Informe de Bioprocesos- Cla (II Unidad)

CULTIVO CUL TIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO AI READO

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CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO AIREADO RESUMEN

B O R AT O R I O D E B I O P R O C E S O S

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INTRODUCCION En la la actuali actualidad dad muchos de los los alimentos alimentos son obtenidos obtenidos gracias gracias al manejo y conocimient conocimientoo del crecimiento crecimiento de microorgani microorganismos. smos. Result Resultaa entonces entonces importa importante nte el conocimient conocimientoo de las condiciones condiciones en que estos microorganismo microorganismoss puedan optimizar optimizar sus productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y eactos sobre la velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado. !a preparación de medios para el desarrollo de procesos de "ermentación es una etapa "undamental "undamental para asegurar asegurar la productividad productividad de los mismos. mismos. !os componentes componentes de los medios constituyen los e"ectores eternos de naturaleza química que desempe#an un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de "ormación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para para el mant manten enim imie ient ntoo celu celula lar. r. $o obst obstant antee que los los micro microor orga gani nism smos os varí varían an considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar. Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de un microorgani microorganismo smo %Saccharomyces Saccharomy ces cerevisiae ATCC-4126 &' iniciando desde su siembra partiendo desde su estado en cepa congelada ' para luego sembrarlo en medio rico' empleando la glucosa como "uente de carbono' procurando su rápida activación' para que luego de un determinado deter minado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo( mínimo( es decir con los mínimos mínimos requerimientos( requerimientos( en el cual es más "actible "actible determinar la cinética de crecimiento. )entro de su importancia en la agroindustria la Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126 ATCC-4126

es muy valiosa para la conversión de "ructosa en etanol que puede mejorar

la economía economía de una planta trans"ormadora trans"ormadora de azucares naturales naturales de "rutas a etanol. *on la conversión de la "ructosa' la potencial reducción del precio está en "unción de tres parámetros de "ermentación+ el rendimiento' la tolerancia de etanol y la productividad. ,sumiendo ,sumiendo altos valores para estos parámetros' parámetros' la reducción reducción máima máima puede volverse de -/. 0oy en día es conocido que un n1mero de levaduras "ermenta sacarosa en etanol' sien siendo do Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae


ATCC-4126

una de las más e"icientes'

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especialmente en relación con el rendimiento y la proporción volumétrica. Empleando esta levadura para la "ermentación de la )2ilosa' la reducción en el precio del etanol alcanza el 3/ del máimo asequible.

I. OB OBJE JETI TIVO VOS: S: 1.1. 1. 1. Ob Obje jeti tivo voss gene gene!" !"es es:: )ise#ar )ise#ar y realizar realizar una eperiencia de cultivo cultivo celular por lote alimentado alimentado %*!,& con alimenta alimentació ciónn con consta stante nte utilizand utilizandoo una cepa de Saccharomyces cerevisiae

ATCC-4126. ATCC-4126. 1.#. 1. #. Ob Objet jetiv ivos os Es Es$e $e%& %&'i% 'i%os os:: )ise#ar el medio de cultivo. Realizar la activación y desarrollo del inoculo. 4denti"icar 4denti"icar y describir describir las partes' partes' a accesorios y geometrías' geometrías' conocimiento conocimiento de la operación del "ermentador' esterilización' carga y descarga y toma de muestra. 4denti"icar en el "ermentador los instrumentos de medición y control automático' así como la calibración de los sensores Puesta en marcha del cultivo por lote alimentado y determinar 5ma y 6 7s. 8btener los per"iles de masa celular' "uente de carbono y oígeno disuelto a través del tiempo de operación. 8bservar las zonas de crecimiento eponencial y limitada. )eterminar el 6 7s y 9 del *!,.


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II. METO METODOLO( DOLO()A )A E*PERIMENTA E*PERIMENTAL L: , la hora de dise#ar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino sino tam también bién las cond condiicion ciones es "ísi "ísica cass qu quee perm permit itan an el crec crecim imie ient ntoo de los los microorganismos' asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.:ambién es importante conocer las características de los microorganismos con el que se va a trabajar.

Microorganismo. !a levadura usada es SaccharomycesCerevisiae ,:** ,:** -;<=' siendo el sustrato sacarosa

Condiciones del medio:  >ustrato limitante+ SACAROSA% *;<0<<8;;&  )uración+ = horas de la etapa de *!,  ?sar el "ermentador automático@iotron Aodelo !i"lus B C de < litros  *ontrol de p0 medianteelectrodo  Aedición de oigeno disuelto mediante electrodo + ;' vim ( < rpm  !a eistencia de las zonas de crecimiento eponencial y limitado. ?tiliza macro nutrientes como+ *.$.Ag'D'P ?tiliza micro nutrientes como+ *a'$a'e'*u'An'Ao'*o'Fn

#.1.

DISE+O DEL MEDIO DE CULTIVO

Para dise#ar el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos proporciona la guía de práctica' en el cual podemos po demos conocer los requerimientos del microorganismo' para su mantención' activación y para la "ermentación del cultivo por lote alimentado. 8tro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado %@,& o "edbatch. Esta técnica se de"ine como un cultivo en batch donde se alimenta continuament continuamentee medio nutritivo nutritivo "resco o alguno de sus componentes. componentes. >i el nutriente nutriente B O R AT O R I O D E B I O P R O C E S O S

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que se alimenta es el limitante del crecimiento' esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento %µ& del microorganismo. El @, es particularmente 1til en procesos en los que el crecimiento celular y7o la "ormación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante' es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven a"ectados. ,sí' este método se emplea cuando se quieren evita evitarr "enóm "enómen enos os de inhi inhibi bici ción ón por por sust sustrat ratoo y se requi requiere ere alcan alcanza zarr un unaa alta alta concentración de biomasa. ES,UEMA

)onde %t&+ caudal de alimentación >r %t&+concentración %t&+concentración de sustrato de la alimentación G" + volumen "inal de trabajo Go+ volumen al inicio de la alimentación Co+ concentración de biomasa al inicio de la alimentación >o+ concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

El cultivo @, se inicia a partir de un cultivo en batch' por lo que G o' Co y > o son las condiciones "inales de dicho batch. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación' ya sea mediante el empleo de caudales variables % H %t&&' o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante %>r H>r %t&&. En el caso del :rabajo Práctico se utilizará el sistema más simple' es decir Hcte y >r Hcte. Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

,l obtener valores de >r y ' se ha )4>EI,)8 una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto  como >r sean constantes. Es claro que en caso de ser  H %t& y7o >r H >r %t&' dicha "uncionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas

#.#.

PREPARACION DEL MEDIO:

2.2.1. PREPARAC!" #E$ ME#% #E MA"TE"C!" !a preparación de este medio se realizara de acuerdo a los componentes que se encuentran en la tabla $J ;

N-tiente

B O R AT O R I O D E

Etracto de !evadura Etracto de malta B I O P R O C EPeptona SOS ,gar Blucosa

So g/"0 K K GLR U P O < ;

So g/23"0

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.;L .;L .
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Ta&la "'1: Com(osici)n de medio s)lido de man*enci)n +(ara , ml de solci)n/ Po%e4i3iento  !a preparación del medio de mantención se inicia de acuerdo a las concentraciones de la tabla $J ;.

 !os nutrientes se pesan en cantidades requeridas para Lml. )e la tabla $J ;'por lo que el medio de mantención se necesita en cantidades menores a L ml. Aedir en una probeta graduada L ml de agua destilada.

 Aezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando el agua destilada.

 *alentar con el mechero @unsen la mezcla disuelta en el matraz( agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio' hasta la aparición de la primera burbuja' a partir de lo cual se controla de ; a < minutos.

 Preparar M tubos de ensayo con tapa' y en caliente adicionar =ml de la mezcla a cada tubo' e inmediatamente taparlos.

 *olocar los tubos en un vaso de precipitado' y llevarlos a la olla a presión' previamente a"lojar las tapas' para permitir el intercambio de gases.

 *alentar hasta que la temperatura alcance los ;<;J* y a partir de ello controlar de ;L a < minutos' "inalizando la esterilización.

 ,justar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla' luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.


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 !uego preparamos nuestra área de trabajo' desin"ectando con alcohol. para tener una área estéril prendemos el mechero cinco minutos antes de realizar la resiembra con el Saccharomycescerevisiae ATCC 4126.

 ,brimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen' "lameando para evitar la contaminación' teniendo la aza bacteriológica calentada al rojo vivo esperamos un momento que se en"ríe. >acamos < a K azadas y colocamos en el tubo con agar' "lameamos y cerramos el tubo y así en los M tubos con agar.

#.#.#. PREPARACI5N DEL MEDIO DE ACTIVACI5N $?:R4E$:E

*8$*E$:R,*4N$ %B7!&

PE>,R %B&

>acarosa

1

2.##

Etracto de

6

2.27

!evadura Etracto de Aalta



2.28

>olución de >ales

 3"/L

2.283"

Ta&la "0 2: Com(osici)n de medio de Ac*ivaci)n +(ara 1, ml de solci)n/ Po%e4i3iento  Pesar los componentes descritos en la tabla $J <.  En un matraz Erlemenyer se colocó la cantidad pesada de sacarosa más M ml de agua destilada.

 El etracto de levadura se colocó en tubo de ensayo y se agregó ; ml de agua destilada

 En cuanto a la solución de sales también se colocó en tubo se ensayó y se agregó 3 ml de agua.


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 >e esterilizan+ la mezcla de etracto de levadura y sales en un tubo de ensayo cada uno' la sacarosa en un matraz de ;
 )espués de haber esterilizado se dejó en"riar para luego mezclar y realizar la activación con el microorganismo.

 ,l mezclar estos componentes %las sales y la levadura con la sacarosa& se procedió a activar el microorganismo Obajo mechero para evitar la contaminación.

 >acamos dos azadas y colocamos en el medio de activación' luego tapamos con el tapón previamente elaborado.

 *olocar en el shaQer por un tiempo de ;
$utriente

*

>acarosa %*;<0<<8;;&

$

>ul"ato de ,monio %$0-&<>8os"ato Potasico %D0
D Ag

P

?

/ en *elula -L

/ en nutriente -<';L

6 7s %g7g&

> %g7l&

> %g7l&

'-=3M

K'M-3M

K'M-3M

pesar %gr& 2.6<78

S

<;'<;

<'KL=3

'3=KM

;';-L3

2.117=

'L

L3'KL<

'K;-

'-3;

2.2278

>ul"ato de Aagnesio 0eptahidratado %Ag>8-.30<8& os"ato Potasico %D0
'-

S'M=

<-'=L

'3K

';SL

2.21>

<

<<'3S

;;'KSL

';LM

'
Etracto de !evadura

2

2

2

2

;'M

2.2#6= > 2.1<


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO ?

>olucion de sales

2

2

2

2

; ml7!

1

*ondiciones de *ultivo + p0 inicial + -'< >0,DER :emperatura+ KLJ* Gelocidad de agitación + < rpm

!a "ermentación se realizara en un matraz de L ml.

T!b"! N9 7: Co3$osi%in De" Me4io De ;e3ent!%in I Com(osici)n del Medio de Cl*ivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 (ara n crecimien*o en &iomasa de 1.3 gl. (ara n volmen de 3ml Elemento

$utriente

*

>acarosa %*;<0<<8;;&

$

D Ag

P

?

/ en *elula -L

/ en nutriente -<';L

6 7s %g7g&

> %g7l&

> %g7l&

'-=3M

K'M-3M

K'M-3M

S

<;'<;

<'KL=3

'3=KM

;';-L3

'L

L3'KL<

'K;-

'-3;

'-

S'M=

<-'=L

'3K

';SL

<

<<'3S

;;'KSL

';LM

'
Etracto de !evadura

2

2

2

2

;'M


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO ?

>olucion de sales

2

2

2

2

; ml7!


!a "ermentación se realizara en el "ermentador de < ml.

;ERMENTACI5N DEL CULTIVO  4nocular el caldo %medio rico T biomasa& a un matraz conteniendo medio de "ermentación' para el la adaptación del crecimiento

 )urante el desarrollo del cultivo' para las evaluar el crecimiento de biomasa' tomar una muestra inicial' al que se le mide la absorbancia y se centrí"uga' guardando el sobredanante en viales y la masa sedimentada en capachos que serán epuestos a la estu"a. ?na vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el "lujo de alimentación de tal manera que en tiempos determinados' se provoque en el comportamiento del crecimiento. !uego se llevara a cabo la alimentación' se llevara a cabo una segunda "ermentación para un volumen "inal del medio a ;= ml de solución

T!b"! N9 : Co3$osi%in De" Me4io De ;e3ent!%in II Com(osici)n del Medio de Cl*ivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 (ara n crecimien*o en &iomasa de .6, gl. (ara n volmen de 16ml. En*onces se *endr7: @*6.7#g/"


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO Element o

Nutriente

YX/S

Extracto de levadura

N

(NH4)2SO4

2.36

P

KH2PO4

11.38

K

KH2PO4

5.4

!"

!"SO4H2O

24.66

So (gr/l)

S´o (gr/l)

Pesos (g)

1.800 1.45 4 0.30 1 0.06 0 0.13 9

2.181

3.489

0.451

0.22

0.089

0.143

0.208 10.00 0

Extracto de #ale#

2.880

0.333 16.000



#.6.

DETERMINACI5N DE LA CONCENTRACI5N CELULAR POR

D.O. El método se basa en el aumento de la turbidez del medio' al incrementarse la concentración de microorganismos a medida que avanza el tiempo' esto puede ser detectado "ácilmente por espectro"otometría a =-nm.

Para ésta

determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado' para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento+


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO •

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>e toma una muestra de volumen conocido' y se centri"uga a ;<rpm. )urante < minutos.

•

>e elimina el sobrenadante y se resuspende el centri"ugado con agua destilada.

•

>e vuelve a centri"ugar en las mismas condiciones a "in de eliminar restos de sustrato que pudiera alterar la determinación.

•

>e elimina el sobrenadante' se redisue4ve el precipitado y se seca en la estu"a a MJ* hasta peso constante.

PREP,R,*48$ )E >,!E>

$a$l2 .2H2O% 1.12 "&' SO4.H2O% 0.11 "&' *eSO4.H2O% 0.06 "&' $uSO4.5H2O% 0.05 "&' $o$'2.6H2O% 0.01 "&' !oO3 % 0.0005 "&' !$l2.6H2O% 0.02 "&'

>e peso todas las sales

Na$l % 0.28 "&'

en la balanza analítica.


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*ada sal me mezclo con agua y se le echo a la "iola de un litro.

Luego de hae! "e#ado $oda# %a# #a%e# & de hae!%o e'hado a %a (o%a) a e#$a (o%a #e %e en!a*o 'on

>e mezcló todas las sales y luego se vació a un pomo de vidrio.

#.7.

,l pomo de vidrio se le llevo a la re"rigeradora.

AEREACION


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,lgunas consideraciones que se debe tomar son+

 Proporcionar a los microorganismos el oígeno necesario para llevar a cabo su proceso respiratorio.  !a solubilidad del 8< es baja U ;mg7l ⇒ se necesita alimentar en "orma continua este Onutriente' dado que su demanda es aproimadamente de ;g7l. >e pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con m1ltiples sustratos' pero en el caso que todos son limitantes. Ej' *' $' 8< ' luego la cantidad de cada uno de ellos a"ecta la cinética de crecimiento.

T!ns'een%i! 4e O&geno El comportamiento de las "ermentaciones está "uertemente in"luenciado por una serie de operaciones de trans"erencia. Es posible que una determinada "ermentación' en especial las aeróbicas' esté limitada en sus posibilidades de mejorar su rendimiento y productividad' no por razones propias de las características de las células sino que por problemas en el dise#o que permita satis"acer la alta demanda de trans"erencia de masa' y en especial de oígeno.

 $ecesidades de )ise#o >e dise#o de un sistema de aireación2agitación debería satis"acer que+ )EA,$), )E 8C4BE$8 H 8ER:, )E 8C4BE$8 Por otra parte' el crecimiento microbiano se puede representar por+ ;*a0 b8* T m $0K T n 8< , q *d0e8 $ " g T r *8< T t 0<8 T u *h0i8 j $Q *d0e8 $ " g+ @iomasa *h0i8 j $Q + Aetabolito etracelular


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)e acuerdo con la ecuación anterior' el rendimiento de oígeno en células se puede calcular por medio de la relación entre On y Oq >i no se producen Aetabolito etracelular' Ou igual a cero 

mVs+ Peso molecular de la "uente de carbono y energía

 Proceso de trans"erencia de oígeno %8ER:,&  Etapas %i&)el seno de la burbuja a una capa interna de gas %ii& )i"usión en la capa interna de gas. %iii& )i"usión a través de una capa eterna de líquido que rodea a la burbuja WEtapa limitanteX %iv& :rans"erencia al seno del líquido %v& )i"usión a través de la capa de líquido que rodea a los microorganismos WEtapa limitanteX %vi& )i"usión en el interior de los microorganismos


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 Gelocidad de :rans"erencia de 8ígeno por área inter"acial !a velocidad de trans"erencia por unidad de área inter"acial' Y' está dada por+ Y H Q l %*i Z *& *omo en la inter"ase se supone que hay equilibrio entre el oígeno en el gas y el disuelto.

Y H Q l %*i Z *&H Q B %P Z Pi& !as cantidades Pi y *i resultan di"íciles de determinar en la práctica' se pre"iere hacer uso de las relaciones de equilibrio' trabajando con las concentraciones y presiones de equilibrio *[ y P[. *on ello se trabaja con la O Gelocidad de trans"erencia de oígeno volumétrica' $,

 Gelocidad de :rans"erencia de oígeno volumétrica *uando el control de la trans"erencia de 8< se encuentra en el "ilm líquido que rodea a la burbuja o a los microorganismos' la velocidad de trans"erencia de oígeno' $, se puede epresar como+ $, H Q !a %*[ 2 *& H 0 Q !a %P Z P[& >e supone que hay equilibrio entre el oígeno del gas y el disuelto en el líquido. Q !+ *oe" volumétrico de trans"erencia de 8< a la "ase líquida %cm7hr& a + ,rea inter"acial especí"ica %cm<7mK& Resulta di"ícil de medir  %Q !a& *[+ *onc. de 8< en el equilibrio %mA7!& %0ipotético& * + *onc. de 8< disueltro en el seno de la "ase líquida %Este valor no puede ser in"erior *crítico ≈ ;mg7l& P[ + Presión de 8< en el equilibrio P + Presión de 8< en el seno de la "ase gas. 0 + cte. de 0enry..

 @alance de 8ígeno


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>e puede plantear una ecuación de balance de oígeno en el "ermentador+

8< que entra Z 8< que sale Z 8
Para que el cultivo pueda crecer sin limitación de 8ígeno' el suministro debe ser igual a la demanda.

 Aétodos de determinación Q ! a Para la adecuada operación de un "ermentador se hace necesario conocer el valor del coe"iciente volumétrico de trans"erencia de 8< Q ! H " %>c' >n' BR & Q ! ×a a H " %)K<' 0& •

Aedición de los "lujo de 8ígeno o o o o

:itulación 8idación de sul"ito de sodio Eliminación del 8< Aétodo )inámico.


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO o o

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@alances de masa Aedición )irecta con analizador de 8<


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Estimado mediante *orrelaciones o

Aétodo del sul"ito de sodio >e basa en la rápida reacción química de oidación del sul"ito a sul"ato mediante 8<. >e reemplaza el medio por solución de sul"ito de sodio %sul"ato c1prico como catalizador& y se burbujea aire por un cierto tiempo. >ul"ito T 8< , >ul"ato

Q !a *[ + Representa la máima velocidad volumétrica de trans"erencia de 8< en un sistema dado %"ermentador&.

o

Aétodo dinámico En este caso la medición se realiza en el "ermentador durante el crecimiento de un cultivo activo' registrándose el oígeno disuelto. El proceso tiene < etapas. Etapa ;+ )urante la "ermentación se corta el suministro de aire %:;& y se registra la disminución de 8< disuelto. En este caso el suministro es nulo.

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!a pendiente de la curva es la demanda de 8<+

El "lujo de aire se repone antes que se alcance la concentración crítica de oígeno' *c %bajo este valor la velocidad de metabolismo se hace dependiente de la concentración *' pudiéndose causar da#os irreversibles en los m.o.&. *c \ .;[*oncentración de >aturación

@ajo estas condiciones se cumple+


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)esde la cual se despeja el término %2;7Q !a&

)epende de la velocidad de respuesta de los electrodos

o

Aétodo medición directa Para aplicar este método se utiliza un electrodo de oígeno disuelto y sistemas para determinar oígeno en la "ase gaseosa. En este método se calcula la demanda de oígeno midiendo el "lujo de aire y la concentración de oígeno en las corrientes gaseosas de entrada y salida. *on estos valores y la lectura de oígeno disuelta' se calcula Q !a. 8< que entra Z 8< que sale H 8< que se trans"iere H Q ! a %*[ 2 *& Aétodo de alto costo debido al equipamiento analítico requerido.

#..

A(ITACI5N

!a agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias "ases. ?na "ermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres "ases' que implica reacciones líquido2sólido' gas2sólido y gas2líquido.

 !a "ase líquida contiene sales disueltas' sustratos y metabolitos. Puede eistir' en algunos casos' una segunda "ase líquida si eiste un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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 !a "ase sólida consiste en células individuales' bolitas de micelio' sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan.  !a "ase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oígeno' para la eliminación del *8< o para el ajuste del p0 con amonio gaseoso. ?na adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la "ermentación ya que produce los siguientes e"ectos en las tres "ases+

 )ispersión del aire en la solución de nutrientes.  0omogeneización' para igualar la temperatura' p0 y concentración de nutrientes' en el "ermentador.  >uspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos.  )ispersión de los líquidos inmiscibles. @ajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación' mejor será el crecimiento. >in embargo' la agitación ecesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto' se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el da#o celular. !a agitación es una operación muy importante tanto del punto de vista técnico como económica. !a agitación es importante para+ ] ]

un mezclado homogéneo ?na buena trans"erencia de masa y de calor' permite disminuir el espesor de la película líquida estática.

 )ise#o del sistema de agitación El sistema de agitación tiene la "unción de generar la potencia necesaria para producir una mezcla per"ecta para el sistema de cultivo y producir un régimen de agitación adecuado que' maimice la di"usión de gases en el líquido y minimice la producción de es"uerzos cortantes y la presión hidrodinámica local y global' para optimizar los "enómenos de trans"erencia de momentum' calor y masa. ?n sistema de agitación consta de cuatro partes mecánicas+ BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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 Moto I3$-"so+ suministra la potencia al eje de potencia( debe ser de corriente alterna %a.c&' pre"eriblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble %</& de la potencia teórica requerida para agitar el "luido y el cultivo a Re^K. Aotor de 4nducción %,.*&+ dado que un biorreactor debe operar de "orma continua durante todo el proceso de cultivo( se requiere un motor capaz de resistir largos periodos de operación continua y trabajo duro( por eso' el motor debe ser de inducción de corriente alterna %a.c& y debe ser acorazado' pre"eriblemente en acero inoidable.  Eje t!s3iso 4e "! $oten%i!: es una barra cilíndrica de acero inoidable K;=! y por lo general se dise#a en diámetros estándar+ _' `' etcétera para mayor "acilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. >u longitud depende de la pro"undidad del contenedor %tanque&.  A%o$"e 4e" Eje T!ns3iso: ajusta y "ija al motor' el eje transmisor de potencia. Eisten dos tipos de acople+  A%o$"e?!4!$t!4o 4e ti$o t!"!4o+ el puerto de entrada se acopla al eje del motor por "ijación directa. El puerto de salida es un dispositivo que se adapta a varios diámetros de broca y sujeta o abraza "irmemente el eje transmisor de potencia por presión y abrasión( similar al que utilizan los taladros mecánicos.  A%o$"e?!j-st!4o 4e ti$o toni""o?os%!+ el puerto de entrada se Oenrosca o se "ija "irmemente al eje del motor. El puerto de salida es un dispositivo que Oabraza el eje transmisor de potencia por un mecanismo de tornillo2rosca. En ambos casos' el diámetro del puerto de entrada del acople que es la unión de éste con el eje del motor debe ser de diámetro interno igual al diámetro eterno del eje del motor y el diámetro del puerto de salida que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser el mismo que el diámetro eterno del respectivo eje.

#.=.

ESTERILIACION

Esterilización signi"ica la eliminación de toda "orma de vida de un medio o

material' lo que se lleva a cabo generalmente por medios "ísicos' por ejemplo' "iltración' o por muerte de los organismos por calor' productos químicos u otra vía. !a razón "undamental para e"ectuar la esterilización en Aicrobiología 4ndustrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos especí"icos que se utilizan en un proceso de "ermentación de los rendimientos esperados en biomasa y7o metabolitos especí"icos.

M8*odos de es*eriliaci)n BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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!os métodos de esterilización pueden ser de K tipos+ a& Por destrucción total de microorganismos Por destrucción total se entiende un proceso muy violento' que casi siempre implica calentamiento apreciable del material' como ocurre con la aplicación de una llama' que es lo que hacemos en el laboratorio cuando "lameamos un ansa de platino olas bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. 8tra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oidantes. Por supuesto ésta metodología' aunque es e"ectiva' está muy restringida en su empleo. b& Por muerte o inactivación !a muerte o inactivación signi"ica la eliminación de microorganismos sin que eista necesariamente desintegración de las células. >e puede e"ectuar por calentamiento' seco o h1medo' por radiaciones o por agentes químicos. El calor h1medo' generalmente en "orma de vapor bajo presión' es muy 1til y de gran valor en la esterilización en el laboratorio' que se e"ect1a en autoclave' o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de "ermentación. En el caso de los autoclaves' se pueden alcanzar presiones de ; a K atmós"eras. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor saturado bajo presión' y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema %como ocurre también en el caso de los autoclaves& porque la trans"erencia de calor disminuye mucho en ese caso. )espués de la esterilización se mantienen las condiciones asépticas' haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.

c& Por eliminación con medio "ísicos. !a eliminación "ísica está restringida a la esterilización de gases líquidos' y es "undamentalmente llevada a cabo por "iltración mediante "iltros absolutos o "iltros "ibrosos.


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!os "iltros absolutos son de materiales cerámicos' de vidrio o de metal sinterizado con poros tan peque#os que la penetración de los microorganismos no es posible. !os "iltros "ibrosos no son absolutos y el material "iltrante puede ser lana de vidrio' amianto y esteres de celulosa' siendo las "ibras de un diámetro variable de .L a ;L micrones.

Cin8*ica de la es*eriliaci)n (or calor !a cinética de la esterilización por calor h1medo' que es la 1nica que consideraremos en ésta monogra"ía por su aplicación a la esterilización de medios de "ermentación' está caracterizada bastante aproimadamente por una reacción cinética de primer orden. >i $o es el n1mero de organismos viables presentes inicialmente y $ es n1mero viable al "inal tendremos que la ecuación de velocidad de muerte será+ %;&e integrando entre los límites $o a tiempo H  y $ al tiempo t H t' se obtiene

$7$o es la "racción de organismos viables que sobreviven después del tratamiento por calor durante el tiempo t y D H constante de velocidad de destrucción' que depende de la temperatura seg1n la clásica ecuación de ,rrhenius+

)onde+

, H constante E H energía de activación R H *onstante general de los gases : H :emperatura en grados Delvin

>i se grá"ica el 4n Q en "unción de ;7: se obtendrá una línea recta' siendo la inclinación igual a 2E7R y la intersección de la recta con la ordenada' el valor de la constante de ,rrtherius. BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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En la práctica de la esterilización es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible' razón por la cual' es imprescindible dise#ar un ciclo de esterilización lo más e"ectivo posible pero al mismo tiempo lo más corto posible. Podremos de"inir un término nabla %G& que representa la magnitud de la disminución del n1mero de organismos viables de manera que+

6 por tanto

>in embargo' como ya dijimos' parte de la destrucción ocurre en la etapa de calentamiento y otra parte en la de en"riamiento' de manera tal que+

!as partes de calentamiento y en"riamiento son obtenidas a temperatura variable de manera tal que es necesario integrar la ecuación+

#.8. •

para el período de calentamiento y de en"riamiento con el "in de calcular la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos períodos. *onociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a ;< * para la esterilización completa del mismo. MONTAJE DE E,UIPO El biorreactor antes de ser puesto en marcha se llenara con alcohol de S=J para ser esterilizado.

•

El biorreactor será puesto en marcha con un volumen inicial igual a .3L!t para llegar a un volumen "inal de ;.=L!t y utilizando la siguiente "ormula+


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>e determinó q el tiempo de "ermentación será de = h para un "lujo constante de alimentación de %K7<&!t7h. •

>e trabajara con ;'L vvm y ;L rpm como será un cultivo por lote alimentado aireado no habrá "lujo de salida.

%t& >R %t&

G" ' C" GR H G" 2 G. G.' C.' >.

RE>ERG8R48

@8A@, @48RRE,*:8R

•

Para esta eperiencia se utilizara un El sistema !i"lus BC "ermentación es un "ermentador a escala de laboratorio' que está dise#ado para la "ermentación de usos m1ltiples. Garios esquemas de "ermentación' tales como "edbatch e incluso el cultivo de células animales pueden ser pertalined con la serie @ioBA. El monolítico monitor !*) se instala en el cuerpo de la torre controlador de tama#o medio y se puede visualizar todos los valores medidos y los parámetros de control.


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•

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El biorreactor del laboratorio es un biorreactor marca boitron2 li"lus BC. El biorreactor del laboratorio de la universidad nacional del santa posee las siguientes partes+

       

)eterminación de P0 %-.<& >ensor de P0 >ensor de :J >ensor 8ígeno )isuelto. ,ntiespumante *ondensador Aotor de rotor Posee cuatro bombas peristaticos+ acido2 base2 alimentación2

espumante  < >ensores de aire %;/&  ?n vaso con capacidad de =lt


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1. #. 6. 7. . =.

#.<.

Senso 4e es$-3! Con4ens!4o Moto Senso 4e O.D Senso 4e P Senso 4e TF

PREPARACION DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS

1L0  Pesar las correspondientes sales que con"orman nuestra solución de sales concentradas para sepa de SaccharomycesCerevisiae ,:** -;<= lo cual se muestra en la guía de P%ti%! 4e Bio$o%esos+ uente de *a

+

<'S g *a*l<. <0<8

uente de e

+

.=S g e>8-.30<8

uente de *u

+

'8-.L0<8

uente de *o

+

'<- g *o*l<.=0<8

uente de Fn

+

'-;L g Fn>8-.30 <8

uente de Ag

+

<'< g Ag>8-.30<8

uente de @

+

.= g 0K@8K

uente de *l

+

0*lconc.


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 *ada compuesto se pesara con cuidado.  !uego de pesar' cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de precipitado adicionándole ; ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio' la solución se colocara en una "iola de ; litro y se enrazara con agua destilada hasta completar ;litro.

 ?na vez realizado el preparado se llevara a re"rigeración para su posterior utilización.

#.>.

SOLUCI5N BU;;ER O TAMP5N

?na solución bu""er o tampón o amortiguadora es una mezcla de un ácido débil y una base débil' la cual se puede obtener mezclando un ácido débil con una de sus sales correspondientes' Otampón ácido' puesto que el anion del ácido es una base débil. :ambién se puede preparar la solución amortiguadora mezclando una base débil con una de sus sales correspondientes Otampón básico. El ácido débil reacciona con cual quien cantidad de 802 agregado' mientras que el papel de la base débil es consumir el 0T que pueda haberse introducido. Esto impide que se perturbe en mayor grado el equilibrio+ 0<8 0T T 802 y del cual dependa el

P0 mayor de la solución.

El e"ecto amortiguador de estas soluciones se presenta cuando se les agrega peque#as cantidades de ácidos "uertes o bases "uertes. El responsable de este e"ecto es una o más reacciones que ocurren dentro del sistema y en las cuales se consume casi totalmente el ácido o base agregados. Esta reacción puede determinarse "ácilmente sobre la base del equilibrio que predomina en el sistema aplicando el teorema de *hatelier y teniendo en cuenta que siempre que un ácido esta en presencia de dos bases reacciona con aquella que produzca la sustancia más estable o que posee la menor constante de disociación y lo mismo puede decirse si se trata de una base en presencia de dos ácidos.


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III. MATERIALES INTRUMENTOS G REACTIVOS 6.1. Me4io 4e 3!nten%in H esie3b! 4e" 3i%oog!nis3o. M!tei!"es H e-i$os  @alanza analítica  8lla a presión  Aechero @unsen  Pipetas de ; ml.  ,za bacteriológica  :ubos de ensayo con tapas %M tubos&  Garilla de vidrio  Aatraz Erlenmeyer %
•

Re!%tivos  Auestra+ Saccharomycescerevisiae ATCC 4126  >ustrato+ sacarosa  ,gua destilada.  Etracto de levadura.  Peptona.  ,gar.

6.#. Me4io 4e !%tiv!%in M!tei!"es H e-i$os  Aatraz de

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 :ubos de ensayo con tapa  ,lgodón  Basa  Garilla de vidrio  @alanza analítica  Espátula  ,gua destilada  Pinzas  Buantes  >haQer  Aechero @unsen' trípode y rejilla.  8lla a presión  Pipetas  *apachos de papel metálico. Re!%tivos  *omponentes seg1n :abla $J <  ,lcohol  0*lcc. 6.6.Me4io 4e 'e3ent!%in H $o"i'e!%in M!tei!"es H e-i$os Aatraz de ; ! Aatraces de ;
Re!%tivos BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO >eg1n la tabla $J K

y L de aneos

,gua destilada ,lcohol

IV. CRONO(RAMA DE ACTIVIDADES: T!b"! NF: Programación y actividades a realizar ,*:4G4),)E> Re%e$%in 4e g-&! 4e $!%ti%!s E$"i%!%in 4e" $o%e4i3iento

4e

E*0, <7;;7; <7;;7;

$%ti%!. Pesent!%in

4e

37;;7;

$!%ti%!s Estei"i!%in 4e 3!tei!"es $e$!!%in

S7;;7;

4e"

$ein'o3e

4e 3e4ios e ino%-"o $!! "! %-v! 4e %!"ib!4o To3! 4e 3-est!s $!! 4ete3in!%in 4e "! %-v! 4e %!"ib!4o $i4o Pe$!!%in 4e inst-3entos H estei"i!%in 4e "os 3is3os Pe$!!%in 4e" 3e4io 4e !%tiv!%in Ino%-"!%in !" 3e4io 4e !%tiv!%in Pe$!!%in 4e" 3e4io 4e 'e3ent!%in Ini%io 4e "! %inKti%! H to3! 4e 3-est!s Dis%-sin H %on%"-sin 4e "! e$eien%i! I3$evistos 4e "! e$eien%i! Pesent!%in 4e" in'o3e 'in!"


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;=7;;7; <<7;;7; <<7;;7;
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V. BIBLIO(RA;IA •

ay' . ;SS-. Microbiología Moderna de los Alimentos. Faragoza' Espa#a+ ,cribia.

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)oran A' P. Principios de Ingeniería de los ioprocesos. Faragoza' Espa#a+

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4nstituto Politécnico $acional. <3. !aboratorio de iorreactores" Man#al de Pr$cticas. Aéico. p. -M

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VVV.sciencedirect.com

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AE)48> )E ERAE$:,*48$.P) Mi%obio"og&! (ene!" :ema <.2 C-"tivo 4e 3i%oog!nis3os.PD; )ise#o de "ermentadores o bioreactores.P) http+77darVin.usal.es7pro"esores7p"mg7se"in7A47tema;
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sumergido7"ermentadores2cultivo2sumergido<.shtml http+77es.ViQipedia.org7ViQi7@iorreactor)ise.*K.@;odeun@iorreactorde:anque

• • • •

,gitado


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ANE*OS

En "! (-&! 4e $%ti%!s 4e %-so L!bo!toio 4e Bio$o%esos se $!te 4e "!s sig-ientes %on4i%iones: Re'een%i!s 4e %o3$osi%in 4e 3e4ios 4e 3!nten%in !%tiv!%in H %-"tivo $!! SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126 BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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AE)48 So"i4o 4e 3!nten%in GM so"i4o0

A%tiv!%in

;e3ent!%in

$?:R4E$:E Etracto de levadura Peptona Etracto de malta ,gar Blucosa >acarosa Etracto de levadura Etracto de malta >olución de sales >acarosa Etracto de levadura %$0-&<>8D08-.30<8 >olución de sales p0 -'<

*8$*E$:R,*4N$ %BR7!& K L K < ; ;L K L L ml7! ;.M

; ml7!

Con4i%iones 4e %-"tivo: te3$e!t-! 69C H ve"o%i4!4 4e !git!%in #22 $3 en e" !git!4o obit!" s!e0 COMPOSICI5N DEL M.O: *8AP8$E$:E> * $ Ag D P

/ )E *8AP8>4*48$ -L / S/ .- / .L / <. /

3!  2.68 ?1 en g"-%os! ! 69 C  L!ne M. H MoisseH J. #212

COMPOSICION

DE

NUTRIENTE

g0

PARA UN

MEDIO

DE

MANTENCION PARA 23" N-tiente BO RATO RI O DE

Etracto de !evadura Etracto BI OP RO C E S Ode S malta Peptona ,gar l

So g/"0 K GKR U P O L <

So g/23"0 B- 4

.;L .;L .
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PREPARACI5N DEL MEDIO DE ACTIVACI5N $?:R4E$:E

*8$*E$:R,*4N$ %B7!&

PE>,R %B&

>acarosa

1

2.##

Etracto de

6

2.27

!evadura Etracto de Aalta



2.28

>olución de >ales

 3"/L

2.283"

Ta&la "0 2: Com(osici)n de medio de Ac*ivaci)n +(ara 1, ml de solci)n/

2.9.1. PREPARAC!" #E$ ME#% #E ERME"TAC!" T!b"! N9 6: Co3$osi%in De" Me4io De ;e3ent!%in I Com(osici)n del Medio de Cl*ivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 (ara n crecimien*o en &iomasa de 1.3 gl. (ara n volmen de 1ml. El dise5o del medio se reali) en n ma*ra Erlenmeyer de ,ml. Elemento

$utriente

*

>acarosa %*;<0<<8;;&


/ en *élula -L

/ en $utriente -<';L

6 7s %g7g&

> %g7l&

> %g7l&

'-=3M

K'M-3M

K'M-3M

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pesar %gr& 2.6<78

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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO $ D Ag

P

? ?

S

<;'<;

<'KL=3

'3=KM

;';-L3

2.117=

'L

L3'KL<

'K;-

'-3;

2.2278

'-

S'M=

<-'=L

'3K

';SL

2.21>

<

<<'3S

;;'KSL

';LM

'
2.2#6= >

Etracto de !evadura >olucion de sales

2

2

2

2

;'M

2.1<

2

2

2

2

; ml7!

1


!a "ermentación se realizara en un matraz de L ml.

T!b"! N9 7: Co3$osi%in De" Me4io De ;e3ent!%in I Com(osici)n del Medio de Cl*ivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 (ara n crecimien*o en &iomasa de 1.3 gl. (ara n volmen de 3ml Elemento

$utriente

*

>acarosa %*;<0<<8;;&


/ en *élula -L

/ en $utriente -<';L

6 7s %g7g&

> %g7l&

> %g7l&

'-=3M

K'M-3M

K'M-3M

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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO $ D Ag

P

? ?

S

<;'<;

<'KL=3

'3=KM

;';-L3

'L

L3'KL<

'K;-

'-3;

'-

S'M=

<-'=L

'3K

';SL

<

<<'3S

;;'KSL

';LM

'
Etracto de !evadura >olucion de sales

2

2

2

2

;'M

2

2

2

2

; ml7!



T!b"! N9 : Co3$osi%in De" Me4io De ;e3ent!%in II Com(osici)n del Medio de Cl*ivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 (ara n crecimien*o en &iomasa de .6, gl. (ara n volmen de 16ml. En*onces se *endr7: @*6.7#g/" Element o


Nutriente

YX/S

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So (gr/l)

S´o (gr/l)

Pesos (g)

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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO Extracto de levadura

N

(NH4)2SO4

2.36

P

KH2PO4

11.38

K

KH2PO4

5.4

!"

!"SO4H2O

24.66

1.800 1.45 4 0.30 1 0.06 0 0.13 9

2.181 0.451 0.089 0.208 10.00 0

Extracto de #ale#

2.880 3.489 0.22 0.143 0.333 16.000


uente de carbono y energía+ >acarosa %*;< 0<< 8;;&' A K-< g

G*/S / de * en el nutriente 7 / de * en la célula. / de * en el nutriente H ;<%;<&  ; / K-< H -<.;L / / de * en la célula

H -L /

G*/S%-<.;L7-L& 2.= %este "actor por ser aireado& G*/S  .SK= .L H .-=Mg7g

1.

CALCULO DE  NUTRIENTE:


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S!%!os!+ *;< 0<< 8;;

•

;/

PA H K-<

•

K-<

•

KS.;

•

;/



  #<.86

;<;<

•

;K=.;



N70#SO7:

•

PA H ;K<

•

  7#.12

;K<

•

Q#PO7

;/

•

P:



  #1.#1

PA H ;K=.;

•

•

;K=.;

•

•

K;

;/

MgSO78#O



PA H <-=.K

•

  ##.888

•

Q#PO7

•

Q:

;/

<-.K



  >.<==

PA H ;K=.;

•

#.

<-=.K

CALCULO DE G*/S:

•

• •

S!%!os!: •

•


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67sH%-<.;L7-L&2.

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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO G/s 2.7=
•

•

G/s 8.7= g7g

•

•

•

Q#PO7:

N70#SO7:

P:

67sH%<;.<;7S&

•

67sH%<<.3337<&

•

•

G/s #.6=8 g7g

•

•

G/s 11.6<< g7g

MgSO78#O 67sH%S.M==7.-&

•

Q#PO7: Q:

•

67sH%
•

•

G/s #7.== g7g

•

6.

CALCULO DE S2

S!%!os!:

Q#PO7

•

P+

•

•

.-=MH ;.M7>

•

>H ;.M7.-=M

S2  6.<7=#g/" •


•

>H %;.M7;;.KMML&;.L

S2  2.#681 g/" Q #PO7 •

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D+

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S2  2.12>7= g/"

>H %;.M7L3.-=&;.L

S2  2.27=><> g/"

•

Et!%to 4e "ev!4-! : • •

N70#SO7: •

>H ;.M •

So"-%in 4e s!"es

>H %;.M7<.KL=3&;.L

•

S2  1.17=8 g/" MgSO78#O

>H ;ml7!

• •

•

•

•

>H %;.M7<-.==L&;.L

•

COMPOSICION DE SOLUCIONES DE SALES: •

*8AP8$E$:E>

*8$*E$:R,*48$ %gr7!&

*a*!<'<0<8 Fn>8-.30<8 e>8-.30<8 *u>8-.L0<8 *o*!<'=0<8 Ao8K An*!<'=0<8 $a*l •

DESARROLLO DE LA ;ERMENTACION CAPACIDAD #L0 •

MEDIO DE ALIMENTACI5N: $!! 12223" 4e so"-%in0 • •

)ato del biorreactor+ ;  #.=83"/ 3in  2.1=0L/ 

*2  ;.M gr7!


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO S2  2 •

S'  K.33 gr7!

• • •

CONDICIONES INICIALES DADAS: •

CO/POSICIO ELE/ETAL DEL /ICROORGAIS/O C 45%

N 9%

Mg 0.4 %

K 0.5 %

P 2.0 %

•

Ca%'u%eo# e% 3#5 $eniendo a %a 6uen$e de Ca!o!no Sa'a!o#a8 'oo 6a'$o! %ii$an$e5 a#i $eneo#9

•

•

67sH%-<.;L7-L&.L

G/s 2.7=< g7g •

,sí mismo' de acuerdo con las condiciones de cultivo+ •

umaH.K3h2; •

:HKL* •

Golumen :otal del "ermentadorH
:iempo total del *!,H =h


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•

*omo sabemos' el *!, con aireación necesita antes el microorganismo tener un *?!:4G8 P8R !8:E' en el cual haya comenzado su crecimiento eponencial' hasta obtener hemos creído conveniente una concentración de células de
Con4i%iones $!! e" CULTIVO POR LOTE •

GoHMml •

CoH.
C"H
@*1.< g/" •

>oH •


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>upongamos que tras el inicio de la "ermentación' tenemos que encontrar el tiempo óptimo donde se inicia la "ase de crecimiento eponencial' para ello hemos querido conveniente "ijar una fCH;.Mg7!' suponiendo que se ha consumido todo el sustrato' entonces tendremos que+ •

>"H %inicio del *!,& •

X f − X 0 Y x / s= S 0− S f

•

En$on'e#5 So:; 1.8 0.468

•

S o=

•

S o=3.8462 g / L

•

Ca%'u%ando e% $ie"o a"!o3iado de 6e!en$a'i
•

t =

•

t =

1

u max

x f

ln (

1

(0.37 )

x o

ln

(

) 2 0.2

) •

t =6.22 horas

Con4i%iones $!! e" CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO En la zona de crecimiento eponencial de masa celular •

•

>oH gr7! •

umaH.K3h2; H .-3 g7g

•

CoH;.Mgr7!

7s

6

•

GoHMml BO RATO RI O DE BI OP RO CE SO S

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•

IOMASA I%ICIA!%CoGo&H %;.Mg7l&%.M!&H;.--gr •

)e acuerdo a la bibliogra"ía revisada' hemos creído conveniente trabajar con un volumen "inal de ;.=! %M/ del volumen total&' entonces se tendrá+ •

*omo el tiempo total del *!, H =horas •

V − V 1.6 −0.8 dV = F entonces : F = f 0 = =0.16 L / h =2.67 ml / min dt t 5 • •

•

*ondiciones de transición • •

*omo se tiene dos zonas de crecimiento' por teoría sabemos que se debe cumplir+

Bio3!s! $o4-%i4! en "! on! 4e %e%i3iento e$onen%i!"

• • • • • •

Entonces debemos calcular el tiempo de transición' a partir de+ • •

%CG& crecimiento eponencialH %CG& crecimiento limitado

•

,simismo se debe cumplir' para un buen desarrollo del microorganismo' teniendo un tiempo de transición H<.Lhoras •

•

En$on'e#5 #aeo# >ue9


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@48A,>, F8$, *RE*4A4E$:8 ECP8$E$*4,!H @48A,>,F8$, *RE*4A4E$:8 !4A4:,)8

• • •

u t CoGo e ma. H >" 6C7> t T >oGo T CoGo )espejando >"' obtenemos que+

•

S F =

( XoVo eu

max

.t T

−SoVo − XoVo )

F Y X / S t T

Reemplazando+ (1.8∗0.8 e 0.37∗2.5 −0∗0.8−1.8∗0.8 ) S F = 0.16∗0.47∗2.5 •

S F =11.66 g / L •

En la zona de crecimiento limitado de masa celular •

:endremos que+ •

CGH >" 6C7> t T >oGo T CoGo. %&

•

*omo seg1n la bibliogra"ía revisada' se tiene que C"H 

•

Entonces en G"H ;.=!' se tendrá+

•

,simismo' >"H

y >oHgr7l

•

)e la ecuación %&' reemplazamos los datos obtenidos+ •

CGH %.;=&[%;;.==&[%.-=M&[%L& T ;.M[.M •

CGHL.MLLgr de biomasa •

*omo+ G"H;.=! •

C"H %L.MLL7;.=&HK.=
,>4A4>A8+ >"H


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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO • •

, partir de+ >abiendo que+

QsH.; •

umaH.K3h2; H .-3 g7g

•

7s

6 •

Reemplazando+ (0.16∗11.66∗0.467∗0.01) S F = 0.16∗11.66∗0.467 ( 0.37∗5−1 ) + ( 0 + 1.8∗0.8 )∗0.37 •

• •

S F =0.01368 gr / L

•

•

 CALCULO DEL VALOR DEL NA+ NA=

•

µ. x yo 2

)onde+

•

$,+ Gelocidad de *onsumo de 8igeno

• •

+ @iomasa

•

6o<+ Rendimiento de 8<

El valor de ? teórico para la >accharomyces cerevisiae es '- h2; y el rendimiento de 8< es de ;'
( ) 0,4

•

NA =

1

h

(

( 1,25

5 g cel.

L

)

gO 2 ) L . h

•

NA =1,6

gcel gO 2

•

 *alculo del valor del D !,+


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•

LA =

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NA

(!L∗−!L)

•

)onde+

•

*![+ *oncentración *rítica de 8igeno disuelto

•

*!+ *oncentración de 8igeno disuelto

El valor de *![ teórico para la >accharomyces cerevisiae es '= mg 8<7! y el *! es de < / del valor de *![' entonces es ';< mg 8 <7!. •

•

•

cel (1,6 g ) gO 2 LA = ( 0,6−0,12 ) mgO 2 L


LA =3333,3 gcel / L

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• •

PREPARACION DE SOLUCION TAMPON • •

,H L3.L g ácido cítrico7
•

Entonces+ ,kH %L3.L7;S<.;K[
•

@H
@kH %
•

!uego' se tomo+ •

P.AH;S<.;Kgr7mol

P.AH;3.;- gr7mol

;L3.L ml , T S<.L ml @

D80 •

T

•

• •

Entonces tendremos que+

•

,kH %;.;S[;L3.L7L&H.K3LA

•

@kH %;.3K[S<.L7L&H.K
•

pQaHK.;K

•

p0 HpQa T log%salk7acidok&

•

p0 H K.;K T log%.K<7.K3L&

•

p0inicial H K.3<=' se utilizó D80 para ajustar el p0 a -.<

• •

•

>olución :ampón+ L ml p0 citratoH -.<

ajuste p0 0*l y

CLCULO DE LA VELOCIDAD DE AIREACI5N ESPEC);ICA: VVM • − 4 NA #T

""m =2,035 # 10

•

•

)onde+ •

• •

$

$,+ Gelocidad de *onsumo de 8igeno

•

:+ :emperatura en D

•

@+ E"iciencia de ,bsorción

!os valores típicos de vvm+

!aboratorio+ 'L Z <. vvm •

El valor teórico del vvm es 'L

g.% a nivel de laboratorio. L. h

• • • • • •

 CLCULO DEL CAUDAL DE AIRE: , •

&= ""m#VL

• •

)onde+

•

vvm+ Gelocidad de ,ireación Especí"ica

•

G!+ Golumen del !íquido del ermentador

•

Reemplazando+ G!H ;'M !

•

•

&=0,5

g .%  # 1,8 L l.h

vvmH 'L g.D 7 l.h

•

&=0,9 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

L h

Informe de Bioprocesos- Cla (II Unidad)

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