UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA BIOLOGÍA MOLECULAR III NOMBRE: David Ramírez TEMA: Digestión de DNA de doble cadena del bacteriófago Lambda con la enzima de restricción Hind III III
OBJETIVOS Objetivo general
Realizar la digestión enzimática del fago lambda con la enzima de restricción HindIII, para visualizar los diferentes fragmentos de ADN mediante electroforesis.
Objetivos específicos
Determinar la actividad de la enzima de restricción
III Hind III
sobre el genoma del
bacteriófago lambda.
Aprender a realizar una correcta digestión enzimática y corrida electroforética.
Identificar los posibles tamaños de los fragmentos que se pueden apreciar en las bandas después de la corrida de electroforesis.
MARCO TEORICO Las enzimas de restricción también conocidas como endonucleasas son extraídas de organismos procariontes, donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que puede entrar en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual cual sirve para diferenciar entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extraño y no el DNA D NA bacterial (Gil, 2009). Existen 3 clases de enzimas de re stricción: Clase l.- es una enzima multimérica con tres subunidades, al reconocer la secuencia específica de ADN, metila y restringe, pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento sino que es realizada a una distancia al azar de la secuencia de reconocimiento. Clase II.- son enzimas que reconocen una secuencia específica en donde realizan la restricción, gracias a su especificidad son muy utilizadas en biología y genética molecular para recuperar secuencias conocidas. Clase III.- las enzimas de clase III son muy similares a las de la clase I; son oligoméricas y reconocen una secuencia específica, sin embargo el corte lo realizan de 5 a 27 pb después del sitio de reconocimiento.
La enzima utilizada en este laboratorio es la enzima de restricción clase II
Hind lll
del DNA lambda
es usada para electroforesis en geles de agarosa. Siendo una enzima de clase II reconoce una secuencia específica palindrómica (5´…A \AGCT T…3´y 3´…T TCGA\A…5´), realizando un corte
cohesivo (Berveg, et al, 2006).
MATERIAL Y REACTIVOS Preparación de la muestra Se realizó una solución madre a una concentración 3X que contenía 9 l de buffer, 0.9 l de BSA (albumina de suero bovino) y 45.6 l de agua destilada, posteriormente se dividió esta solución madre en tres tubos eppendorfs, de los cuales dos nos sirvieron para control negativo el primero contenía 10 l de ADN lambda y el segundo 1.5 l de Enzima Hind III estos dos completaron us volumen con agua, el control positivo se realizó con 1.5 l de enzima de restricción Hind III y 10 l de ADN lambda. Preparación del gel de agarosa Se pesó 0.8 gramos de agarosa y se colocó en un vaso de precipitación para diluir con 40 mL de buffer de corrida para obtener un ge l concentrado al 2 % y obtener mayor resolución. Luego se armó la cámara electroforética y se colocó el gel hasta que gelifique. Una vez gelificado, se sacó las peinetas y la cámara electroforética se llenó de buffer. Se tomó la muestra con la micropipeta de cada control y se mezcló con una gota de blue juice que sería nuestro tampón de carga esta mezcla, se colocó cuidadosamente para no romper ni penetrar el gel. La electroforesis se inició con un voltaje de 60-100vy se dejó correr durante una hora y luego se apagó y desconectó las líneas eléctricas.
RESULTADOS
Bibliografía
Observación en laboratorio
Los resultados obtenidos luego de la electroforesis fueron comparados con datos bibliográficos. Como se observa se colocaron las muestras de ADN digerido por la enzima en la primera y segunda columna estos son e control positivo que se preparó, en las otras dos columnas se colocó los controles negativos, la tercera que contiene solo enzima y la cuarta que contiene solo ADN, mientras que en la quinta se puso un marcador molecular para poder identificar los fragmentos de la corrida electroforética. Las bandas que obtuvimos en la corrida electroforética fueron de 23130, 9416,6557, 4361, 2322, 2027 y 125 bp, los cuales se establecieron mediante la bibliografía. En los resultados que obtuvimos se puede apreciar que no hubo contaminación en el ADN ni e n la enzima.
CONCLUSIONES
La enzima d restricción Hind III tiene la capacidad de cortar al bacteriófago lambda en varios fragmentos de ADN. Se necesita realizar una correcto pipeteo, armado de la cámara electroforética y preparación de la muestra para poder observar todos los fragmentos obtenidos en la digestión enzimática. Para una buena digestión enzimática se debe tomar en cuenta la temperatura, el PH y el tipo de enzima de restricción que se va a utilizar para obtener buenos resultados.
Referencias 1. Gil A. (2009), Enzimas de restricción, Extraído http://www.slideshare.net/adrianamariagil/enzimas-de-restriccion-medicina-gbm-2009-pdf2700223 (22/09/2013)
de:
2. Berveg J., Barcia-macay M. (2006), El bacteriófago lambda. Biología molecular, Cochabamba, Bolivia. Extraído de: http://genemol.org/biomolespa/fagos-lambda/fago-lambda.html (22/09/2013) 3. Duina D., Herrera T. (2008), Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.
