Informe Enzimas

UNIVERSIDAD DE LA SERENA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA KINESIOLOGÍA

Actividad enzimática de la B-fructofuranosidasa B-fructofura nosidasa Y los factores que influyen en ella Nombre Integrante 1, Javiera Castro, Nelly Rivera, Paulina Kyonen, Abraham Díaz e-mail contacto: [email protected]; [email protected] [email protected];; [email protected] [email protected];; [email protected].. [email protected] RESUMEN Las reacciones químicas requieren de catalizadores para acelerar las reacciones, ya que estos disminuyen la energía de activación. Las Enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, poseen la propiedad de un alto grado de especificidad, esto quiere decir, que una enzima cataliza una reacción donde participa un sustrato determinado o sustratos semejantes. La actividad enzimática estará determinada por distintos factores, por lo que veremos algunos de ellos. El experimento N°1 consiste en la detección de la actividad de la B-fructofuranosidasa en un extracto de levadura, para determinar esto, se utilizaron diferentes materiales y procedimientos que ayudaron a realizar el experimento de forma correcta. Esta enzima es hidrolitica frente a la sacarosa por lo que su actividad se puede evidenciar con la aparición de glúcidos reductores mediante el reactivo DNS, dando productos coloridos que facilitan su observación. En el experimento N°2 observaremos la influencia que tiene la temperatura sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa, Para esto, colocamos las muestras a diferentes temperaturas y así logramos observar que las mas “coloridas” fueron las de mayor temperatura, esto quiere decir que fueron las más rápidas en reaccionar, siendo el máximo punto de reacción a una temperatura de 50°C. En el experimento N°3 comprobamos la influencia que tiene el el pH sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa preparando distintas soluciones con pH desde 2,4 hasta 7,4 pudiendo evidenciar la influencia en la actividad de la enzima, identificando como pH optimo 6, 4( donde la velocidad de reacción es máxima)para la enzima B-fructofuranosidasa .

PALABRAS CLAVE: CLAVE: Enzimas – Catalizadores – Energía de activación – Velocidad de reacción – β fructofuranosidasa – 3,5Dinitrosalicilato Dinitrosalicilato (DNS) – solución amortiguadora – pH – temperatura – Tiempo de incubación. INTRODUCCIÓN En el presente informe detallaremos la función de la B-fructofuranosidasa, la cual es una enzima que tiene acción hidrolitica frente a la sacarosa. Determinaremos esta actividad por medio del reactivo 3,5-dinitrolsalicilato (DNS), el cual nos permitirá medir los productos directamente sin necesidad de cálculos analíticos muy complicados, sin embargo para lograr estas mediciones debemos aislar y purificar, parcialmente, a la enzima para así poder analizar las variables individuales que influyen en su actividad. Es así como en esta sesión de laboratorio reconocemos estas variables (pH, temperatura, tiempo) para determinar la velocidad de reacción de la enzima involucrada procurando que la solución amortiguadora de pH garantice la mantención del pH elegido durante el periodo de observación y que la concentración de sustrato sea lo suficientemente alta para mantener la saturación de la enzima mientras dure el experimento. Además profundizaremos aun más en los factores de pH y temperatura temperatura con dos experimentos, este último factor influye directamente ya que al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de reacción, sin embargo solo puede elevarse hasta cierto punto ya que pasado ese punto la enzima se inactiva, este punto depende de la tº normal de las células en las cuales reside la enzima. Por su parte el primer factor influye en la cinética enzimática debido a cambios en el estado de ionización de los componentes del sistema enzimático. Si se varía esta ionización de los grupos que posee la enzima a nivel del sitio activo o en algún punto lejano, pero que de algún modo altere el sitio activo se afecta el tipo de unión y estabilidad del complejo enzima-sustrato o de la actividad catalítica catalítica misma. Las enzimas son activas en un rango limitado de pH y la mayoría de los casos, se puede encontrar un pH o una zona de pH en la cual la actividad enzimática enzimática es mayor, lo que se denomina pH óptimo (por lo general un pH entre 5 y 9). Hay que considerar además, que la enzima puede inactivarse por desnaturalización a pH extremos y que la estabilidad de la enzima o los sustratos frente a diversos agentes desnaturalizantes desnaturalizantes puede variar en función del pH. La naturaleza de la solución amortiguadora también puede interferir. Los objetivos para este laboratorio son: Determinar los factores que influyen en la eficiencia de la actividad enzimática experimental. Detectar la actividad enzimática de la β -fructofuranosidasa. Estudiar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Título

1



EXPERIMENTO 1. DETECCION DE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA EN UN EXTRACTO DE LEVADURA.

Materiales: Tubos de ensayo, pipetas, agua destilada, parafilm. REACTIVOS: muestra solución de sacarosa (sustrato) 0,45 M; solución glucosa-fructosa 0,01 M; reactivo 3,5dinitrosalicilato ; Buffer acetato pH = 4,7; 0,05 M; solución de extracto β-fructofuranosidasa. Fracción A Solución de extracto β-fructofuranosidasa. Fracción B pH= 4,7 Tº = 27º Stock de enzimas tubo1 tubo 2 tubo 3 tubo 4 + 1ml de enzimas + 6ml agua destilada + 6ml agua destilada +6ml agua destilada + 24 ml agua destilada

1/10

1/250

Tubos a: 1ml buffer acetato + 1ml sacarosa Tubos b: 1,5ml buffer acetato + 1ml sacarosa Se llevan a 27º por 3 min. Patrón: 1ml enzimas 1/2000 + 1ml fructosa sacarosa 0,01m (27º por 3min.) Se agrega a los tubos 1ml de sacarosa cada 30 sg. Menos al patrón. Luego de 5min se agregan 2 ml de DNS a todos los tubos y se llevan a baño hirviendo durante otros 5min. Por último enfriar.

a1

1/500

b1

a2

b2

1/1000

a3

1/2000

b3

a4

b4

PROCEDIMIENTO

1) Confeccionar una curva de calibración para la determinación de la concentración de glucosa- fructosa por espectrofotometría a partir de un patrón. 2) Preparar por duplicado varias diluciones del extracto enzimático tanto de la fracción A, como de la fracción B. Colocar la solución amortiguadora, la solución enzimática y el agua necesaria para completar el volumen de 12 mL, Mezclar. 3) Equilibrar los tubos a temperatura de incubación 27 °C durante 2 a 3 minutos. 4) Iniciar la reacción agregando el sustrato (sacarosa). Registrar el tiempo. 5) Incubar simultáneamente un “blanco” y un “patrón”. 6) Al completarse exactamente el tiempo para la incubación, detener la

reacción agregando 2,0 mL de reactivo 3,5-dinitrosalicilato. 7) Desarrolle el color de todos los tubos llevándolos a un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfríe.8) Completar con agua hasta un volumen de 20 mL. Resultados

Tabla1.- tabla que relaciona la concentración de enzima con la absorbancia

Tubo [] 

Título

 

A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 Patrón

[Solución enzimática] 1/750 1/1500 1/3000 1/6000 1/1500 1/3000 1/6000 1/12000

Absorbancia 1,220 0,676 0,602 0,968 0,557 0,416 0,807 0,483 1,789

[Glucosa] (mM) 1,342E-08 7,480E-09 6,672E-09 1,067E-08 6,180E-09 4,638E-09 8,912E-09 5,370E-09 1,964E-08

Velocidad de reacción (mM de Glucosa/5min) 2,68E-09 1,50E-09 1,33E-09 2,13E-09 1,24E-09 9,28E-10 1,78E-09 1,07E-09 3,93E-09

2



1.60E-08 y = 5.0133x - 1E-11 R² = 1

1.40E-08 1.20E-08 a i c n a b r o s b A

1.00E-08 Fraccion A

8.00E-09 6.00E-09 4.00E-09

y = 5.0085x - 8E-12 R² = 0.9999

Fraccion b

2.00E-09 0.00E+00 0.00E+00

5.00E-10

1.00E-09

1.50E-09

2.00E-09

2.50E-09

3.00E-09

Velocidad de reaccion (mM glucosa/5min)

Grafico 1.- Gráfico velocidad de reacción (mM de Glucosa/5min) en función de la concentración de enzima.

EXPERIMENTO 2. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA.

MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Agua destilada REACTIVOS Glucosa-Fructosa 0,01 M Sacarosa 0,45 M Preparación enzimática Buffer Citrato 0,2 M Reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS)

[] 

  

   



Abs = absorbancia de la solución problema. [Glucosa]= concentración de glucosa de la solución problema.

[] 

[Glucosa]= concentración de glucosa de la solución problema. Tiempo = tiempo de reacción PROCEDIMIENTO

A) Se Preparo baños de incubación a 10°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C y 70°C B) Se dispuso una serie de 12 tubos de ensayo, en el que tres tubos estarán en cada temperatura, uno con muestra el otro patrón y un último control. Al primer tubo se le agrego los componentes del sistema enzimático, excepto el sustrato. C) Se equilibro cada tubo con sus respectivos controles a las diferentes temperaturas de incubación elegidos a iniciar la reacción con el sustrato. D) Se Incubo exactamente durante 40 minutos. Se detuvo la reacción con 3,5-dinitrosalicilato. Se completo volumen a 20 mL con agua. E) Se midió la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. (Fábrega, Maturana, Plaza, 2013)

Título

3



RESULTADOS Tabla 2. Resultados de la temperatura sobre la actividad enzimática en absorbancia, concentración de glucosa y velocidad de reacción.

Tubo

Temperatura (°C)

1 2 3 4 5 Blanco Patrón

10° 27° 40° 50° 60° 27° 27°

Absorbancia 1.296 0.766 4.604 6.82 2.87 0 0.001

[Glucosa] (mM)

v

(mM de Glucosa/min)

7,12 4,23 25 37 15

1.424 0.846 5 7.4 3

Gráfico: velocidad de reacción (mM de Glucosa/min) en función de la temperatura.

EXPERIMENTO 3. INFLUENCIA DEL P H SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA β -FRUCTOFURANOSIDASA MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Tubos de ensayo Pipetas Agua destilada Cubetas espectrofotómetro REACTIVOS Glucosa-Fructosa 0,01 M Sacarosa 0,45 M Preparación enzimática Buffer Citrato 0,2 M Reactivo 3,5 dinitrosalicilato (DNS)

Título

[] 

   

Abs = absorbancia de la solución problema. [Glucosa]= concentración de glucosa de la solución problema.

   

[] 

[Glucosa]= concentración de glucosa de la solución problema. Tiempo = tiempo de reacción

4



PROCEDIMIENTO A)Se prepararon soluciones con 0,5 ml de solución enzimática más 1 ml de sacarosa (0,45M) con pH 2,4; 3,4; 4,4; 5,4; 6,4 y 7,4 B) Se dispuso de una serie de seis tubos de ensayo, uno para cada pH más un tubo patrón y uno control. Se Agrego a cada tubo la solución amortiguadora de acuerdo a la escala preparada. Se incluyó en la serie los controles adecuados y el patrón, se mezclo. Luego se equilibro los tubos a temperatura de incubación obtenida a partir del experimento anterior y se inicio la reacción con el sustrato. C)Se Incubo exactamente durante 40 minutos y a la temperatura previamente establecida. D) Se detuvo la reacción agregando 2,0 mL de solución 3,5-dinitrosalicilato. E) Para desarrollar el color Desarrollar se incubo todos los tubos en baño hirviente durante 5 minutos. y luego se dejo enfriar. F) Se Completo con agua destilada a volumen de 15 mL. G)Se Leyó la Absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda de 540 nm.(Fábrega ,Maturana ,Plaza, 2013) RESULTADOS Tabla 3. Resultados de la temperatura sobre la actividad enzimática en absorbancia, concentración de glucosa y velocidad de reacción

Tubo 1 2 3 4 5 6 Blanco Patrón

pH 2,4 3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 4,4 4,4

Absorbancia 1,487 1,788 1,061 1,367 1,536 1,174 0 0

[Glucosa] mM 8,17 9,81 2,33 1,5 33 25

v

(mM de Glucosa/min) 1,634 1,962 0,466 0,300 6,600 5,000

Figura 3. Velocidad de reacción (mM de Glucosa/min) en función del pH.

Título

5



Fotografía 2.Soluciones con 1,5 ml de buffer acetato , 0,5ml de disolución enzimática y 1ml de sacarosa0,45M.

Fotografía 1.Tubo de ensayo numero 1 a 10° C.

Fotografía 3.Soluciones después de aplicar distintas temperaturas.

DISCUCIONES En este primer experimento logramos determinar la velocidad de reacción de una concentración enzimática determinada, pero ¿qué pasa con las cubetas que se encontraban más concentradas (color más rojizo)?, bueno como los resultados indicaron estas cubetas mas concentradas arrojaron absorbencias muy altas lo que a su vez entregaron concentraciones de glucosa también más altas, por lo que tuvieron que diluirse aquellas cubetas cuyas absorbancias fueran elevadas, es por eso que cada vez que se diluyera una de estas concentraciones al momento de calcular la concentración de glucosa había que multiplicar por 2. Una ciertas cantidad de procedimientos propicios a pequeños errores es la respuesta a la falta de precisión de los datos ya que los factores tiempo y temperatura controlados por nosotros nunca serán 100% precisos. En el experimento sobre la influencia de la temperatura sobre la actividad de la B-fructofuranosidasa, logramos darnos cuenta que la temperatura es un factor muy importante que puede causar grandes cambios en la velocidad de una reacción , en este caso al realizar el procedimiento , todo estaba resultando de manera adecuada a lo que tenía que ser, hasta el momento en que calculamos la absorbancia de cada muestra en la que tuvimos complicaciones con los 3 ,4 y 5 donde tuvimos que diluirlos La enzima posee numerosos grupos ionizables que se ven afectados por el pH al que se encuentren sometidas, esto se comprobó con la realización del experimento llevando la enzima a distintos pH comparando entre ellos la diferencia que existía en la velocidad de reacción, en este caso la hidrolisis de sacarosa, y la correspondencia con la concentración del producto en la solución (glucosa). Lo anterior se ve relacionado con la variación de la ionización de estos grupos a nivel del sitio activo afectando el tipo de unión y estabilidad del complejo enzima-sustrato o la actividad catalítica misma. La grafica se explica teniendo en cuenta lo anterior explicado, donde el p H modifica el estado de disociación de los grupos químicos presentes en la enzima, en el sustrato, el complejo enzima sustrato y con ello puede modificarse la unión. La grafica tiene una forma acampanada ya que la mayor velocidad se encuentra en el pH optimo , generalmente entre 5,0 y 9,0 y el decrecimiento se debe a que a valores extremos de pH puede producirse desnaturalización de la proteína enzimática lo que contribuye a la poca actividad que se observa en esta zona. (Cardellá, 2007) CONCLUSIONES DETECCION DE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA EN UN EXTRACTO DE LEVADURA. Podemos concluir que la actividad de esta enzima (B-fructofuranosidasa) más la acción del DNS nos permitieron obtener los productos adecuados para el análisis de la actividad enzimática experimental por lo cual se cumplieron los objetivos planteados. A su vez pudimos notar que tanto más aislada y pura dejemos la muestra como más resistente sea la solución amortiguadora de pH los resultados serán óptimos teniendo en cuenta también el resto de los factores que influyen en estas actividades. Finalmente hay que destacar la relación directa entre estos factores y la velocidad de reacción con la que actúa la enzima, es decir

Título

6



la capacidad para catalizar los sustratos que se encuentren en la muestra ya sea por acción directa en el sitio activo o algún punto lejano, pero que también influya en este sitio. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA B-FRUCTOFURANOSIDASA. La temperatura es fundamental, ya que puede aumentar o disminuir la velocidad de una reacción, entonces dependiendo a que temperatura tengamos una muestra esta adquirirá diferentes características, si aumentamos la temperatura la energía cinética de las partículas aumenta por lo que se producen más choques y los reactantes formaran en un menor tiempo los productos ya que la energía de activación se disminuyo considerablemente, en nuestro experimento a las temperaturas de 40 a 50°C son las que presentan mayor velocidad siendo 50°C el punto de mayor velocidad donde la enzima mantiene una conformación estable ,desde el punto de vista catalítico, luego la enzima disminuye su velocidad de reacción a una temperatura más elevada en nuestro caso a 60°C por lo que queda demostrado que la temperatura puede ser favorable como perjudicial. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA β -FRUCTOFURANOSIDASA

El índice de casi todas las reacciones catalizadas por encima muestra una dependencia importante de la concentración de ion hidrógeno. Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad óptima a valores de pH entre 5 y 9, como comprobamos en el caso de la enzima β-fructofuranosidasa donde su punto de mayor actividad enzimática se encontraba al pH 6,4 y también es el punto donde se encuentra mayor concentración de glucosa. La relación entre actividad y concentración de ion hidrógeno refleja el equilibrio entre la desnaturalización de enzima a pH alto o bajo, y los efectos sobre el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas cuyo mecanismo comprende catálisis acidobásica, los residuos comprendidos deben estar en el estado de protonación apropiado para que la reacción proceda.( Murray, Bender, Botham , Kennelly ,Roowell , Weil ,2010). REFERENCIAS Debe indicar las fuentes utilizadas en la elaboración de su trabajo, las cuales deben ser fidedignas. La forma de referenciar libros se entrega a continuación: [1] Apellido autor, Inicial nombre mayúscula. & Apellido autor, Inicial nombre maýuscula. (Año publicación). Título cursiva (N° ed). Ciudad de impresión: Editorial. Si se utilizo alguna publicación de revista científica (paper), la forma de referenciarlo será así: [2] Apellido autor, Inicial nombre mayúscula. & Apellido autor, Inicial nombre maýuscula. (Año publicación). Título publicación. Nombre Revista de publicación cursiva. N° Revista: N° página inicial trabajo-N° página final trabajo En el caso que se citen páginas web, estas deben ser de autor conocido pertinente, que le permita confiar e la información entregada. La forma de referenciar págnas web es la siguiente: [3] Apellido autor, Inicial nombre mayúscula. . Nombre página. [En línea]. Disponible en: http://themedicalbiochemistrypage.org/

Título

7

Informe Enzimas

Recommend Documents