!ORIO LA#ORA!ORIO DE INGENIERA DE #IOPROCESOS DOCEN!E" CAS!ILLO CALDER$N AUGUS!O AUGUS!O !E%A" INGENIERA DEL CUL!I&O CELULAR POR LO!ES DE PIC'IA S!IPI!IS NRRL () *+,IN!EGRAN!ES" FARF.N /APA!A 0A&IER NOLASCO %ALDONADO ARNOLD RODRGUE/ !O%AS AND( &.S1UE/ #ACILIO E&EL(N FA#IOLA
2017 INDICE
RESUMEN Se llevó acabo el desarrollo del cultivo celular de la cepa Pichia stipitis NRRL Y – 7124, aplicando toda la metodología de un diseño de cultivo por lote con la
mani manipu pula laci ción ón desd desde e su esta estado do inac inactiv tivo o en agar agar.. Se sigu siguió ió una una serie serie de procedimientos secuenciales tales como activación en el shaker, inoculación inoculación en agar, proporcionándoles todas las condiciones y facilidades para que pueda crec crecer er,, asim asimis ismo mo sigu siguie iend ndo o con con la secu secuen enci cia a se inoc inocul ulo o en un medi medio o denominado rico (!ml", el cual contiene todos los nutrientes que esta bacteria requiere para su óptimo desarrollo. Se evidencio el crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido dentro de otro medio al que se denomina mínimo (#$$ ml" por sus limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue %ilosa. Se procedió a observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular con los nutrientes e&actamente necesarios y establecidos para tal efecto y al mis mismo tie tiempo mpo como omo va dismi ismin nuye uyendo ndo el sustr ustra ato en este este cas caso principalmente la %ilosa, por el consumo que reali'a el microorganismo como fuente fuente princi principal pal para para su desar desarrol rollo. lo. esto esto es posib posible le determ determina inarr hacien haciendo do evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia ()*$ nm en el espectrofotómetro" y el ensayo con reactivo +S para el caso del sust sustra rato to con con una una abso absorb rban anci cia a de !*$ !*$ nm en el espe espect ctro rofo fotó tóme metr tro o y la generación de productos como el etanol el cual será medido mediante - (cromatografía de gases" usando como factor e&terno n/propanol. 0os tres aspectos (crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y generación de producto" evaluados en un determinado tiempo, son e&presados en gráficas además de ser comparados en una curva de calibrado para ambos casos, nos darán información sobre el microorganismo tales como un 1ma& igual $.23# h/, un tiempo de crecimiento (t" equivalente a $ horas ( Pichia stipitis NRRL Y – 7124".
INTRODUCCION
4n la actua actualidad lidad los prod productos uctos bioindustria bioindustriali'ad li'ados os son obtenidos obtenidos graci gracias as al mane5o y conocimiento del crecimiento de microorganismos. 0a cin6tica de crecimiento y producción de metabolitos resulta fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnológicos. 7asta por ahora con establecer que el adecuado conocimiento de la cin6tica de un cultivo permite la predicción del transcurso de la fermentación, la evaluación de velocidades, rendimiento, produc pro ductiv tivida idades des y ent entreg rega a inf inform ormaci ación ón 8ti 8till par para a es estab tablec lecer er est estrat rategi egias as de producción y optimi'ación del proceso. 4l comportamiento cin6tico de una población está determinado por un comple5o con5unto de factores gen6ticos y ambientales. 4ntre estos 8ltimos destacan las llamadas condiciones de operación (composición del medio, temperatura, p9 y otras" y la modalidad de cultivo, entre las que distinguimos el cultivo por lotes. :ara ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como tambi6 tam bi6n n el seg seguim uimien iento to de la cin cin6ti 6tica ca nos pro propor porcio ciona na dat datos os muc mucho ho más prácticos y e&actos sobre la velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado. 4n esta modalidad de cultivo se cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocul ino cula a co con n una det determ ermina inada da ca canti ntidad dad de c6l c6lula ulas s via viable bles. s. Se ini inicia cia así el cultivo, el que transcurre de una forma característica, dada por la llamada curva de cr crec ecim imie ient nto, o, ha hast sta a qu que e al alg8 g8n n ev even ento to,, ta tall co como mo el ag agot otam amie ient nto o de un nutriente lo detiene. 4s así así que que para para esta esta prác prácti tica ca hemo hemos s centr entrad ado o nues nuestr tra a aten atenci ción ón en el tratamiento de un microorganismo (:ichia stipitis ;;0 < =#*", iniciando desde su resiembra, para luego sembrarlo en medio rico procurando su rápida activación, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo> es decir con los mínimos requerimientos> en el cual es más factible determinar la cin6tica de crecimiento.
I.
OBJETIVOS:
I.1.
Objet!"# $e%e&'(e#:
+iseñar y reali'ar una e&periencia de cultivo celular por lotes en matraces
empleando una cepa de :ichia stipitis ;;0 < =#*. +eterminación de los parámetros cin6ticos de la cepa :ichia stipitis ;;0 < =#*.
I.2.
Objet!"# E#)e*+,*"#:
+iseñar el medio líquido de cultivo. ?ctivación celular y desarrollo del inóculo +eterminar la cin6tica de crecimiento de la biomasa. +eterminar de la cin6tica de consumo de la fuente de carbono. +eterminar la cin6tica de generación de 4tanol. +eterminación del @A y ks > los rendimientos del nutriente limitante en c6lulas y en etanol además de las respectivas productividades en c6lulas y en etanol.
II.
FUNDAMENTO TEORICO:
II.1.
MEDIO DE CULTIVO
Bn microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. +ependiendo de la fuente de carbono que utili'an, los microorganismos se pueden clasificar en autótrofos si es el C# atmosf6rico (microorganismos que fotosinteti'an" y heterótrofos si utili'an carbono orgánico. 0a fórmula elemental de un microorganismo es, apro&imadamente, *9=C# lo que supone que los componentes de las c6lulas sonD carbono que representa alrededor del !$E del peso seco, o&ígeno (2#E", nitrógeno (*E", fósforo (2E", a'ufre (entorno al E" y otros elementos tra'a entre los que se encuentran Fe, G, Ag, An, o, Ab, u y Hn. 0a preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. omo ya se e&plicó, los componentes de los medios constituyen los efectores e&ternos de naturale'a química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. 4n el caso de :ichia stipitis ;;0 < =#* la fórmula elemental más concreta es 9.=I C$.) $.= esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. 4l conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo.
II.2.
DISE-O
4l diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. on tal ob5eto se debe tener
en
cuenta
todos
aquellos
aspectos
relacionados
con
el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Ctros aspectos que son tambi6n importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos.
II..
CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO L/UIDO
Si
la
bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las
c6lulas
que
se
producen
en cada división
contin8an
su vida
independientemente formándose una suspensión de c6lulas libres. 4n un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbianoD
' F'#e ("'&+t3*' " 4e '4')t'*5% +urante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo" para iniciar la fase de crecimiento e&ponencial.
b F'#e e6)"%e%*'( " ("'&+t3*': 4n ella la velocidad de crecimiento es má&ima y el tiempo de generación es mínimo. +urante esta fase las bacterias consumen a velocidad má&ima los nutrientes del medio. 0a evolución del n8mero de c6lulas durante esta fase se e&plica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.
* F'#e e#t'*"%'&': 4n ella no se incrementa el n8mero de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo". 0as c6lulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase e&ponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. 0os microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota alg8n nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase e&ponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. 0a fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.
4 F'#e 4e 3e&te: Se produce una reducción del n8mero de bacterias viables del cultivo.
II.8.
COMPOSICION DE LOS MEDIOS
0os carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utili'adas en la industria de la fermentación. :or ra'ones económicas la glucosa la sacarosa puras rara ve' son utili'adas como 8nica fuente de carbono, e&cepto en los procesos que e&igen un control e&acto de la fermentación.
E( e6t&'*t" 4e 3'(t'
Bn e&tracto acuoso de la cebada malteada (cebada germinada que produce en'imas que hidroli'an el almidón", es un sustrato e&celente para muchos hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. 4l e&tracto seco de malta contiene apro&imadamente I$/I#E de carbohidratos y está compuesto de he&osas (glucosa y fructosa", disacáridos (maltosa, sacarosa", trisacáridos (maltotriosa" y de&trinas (polímeros de glucosa ,* con ramificaciones ,)". 0as sustancias nitrogenadas presentes en el e&tracto de malta incluyen proteínas, p6ptidos, aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. 0os medios de cultivo que contienen e&tracto de malta deben ser esterili'ados cuidadosamente. uando e&iste sobrecalentamiento se produce la reacción de Aaillard debido al ba5o p9 y a la alta proporción de a'8cares reductores. 4n esta conversión los grupos aminos de las aminas, aminoácidos (especialmente lisina" o las proteínas reaccionan con los grupos carbonilo de los a'8cares reductores, aldehídos y cetonas, lo que resulta en la formación de productos de condensación de color tostado. 4stos productos de reacción no son sustratos adecuados para los microorganismos.
L"# e6t&'*t"# 4e (e!'4&'
Son e&celentes sustratos para muchos microorganismos. 4l e&tracto de levadura contiene aminoácidos, p6ptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos.
L'# )e)t"%'# 94&"(;'4"# 4e )&"te+%'#. 0as fuentes de peptonas incluyen la carne, caseína, gelatina, queratina, semillas de cacahuete, harina de so5a, semillas de algodón y semillas de girasol. 0a composición de las peptonas varía dependiendo de su origen. 4l
producto final está tambi6n influido por el tipo de hidrólisis (ácida o en'imática" especialmente en relación a su contenido en triptófano
E( ''& :resenta algunos inconvenientes> el principal consiste en ofrecer una aireación insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos te5idos. :or otra parte, la composición del agar es variable y, a veces, mal definida y podría aportar oligoelementos que act8an favorablemente sobre el crecimiento
2.<. PAR=METROS A TENER EN CUENTA EN UN MEDIO DE CULTIVO
A)"&te 4e %t&e%te#:
0a cantidad y naturale'a de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo
)>:
Bn microorganismo puede alterar el p9 del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo> por e5emploD
Btili'ación de carbohidratos
→
:roducción de ácidos orgánicos
→
?cidificación
atabolismo de proteínas
→
:roducción de materiales nitrogenados
→
?lcalini'ación
4stos cambios durante el crecimiento los microorganismos modifican el p9 del medio de cultivo, normalmente haci6ndolo disminuir> por tal motivo es frecuente incluir en el medio substancias que act8en como tampón (buffer" a fin de evitar que el p9 se ale5e del óptimo.
Ne*e#4'4e# 4e '#e#:
0os gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el o&ígeno y el dió&ido de carbono. 0as bacterias presentan una respuesta amplia y variable al o&ígeno libre clasificándose en cuatro gruposD
Ae&"b'#: bacterias que se desarrollan en presencia de o&ígeno libre.
A%'e&"b'#D bacterias que se desarrollan en ausencia de o&ígeno libre.
A%'e&"b'# ,'*(t't!'#D bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de o&ígeno libre.
M*&"'e&5,('#D bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de o&ígeno libre.
:ara desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire est6ril en el medio. 0os anaerobios estrictos son muy sensibles al C# por lo que se debe evitar la e&posición de estos microorganismos al C#. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes m6todosD
?gregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de C#.
Juitando el C# por procedimientos mecánicos y reempla'ándolo por # o C#.
Aediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el o&ígeno libre con otro compuesto. :or e5emploD al encender una vela se transforma el o&ígeno en dió&ido de carbono
C"%t&"( 4e (' te3)e&'t&': 4l desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que se efect8an estas reacciones está influida por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. 4l efecto de la temperatura sobre el crecimiento es comple5o. :or un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de 6sta resulta en una mayor velocidad de reacción. :or otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las en'imas que catali'an las reacciones, con lo que la velocidad de
reacción decrece rápidamente. 0a temperatura óptima resulta de la interacción de estos dos efectos.
2.?. FACTORES UE INTERVIENEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO •
E( )> 4s un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de p9 fuera del cual mueren rápidamente.
9ay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el p9 del medio de crecimiento suele tender a ba5ar durante el cultivo. :or otra parte, la ba5ada del p9 del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una venta5a selectiva frente a otros microorganismos competidores. 0a ba5ada del p9 se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, ac6tico, láctico" por ciertos microorganismos.
•
B"3'#' Se representa mediante una formula basada en su composición elemental. +e ella es posible calcular un peso molecular promedio aparente, que es un subm8ltiplo de lo que sería el verdadero peso molecular calculado en base a la composición de la c6lula. 0a masa celular está correctamente representa por el producto del peso molecular por el coeficiente estequiom6trico respectivo.
:ara su desarrollo y reproducción las c6lulas necesitan de ciertos nutrientes en el medio. 4stos nutrientes deben, a lo menos, aportar los elementos de los que aquellos están compuestos.
!abla N23+" Co45osici6n 7u84ica de las levaduras
Se puede apreciar que cuantitativamente los elementos más importantes sonD el , 9, C y , luego viene un segundo grupo compuesto por Ag, S, :, a, Fe y G> mientras que los restantes elementos se encuentran presentes en niveles muy ba5os.
2.7. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO S@LIDO 0as fases, parámetros y cin6tica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan tambi6n en cultivos sólidos. 0a cin6tica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del n8mero de c6lulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa. uando una c6lula aislada e inmóvil comien'a a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. :or consiguiente, se denomina Kunidad formadora de colonia (BF"L Se le denomina así a una c6lula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.
2.. Pichia stipitis NRRL Y – 7124 Stipitis :ichia (aka stipitis Scheffersomyces" es una especie de levadura, que pertenece a la MB- ladeM de levaduras ascomycetous. 4ste es un grupo de hongos que serina sustituto de leucina cuando se encuentra el codón B-. S.
stipitis está le5anamente relacionado con la levadura de cerve'a, Saccharomyces cerevisiae, que utili'a el sistema codón convencional. 4ncontrado, entre otros lugares, en los intestinos de los escaraba5os passalid, S. stipitis es capa' tanto de fermentación aeróbica limitada y o&ígeno, y tiene la capacidad natural de la me5or conocida de cualquier levadura para fermentar directamente &ilosa, la conversión a etanol, un potencial valor económico rasgo. 0a &ilosa es un a'8car hemicelulosa se encuentra en todas las plantas angiospermas. omo tal &ilosa constituye el segundo resto de carbohidrato más abundante en la naturale'a. 0a &ilosa puede ser producido a partir de madera o residuos agrícolas a trav6s de la hidrólisis automática o ácido. 0a producción de etanol a partir de tales residuos lignocelulósicos no compite con la producción de alimentos a trav6s del consumo de grano.
+ada la abundancia de &ilosa y su potencial para la bioconversión de materiales lignocelulósicos a los combustibles renovables, :ichia stipitis se ha estudiado ampliamente. 0a secuenciación completa de su genoma se anunció en #$$=. cepas nativas de S. stipitis han demostrado producir N!$ g O l de etanol en *3 h a partir de &ilosa pura en medio mínimo definido usando urea como fuente de nitrógeno. S. stipitis es una levadura haploide predominantemente pero las cepas puede ser inducido a aparearse con ellos mismos o con otras cepas de S. stipitis por cultivo de c6lulas en medio mínimo que contiene cantidades limitantes de fuentes de carbono y nitrógeno. Bna amplia ca5a de herramientas gen6tica se ha desarrollado para S. stipitis que incluye marcadores de resistencia a fármacos sint6ticos para gen nourseotricina acetiltransferasa (?P", higromicina (9:9" y una forma sint6tica de re que permite la e&tirpación de los marcadores. epas manipuladas gen6ticamente de S. stipitis producirán != g O l de etanol a partir de &ilosa pura en menos de *3 h y cepas adaptadas producirán cantidades significativas de etanol a partir de hidroli'ados ácidos de l ignocelulosa
)>: 4ste es un factor importante en la fermentación, debido a su importancia en el control de la contaminación bacterial como tambi6n al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentación y en la formación de alcohol. +urante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina una disminución del p9 del medio. uanto más ba5o el p9 del medio, tanto menor el peligro de infección, pero si se traba5a con p9 muy ba5os la fermentación es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente.
•
C"%*e%t&'*5% 4e %t&e%te#: omo ya se di5o, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condición necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentración un factor primordial en la actividad vital de la levadura. 0as principales sustancias nutritivas y las más influyentes son el nitrógeno, fósforo, a'ufre, vitaminas y tr a'as de algunos elementos.
•
A&e'*5%: 4l aire es un factor decisivo en toda fermentación, ya que su presencia hace más vigoroso el crecimiento de la levadura. 9ay tres puntos de vista de gran importancia que favorecen el rendimiento debido a una buena aireaciónD
4l libre y constante abastecimiento de o&ígeno de cada c6lula en
el sustrato. 0a eliminación rápida del C#, porque en concentraciones relativamente pequeñas inhibe el crecimiento.
4l mantener en suspensión las c6lulas de levadura, a fin de que en la tumultosidad de la me'cla se renueve constantemente el contacto entre la membrana celular y el sustrato nutritivo.
4n este traba5o se ha utili'ado el microorganismo :ichia stipitis, tambi6n llamado Scheffersomyces stipitis, debido a sus buenas cualidades, ya que puede fermentar glucosa y &ilosa con buenos rendimientos de etanol. :or tanto, se evita la comple5idad de utili'ar un microorganismo modificado gen6ticamente o un co ‐cultivo. 0a figura siguiente muestra la ruta metabólica de obtención de etanol característica de la levadura :. stipitis a partir de glucosa y &ilosa.
Figura 1.10. Ruta metabólica de la levadura Pichia stipitis a partir de glucosa y xilosa (Fuente Pe!a" #00
%$ III.
MATERIALES METODOS .1 M'te&'(e#
P&e)'&'*5% 4e( 3e4" #"(4" 4e 3'%te%*5% 9<03( ' M'te&'(e# • • • • • • • • • •
$# :ipetas de $ ml. $= Pubos de ensayo con tapas Qarilla de vidrio Aatra' 4rlenmeyer #!$ ml :robeta graduada Aechero 7unsen 4spátula grande y pequeña -uantes. $) apachos de aluminio Qaso de precipitados #!$ml
b I%#t&3e%t"# • • •
e
E)"#
7alan'a analítica Clla a presión (autoclave" Aechero 7unsen
* Re'*t!"# •
omponentes
seg8n
la
tabla R 4&tracto de levadura
•
de solución !gO0 de :eptona 4&tracto de malta 2gO0 ?gar #$gO0 de sokución -lucosa $gO0 AuestraD P*' #tt)t# NRRL
7128 •
SustratoD %ilosae ?gua destilada
•
&gua destilada
•
P&e)'&'*5% 4e (' *&!' 4e *'(b&'4" DNS >4&"(## 4e (' 6("#'
2gO0 solución
' M'te&'(e# • • • • • • • •
= tubos de ensayo con tapa -radilla Aicro pipeta con punta # pipetas para aC9 y 9l # vasos precipitados (!$ml y !$$ml" :apel aluminio Clla con trípode 9ielo
b I%#t&3e%t"# e)"# • • •
Aechero 7unsen ?gitador Aa&i Ai& 7año Aaria
* Re'*t!"# • • • •
9lcc Sacarosa aC9 .=A ?gua destilada
DNS ' M'te&'(e# • • • • • • • •
= tubos de ensayo con tapa -radilla Aicro pipeta con puntas Qasos precipitado Clla con trípode 9ielo eldas :apel toalla
b I%#t&3e%t"# e)"# • • •
Aechero 7unsen ?gitador Aa&i Ai& 4spectrofotómetro
* Re'*t!"#
• •
+S ?gua destilada
P&e)'&'*5% 4e( 3e4" 4e '*t!'*5% 9203( ' M'te&'(e# • • • •
Aatra' de #!ml # tubos de ensayo con tapa pipeta de !ml -radilla
b I%#t&3e%t"# e E)"# • •
?utoclave Aechero bunsen
* Re'*t!"# • • • • •
• • •
-lucosa 4&tracto de levadura 4&tracto de malta Solución de sales ?gua destilada
Aatra' de !$$ml # tubos de ensayo con tapa -radilla
b I%#t&3e%t"# e E)"# • •
?utoclave Aechero bunsen
* Re'*t!"# • • • • •
Sacarosa 4&tracto de levadura Solución de sales Pampón citrato ?gua destilada
C%t*' 4e *(t!" 4 M'te&'(e# • • • • • • • •
?lcohol I)R ?lgodón abón # :ipeta $ ml y ! ml = viales Pubos de celda :apel toalla Paper de plástico
' I%#t&3e%t"# e E)"# • • • •
Aechero bunsen entrifuga 4spectrofotómetro ;efrigeradora
b Re'*t!"# •
?gua destilada
Dete&3%'*5% 4e (' *"%*e%t&'*5% *e(('& )"& D.O. D(*"%e# ' M'te&'(e# • • • • •
matra' (medio rico" # pipeta (!ml y # ml" gradilla 2 tubos de ensayo Pubos de celda
b I%#t&3e%t"# e)"# •
4spectrofotómetro
* Re'*t!"#
•
?gua destilada
Pe#" Se*" ' M'te&'(e# • • • • •
2 capachos de aluminio matra' (medio rico" # pipetas !ml eldas (tubo" 2 tubos de ensayo
b I%#t&3e%t"# e)"# • • • •
4spectrofotómetro entrifuga 4stufa 7alan'a analítica
* Re'*t!"# •
?gua destilada
Dete&3%'*5% 4e (' *"%*e%t&'*5% 4e X("#' >4&"(## 4e (' X("#' ' M'te&'(e# • • • • • • •
3 tubos de ensayo sin tapa -radilla Aicropipeta con puntas # pipetas para aC9 y 9l # vasos precipitados (!$ml y !$$ml" Clla con trípode 9ielo
b I%#t&3e%t"# e)"# • •
?gitador Aa&i Ai& 7año Aaria
* Re'*t!"# • • • •
DNS
Sobrenadantes (medio rico" 9lcc aC9 .=A ?gua destilada
' M'te&'(e#
3 tubos de ensayo sin tapa -radilla Aicropipeta con puntas Qasos precipitado Clla con trípode 9ielo eldas
• • • • • • •
b I%#t&3e%t"# e)"# • • •
Aechero 7unsen ?gitador Aa&i Ai& 4spectrofotómetro
* Re'*t!"# • • •
+S Auestra de la hidrolisis de la sacarosa ?gua destilada
.2 METODOLO$IA EXPERIMENTAL: o
D#eG" 4e Me4"# 4e *(t!"#:
4l diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. on tal finalidad se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos que van a ser empleados, para ello se debe considerar los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso. ?ntes de diseñar un medio de cultivo es necesario saber el comportamiento y las características del microorganismo.
L' (e!'4&' #'4' e# (' Pichia stipitis NRRL 7128H siendo el sustrato la +/&ilosa. 0a fórmula química de Pichia stipitis es la siguienteD
C+ '+9*: O39;3 (0evadura /formula química"
o obstante que los microorganismos (P*' #t)t# NRRL 7128 varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes como son los macronutrientes representados por las fuentes de , , S, :, G y Ag y micronutrientes representados por las sales de Fe, An, Ao, a, Hn y o.
Ree&3e%t"# %t&*"%'(e# :ara ello utili'amos un Aedio de cultivo mínimo.
Fuen
' (ilosa
o de amoni o
Fuente de carbono y energ)a
S"(*5% 4e #'(e#:
Fuente de . ' +os+ato di-cido de Potasio
' sul+ato de magnesio Fuente de ,g y *
' +os+ato di-cido de Potasio Fuen
heptahidrat ado
Solución de sales concentrada ($$ veces" Fuente de a Fuente de a Fuente de Fe Fuente de u Fuente de An Fuente de Ao Fuente de o Fuente de Hn
D D D D D D D D
al# al FeSC*.= 9#C uSC*.! 9#C Anl#.)9#C AoC2 ol#.)9#C HnSC*.=9#C
C"%4*"%e# 4e *(t!" Met'b"(#3" *e(('& )>
E#t'4"
?utotrófico *.! Aedio liquido
V"(3e% 4e( 3e4"
2$E / *$E del Fermentador
C"3)"#*5%
Juímicamente definido
Pemperatura 2$T
Qelocidad de agitación(Shaker" #$ rpm
Qolumen del medio 2$ < *$ E del volumen del matra'
concentracion celular final M%fM o superior a # gO0
Re,e&e%*' 4e C"3)"#*5% 4e 3e4"# 4e 3'%te%*5%H '*t!'*5% *(t!" )'&' Pichia Stipitis NRRL Y-7124 )'&' (' )&"4**5% 4e et'%"(
Me4" S5(4" De M'%te%*5% T'b(' 01: oncentración de utrientes para el medio de mantención (!$ m0"
Me4" A*t!'*5%: 9T:0°C N: 1<0&)3
T'b(' 02: oncentración de utrientes para el medio de activación (#$ m0" Nt&e%te
C"%*e%t&'*5% 9K(
Pe#" 9
%ilosa 4&tracto de levadura 4&tracto de malta Solución de sales
$ 2 !
4 mlO0
$.# $.$) $.$ $.$
Nt&e%te
C"%*e%t&'*5% 9KL
Pe#" 9
4&tracto de levadura :eptona de caseína 4&tracto de malta ?gar
2 ! 2 #$
$.! $.#! $.!
De
Me4"
Fe&3e%t'*5%: 9Aj#t'& )> 8.< T'b('# 0: utrientes :ara 4l Aedio +e FermentaciónD E(e3e%t "
Nt&e%te
C N S P M
C='+3O= (/%#*2 (/%#*2 #P2 #P2 (,g*2.3# 2% (,g*2.3# 2%
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P.M.
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Nutriente Limitante: Xilosa
6K# 9K
S"
S"
(gOl"
(gOl"
0.8
8.?
8.?
μ Max
=0.301(teorico)
Tiempo de fermentación: 10 horas
T'b(' 08: oncentración de utrientes para el medio de fermentación (#$$ ml" Nt&e%te
C"%*e%t&'*5% 9KL
Pe#" 9
6("#' E6t&'*t" 4e (e!'4&' 9N>82SO8 >2PO8 MSO 87>2O S"(*5% 4e #'(e# T'3)5% *t&'t" 0H08M )>8H<
*.)) 2 $.3= $.= $.$) ! mlO0 $$mlO0
$.I2# $.) $.2*3 $.$= $.$#3 ml #$ml
T'b(' 0<: omposición del medio mínimo de cultivo de :ichia Stipitis ;;0 / =#* para un crecimiento en biomasa de # gO0.
C"3)"#*5% 4e (' #"(*5% 4e #'(e# t(;'4'# e% ("# 3e4"# 4e *(t!"# e% KL 910003( 1L
Nt&e%te CaCl,9,',O
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/nSO-9*',O FeSO-9*',O CuSO-9=',O
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$.#!
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$.#$.#
ml
ml
CoCl,9;',O 9l
o
P&e)'&'*5% 4e 3e4"#H )&"&'3' 4e 3e#t&e"# •
0a preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
P'&' e((" 4ebe3"# te%e& e% *"%#4e&'*5% ("# #e%te# )&"*e#"#: 1. ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES CONFECCI@N DE LOS TAPONES 5a6a 5ruesa
CORTAR COLOCAR
>UNDIR >ACER
:erpendicularmente en la boca del matra'. 4ncima de la ga'a el algodón a presión udos para su5etar el algodón y para poder manipular
2. ESTERILIACI@N DE LOS MATERIALES (7asos precipitados" matra6 y tubos de
LAVAR
SECAR
8n la 8stu+a en posición vertical
COLOCAR (7asos precipitados" matra6 y tubos de
EN&OL&ER ES!ERILI/AR
:n ;ltro de algodón en las pipetas 9on papel aluminio & 1#1<9 por 1hora y =0minutos
. PREPARACI@N DEL MEDIO DE MANTENCI@NH SE$N LA TABLA 01 PARA EL CULTIVO DE PIC>IA STIPITIS NRRL 7128 4&tracto de levadura, peptona, e&tracto de malta y agar
PESAR 40ml de agua
A>ADIR
8n un ,atra6 de #40ml
CALEN!AR
AGI!AR ? tubos de ensayo con tapa.
DIS!RI#UIR
9onstantemente con un varilla por un minuto (aparición de la primera ?@3 ml de la me6cla en caliente a cada tubo de ensayo" con pipeta de 10 ml
9on papel aluminio
EN&OL&ER
ENFRIAR
:na ve6 tapados los tubos de ensayos" por 1 hora.
COLOCAR
8n un vaso precipitado" y llevarlos a la olla a presión
CALEN!AR
1#1 A9
B #0 min
8. PREPARACI@N DEL MEDIO DE ACTIVACI@NH SE$N LA TABLA 02 ? posición inclinada a P. ?mb. para ENFRIAR solidificación del medio de cultivo PARA EL CULTIVO DE PIC>IA STIPITIS NRRL 7128
Antes de preparación el medio de activación preparar la solución de sales:
Codas las sales
PESAR DILUIR
:nir todas las diluciones 1ml de 9l
AGI!AR AGREGAR
9on agua destilada cada sal una 8n un agitar magnDtico en un vaso
AGI!AR REFRIGERA <. MEDIO DE ACTIVACI@N ilosa" extracto de levadura" extracto de malta 8n #0ml de agua
PESAR
DISOL&ER
*olución de sales
%EDIR
AGREGAR
&l matra6 Eue contiene el extracto de levadura y malta" con la ayuda de la
A0US!AR
8 p a 3 de la solución Eue contiene xilosa.
ES!ERELI/AR
Por separado cada componente antes pesado"
%E/CLAR ?. PREPARACI@N DEL MEDIO DE FERMENTACI@NH SE$N LA TABLA 0 PARA EL CULTIVO DE PIC>IA STIPITIS NRRL 7128 Antes de preparación el medio de fermentación deemos tener listo el !ampón "itrato #$##4% a p& 4$'
(gr% Hcido c)trico sol. & y (gr% citrato de *odio sol. I
PESAR
DILUIR 'O%OGENI (ml% Hcido c)trico sol. & y (ml% citrato de *odio sol. I
Por separado en una ;ola de 100ml &mbas soluciones
AGREGAR 8n una ;ola de 100ml ambas
AFORAR AGI!AR
8n un agitador magnDtico
%EDIR
p Jncial y a!adir 5otas de /a2 hasta regular el p a "4
7. MEDIO DE FERMENTACI@N ES!ERILI/AR
,ateriales a utili6ar (garanti6ar asepsia%
ilosa" extracto de levadura" (/%#*2 " # P2 y # P2
PESAR ENCENDER
,echero para mantener un ambiente estDril
8l &sa Iacteriológica 1ml *olución de *ales (&l ro>o vivo%
%EDIR SO%E!ER
9ada compuesto en agua destilada
ilosa en un matra6 de 400 ml con 1=0 ml agua destilada. @ 8xtracto de levadura con DISOL&ER #0ml de tampón citrato en ENFRIAR Pormatra6 unos segundos un de 1#4ml @ as = sales en un tubo con 14ml de agua destilada. @ *olución de sales en un ES!ERELI/A :na a6ada E?!RAER del Cubo de 8nsayo Eue las cDlulas asconten)a disoluciones por desarrolladas
o
@
ENFRIAR 8n tubos de ensayo preparados con medio sólido (&ga RESE%#RAR MONTAJE DEL EUIPO EXPERIMENTALH CULTIVO DEL M.O.H ETC. REALI/AR &6ada desde dentro hacia +uera en el tubo (9ru6ado%
LLE&AR & la Jncubadora a =0<9 durante # a $ horas. 8l tubo de 8nsayo Para cerrarlo
FLA%EAR
ACTIVACI@N CELULAR DESARROLLO DEL IN@CULO
9on una asa Iacteriológica
KeE?!RAER la cepa incubada en medio sólido Pichia stipitis /RR
INOCULAR
8n el ,atra6 con los #0ml del medio de activació
!APAR8l ,atra6 con un tapón de gasa y algodón.
LLE&AR
&l *haMer a 140rpm" C< N =0<9
Hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio
DETERMINACI@N DE LA CINQTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA 9ESPECTOFOTOMETRO
#$ml de caldo (medio rico U biomasa"
:na muestra de 4ml del caldo.
INOCULAR E?!RAER %EDIR
*e toman las 4ml del medio de cultivo medidas de asepsia en la 6ona de traba>o y el encendido del mechero.
E?!RAER
8n un matra6 de 400m contenido 1$0ml de A 5ar
de
8stas 0 se y reali6aran *0 con K.2 cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera
=ml para el tubo de espectro+otómetro y el resto se le agregó al tubo de cen SEPARAR a toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el medio de %EDIR +ermentación. &bsorbancia a ?0nm y p
4ml en el tubo de centri+ugado" se devuelve.
CO%PLE!AR
CEN!RIFUGAR & la m-xima velocidad por #0 minutos
&ER!ER ( GUARDAR 8l sobrenadante en viales y ponerlos en re+rigerador
Dete&3%'*5% 4e (' *%t*' 4e *&e*3e%t" 4e (' b"3'#'
1. Btili'ando la ecuación ln(%O %$" V 1t, determinamos distintos valores de 1. 2. Pabular Si vs. 1i . on la ecuación O 1 V O1m U (GSO 1m" OS, graficamos. 8. la intercepción con el e5e y será el valor de O1m siendo su inversa el valor de 1m, además la pendiente mV G SO 1m conocido anteriormente 1 m determinamos GS. d% O dt V 1m % WWWWWW.( ∝" % V %$ e 1mt
Dete&3%'*5% 4e (' *%t*' 4e *"%#3" 4e (' ,e%te 4e *'&b"%". /dS O dt V (O %OS" (d%Odt"
;eempla'ando ∝ en esta ecuación y conociendo %OS.
Penemos /dS O dt V (O %OS" 1m % , conociendo 1 m ya para diferente concentraciones finales podemos determinar la cin6tica de consumo de sustrato.
Dete&3%'*5% 4e ("# &e%43e%t"# 4e( %t&e%te (3t'%te e% *(('#. Fuente de carbono y energíaD %ilosa ( ! 9$ C!", AV !$ g %OS V E de en el nutriente O E de en la c6lula E de en el nutriente V #(!" & $$ O !$ V *$ E E de en la c6lula V *).!= E %OS V (*$O*).!=" & $.2 (este factor por ser aireado" %OS V $.3) & $.! V $.*2 gOg
DETERMINACI@N DE ACARES REDUCTORES: MQTODO DEL DNS 9=CIDO DINITROSALIC/LICO
:ara
la
preparación
de
este
reactivo,
se
disuelve
el
tartrato
en
apro&imadamente !$$ o )$$ ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido +S. ?mbas soluciones se me'clan en un matra' aforado de litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. Se precisa reali'ar los siguientes pasos para el análisis de la muestraD
A ADIR
MANTENER MEZCLA
ENFRIAR
Qolumen del reactivo +S a un volumen de muestra a anali'ar
ba!o agua a ebullición O
Agua 10
AÑADIR
LEER
Absorbancia a 540 nm blanco: agua
DETERMINACI@N DE LA CONCENTRACI@N CELULAR POR D.O
!O%AR
7olumen conocido
CEN!RIFUGA
4000 rpm Q
RESUSPENSE
*obrenadante
Ciempo
ELI%INAR
entrifugado con agua destilada
CEN!RIFUGA R
!$$$ rpm > PiempoD #$X a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.
ELI%INAR
Sobrenadante
REDISOL&ER
SECAR
IV.
:recipitado
8stu+a $0 <9 hasta peso
RESULTADOS
XILOSA $RUPO A1 NB + , = ; *
J2*& (#gBl% # 1"? 1"# 0"$ 0" 0"# 0
&I* 40 nm 1"1=4 0"#4 0"3= 0"?1 0"#01 0"01 0
TABLA N1 CURVA DE CALIBRADO DNS
A#S =-3 n4 +(x% N 0.4x @ 0.01 RS N 1 &I* 40 nm inear (&I* 40 nm%
$RAFICA N1 CURVA DE CALIBRADO DE DNS $RUPO A1
LH +(x% N 0.=x @ 0
$RAFICA N02 CURVA DE CALIBRADO PARA BIOMASA CELULAR 9T"4"# ("# $&)"#
IJ2,&*& *:*CR&C2
$RAFICA N 0 C&e*3e%t" *%t*" *"%#3" 4e( ##t&'t" e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" XILOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%" $RUPO A1
Linealidad de cine
Fn(Bo%
$RAFICA N 08 C&!' 4e( *&e*3e%t" *e(('& )'&' 4ete&3%'& e( 3'6 e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" XILOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%".
LN??oH +(x% N 0.=$x @ 0.1# RS N 1
/(Bo% inear (/(Bo%%
$RAFICA N 0< C&!' 4e( *&e*3e%t" *e(('& *"% ("# )%t"# (%e'(e# )'&' 4ete&3%'& e( 3'6 e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" XILOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%"
TABLA N°02 : P'&3et&"# *%t*"# &e%43e%t"# 4ete&3%'4"# e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" XILOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%". P'&3et&" *%t*" &e%43e%t"# 6K# t4 9 36 6K# 9KL t"t'( 9&KL 3 91
V'("& "bte%4" e6)e&3e%t'(3e%te 1H1 0H2 1
os par-metros cinDticos resumidos en la C&I& /< 0#" muestra aEuellos par-metros Eue +ueron hallados experimentalmente despuDs de la experiencia de cinDtica de crecimiento " el valor del Tm teóricamente hallado para el prein+orme" +ue de h@1" ahora experimentalmente nos sale un valor de h@1" lo cual indica Eue hay una gran di+erencia" luego si observamos el valor de td hallado experimentalmente +ue de h" como sabemos los intervalos de tiempo de duplicación para levaduras es aproximadamente entre 1 G h" de lo cual el valor hallado est- dentro del rango" indicando Eue est- bien nuestra cinDtica de crecimiento" as) mismo podemos observar Eue al existir un rango grande en cuanto al tiempo de duplicación entonces la velocidad m-xima tambiDn habrrangos grandes" lo cual hace Eue la di+erencia Eue exist)a entre el valor hallado teóricamente y experimentalmente se haga insigni;cante. $LUCOSA $RUPO A2
s
x
$RAFICA N 0? C&e*3e%t" *%t*" *"%#3" 4e( ##t&'t" e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" $LUCOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%" $RUPO A2
$RAFICA N 07 C&!' 4e( *&e*3e%t" *e(('& *"% ("# )%t"# (%e'(e# )'&' 4ete&3%'& e( 3'6 e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" $LUCOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%"
$LUCOSA XILOSA $RUPO A
IJ2,&*& *:*CR&C2
$RAFICA N 0 C&e*3e%t" *%t*" *"%#3" 4e( ##t&'t" e% (' e6)e&e%*' *"% P*' #t)t# NRRL 7128 t(;'%4" (' 3e;(*' 4e $LUCOSA XILOSA *"3" ,e%te 4e *'&b"%" $RUPO A
