ENSAYO DE ENZIMAS (BROMELINA) Informe de Laboratorio de Bioquímica, CBS00254 y Grupo I
MARIA CLARA ECHEVERRI RUIZ, BRAYAN GUTIERREZ Tecnología Te cnología en !í"#ca In$!%&'#al $e Lao'a&o'#o * +ac!l&a$ $e C#enc#a% B%#ca%, Soc#ale% H!"ana% * -ol#&.cn#co Colo"#ano /a#"e I%a0a Ca$a1#$ Me$ellín, No1#e"'e $e 2345
Re%!"en6 En esta prctica se rea!i"# e! ensayo de en"imas con !a brome!ina e$traída de! %u&o de !a pi'a( E! procedimiento consisti# en !a e$tracci#n de! %u&o de una roda%a de pi'a se&uido de !a medici#n de! p) de! mismo, !ue&o se adiciono fosfato de sodio *asta que e! %u&o !!e&ara a un p) neutro( +espus se rea!i"# !a di!uci#n, en a&ua desti!ada, de un sobre de &e!atina sin sabor e! cua! se ca!ent#, se a&ito y se mantu-o a una temperatura de 50.C *asta a!can"ar !a di!uci#n comp!eta( /ina!mente se rea!i"aron -arios ensayos me"c!ando !a &e!atina sin sabor y e! %u&o de pi'a en tubos de ensayo !os cua!es sern e$p!icados ms ade!ante con sus respecti-os resu!tados y comparaci#n de !os mismos( (
-ala'a% Cla1e6 En"imas, Grado de Ge!acion, Brome!ina, )idro!isis
A%&'ac&6 In t*is practice, en"ymes ere tested it* brome!ain e$tracted from pineapp!e %uice( 1*e procedure consisted consisted in t*e e$traction e$traction of t*e %uice from a s!ice of pineapp!e fo!!oed by t*e p) measurement of t*e same, t*en sodium p*osp*ate as added unti! t*e %uice reac*ed a neutra! p)( 1*e di!ution in disti!!ed ater of an unf!a-ored &e!atin sac*et as t*en di!uted, *eated, s*aen and maintained at a temperature of 50 . C unti! comp!ete di!ution as ac*ie-e ac*ie-ed( d( /ina!!y /ina!!y,, se-era! se-era! assays assays ere performe performed d mi$in& mi$in& t*e f!a-or!e f!a-or!ess ss &e!atin &e!atin and pineapp!e %uice into test tubes *ic* i!! be e$p!ained be!o it* t*eir respecti-e resu!ts and comparison t*ereof( (
7e8o'$%6 En"ymes, +e&ree of Ge!ation, Brome!ain, )ydro!ysis
49 INT INTRODU RODUCC CCI: I:N N Las proteasas son en"imas que cata cata!!i"a i"an !a *idr# idr#!i !isi sis s de en!ace !aces s peptídicos en !as proteínas, se a&rupan
se&3n !os residuos de aminocidos, de! cent centro ro acti acti-o -o y !os !os meca mecani nism smos os de acci#n, dentro de !as cisteínopeptidasa se encuentra a !a papaina y brome!ina( La pi'a es una fruta tropica! de !a fami!ia
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de !as brome!iaceae, es rica en -itaminas , B, C y tiene acti-idad proteo!ítica debida a !a brome!ina que se acti-a por !a cisteína, tiosu!fato y &!utati#n( Es in*ibida o inacti-ada por iones met!icos o$idantes y por a&entes que reaccionan con !os tio!es 6cido asc#rbico7( La brome!ina de !os frutos es una proteasa cida, su intensa acti-idad proteo!ítica no se modifica en "onas de p) entre 8 y 9( Es una proteína constituida por aminocidos que se encuentran enro!!ados en dos partes separadas por un puente que tiene un !u&ar acti-o con un &rupo tio! 6S)7 !ibre( Esta biomo!cu!a se uti!i"a como ab!andadora de carnes, comp!emento a!imenticio y se *a descrito que muestran -arias acciones farmaco!#&icas, por e%emp!o, aumentan !a absorci#n de medicamentos, se *an uti!i"ado en tratamientos de des#rdenes di&esti-os, en enfermedades -ira!es y en !a formu!aci#n de -acunas( 1ienen potencia!idades como antiedematosas, antiinf!amatorias, antitromb#ticas y fibrino!íticas( :ecientemente, se demostr# !a posib!e acti-idad antitumora! de cisteínoproteasas como !a brome!ina contenida en !a pi'a en 5 tumores trasp!antab!es de rat#n; Leucemia p899, carcinoma pu!monar de Leis, adenocarcinoma<55, sarcoma8< y tumor ascítico de E*r!inc*, así como !a in*ibici#n en !a pro!iferaci#n de tumores cerebra!es(
29 OB/ETIVOS O;eo Gene'al •
=bser-ar !a acci#n proteo!ítica de !a brome!ina e$traída de! %u&o de pi'a
O;eo% E%
E$traer !a en"ima brome!ina de!
•
•
%u&o de pi'a :ea!i"ar procedimientos que permitan !a acci#n de !a brome!ina en diferentes medios Identificar en que medio o ba%o qu condiciones es positi-a !a acci#n proteo!ítica de !a brome!ina
>9 DATOS OBTENIDOS TUBO
GRADO DE GELACION
TIEM-O DE GELACION
BL>C= ? 2 8 4 5
1=1L >I>GA> >I>GA> 1=1L >I>GA> >I>GA> 1=1L
?9 @I> 8 @I> 22 @I>
?9 AN@LISIS DE RESULTADOS Las En"imas roteo!íticas se c!asifican en 2 &rupos; Endopeptidasas que atacan uniones peptídicas a !o !ar&o de !a cadena, E$opeptidasas que *idro!i"an uniones peptídicas adyacentes a !os &rupos mino 1ermina!es 6amino D peptidosas7 o a !os &rupos carbo$i!o termina! 6Carbo$i D peptidasas7( La pi'a contiene brome!ina o brome!aína, una en"ima proteo!ítica, es decir, capa" de romper !as mo!cu!as de !as proteínas de%ando !ibres !os aminocidos 6romper !as uniones co-a!entes entre !os aminocidos7 que !as forman( La brome!ina des*ace !as proteínas de i&ua! manera que !a pepsina, en"ima que forma parte de! %u&o &strico( :ecordemos que !as en"imas son cata!i"adores, o sea son capaces de descomponer o cambiar !a estructura de otras sin que estas se -ean afectadas( Entonces cuando me"c!amos !a
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Brome!ina %unto con otras proteínas, estas empie"an a actuar y &eneran reacciones que nos benefician y otras no( E! co!&eno presente en !a &e!atina tiene !a propiedad de retener !íquido dentro de sus ma!!as para !ue&o encapsu!ar!o y formar redes de s#!idos( Eso es !o que sucede cuando rea!i"amos una me"c!a de &e!atina y pi'a, !a Brome!ina in*ibe !a funci#n de! co!&eno debido a que rompe todos !os en!aces e impide que estas absorban e! a&ua de! producto, y terminamos obser-ando que !a me"c!a no cua%a( En !a prctica primero rea!i"amos un b!anco que fue !a referencia para saber que tanto tiempo tardaba !a &e!atina en &e!ificarse, este fue !a adici#n de ?m! de &e!atina y ?m! de a&ua desti!ada en un tubo de ensayo y despus de ?9min se &e!ifico por comp!eto( En e! tubo ? se a&re&# ?m! de &e!atina y ?m! de %u&o de pi'a neutra!i"ado, este no tu-o nin&3n tipo de &e!ificacion ya que !a brome!ina act3o sobre e! co!&eno de !a &e!atina atacando !os en!aces peptídicos de !a cadena, impidiendo que esta cua%e( En e! tubo 2 se a&re&# ?m! de &e!atina y ?m! de %u&o de pi'a neutra!i"ado y este se !!e-# a un ba'o de a&ua en ebu!!ici#n y se de%# durante 5 min, este no obtu-o nin&3n cambio ni &e!ificacion, esto pudo deberse a que !a so!uci#n se encontraba a una temperatura muy a!ta y no se esper# e! tiempo suficiente para que se diera dic*a reacci#n( En e! tubo 8 se adiciono ?m! de &e!atina y ?m! de %u&o de pi'a neutra!i"ado y se !!e-# a un ba'o de *ie!o donde se obser-# un cambio despus de tres minutos, esto se debe a que !a ba%a temperatura de! *ie!o causo !a rpida &e!ificacion de !a &e!atina y no permiti# !a acci#n de !a brome!ina en !a misma( E! p) es otro factor que inf!uye en !a acti-idad en"imtica, debido a que e! p) inf!uye en !a ioni"aci#n de !os &rupos
funciona!es de !os aminocidos que forman !a proteína en"imtica( Cada en"ima rea!i"a su acci#n dentro de un determinado inter-a!o de p), dentro de este inter-a!o *abr un p) #ptimo donde !a acti-idad en"imtica ser m$ima( or deba%o de! p) mínimo o por encima de! p) m$imo e! en"ima se inacti-a ya que se desnatura!i"a( En !a mayoría de !as en"imas e! p) #ptimo est pr#$imo a !a neutra!idad, aunque *ay e$cepciones( La mayoría de !os en"imas presentan un p) #ptimo para e! cua! su acti-idad es m$imaF por encima o por deba%o de ese p) !a acti-idad disminuye bruscamente( Este efecto se debe a que, a! ser !as en"imas de natura!e"a proteo!ítica, a! i&ua! que otras proteínas, se desnatura!i"an y pierden su acti-idad si e! p) -aría ms a!! de unos !ímites estrec*os( or !o tanto !a en"ima de !a brome!ina act3a a un p) < y en e! tubo 4, a! %u&o de pi'a %unto con !a &e!atina se !e a&re&o 5 &otas de >a=) y pasados 5 minutos, 5 &otas de )C!, a! tubo 5 se repiti# e! mismo procedimiento anterior pero primero se !e a&re&o )C! y !ue&o >a=), a! a&re&ar!a estas cantidades de cidos y bases a !os tubos 4 y 5 !a acti-idad en"imtica de !a brome!ina se pierde debido a! cambio de p) producido a! a&re&ar cantidades de cido o base !o que produce una e!e-aci#n o disminuci#n de! p)( ! tubo se !e a&re&o ? mL de &e!atina y ? mL de %u&o de pi'a, !ue&o se !e adicionaron 5 &otas de )&C! 2 este actua como un in*ibidor, estos son compuestos químicos que se unen a !a en"ima, en distintos puntos de! mismo y disminuyen o inc!uso impiden su acti-idad( Estos compuestos pueden ser de distintos tipos; iones, mo!cu!as or&nicas y a -eces e! producto fina! de !a reacci#n( !a acci#n que rea!i"an se !a denomina in*ibici#n( E! )&C! 2 rea!i"a una in*ibici#n re-ersib!e, e! in*ibidor se une
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a! en"ima de forma tempora! mediante en!aces dbi!es e impide e! norma! funcionamiento de! mismo, pero no !a inuti!i"a permanentemente, !o que se comprueba con !a prueba debido a que !a so!uci#n se &e!atini"o a !os 28 min(
9 CAUSAS DE ERROR •
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ara que !a brome!ina ten&a una acci#n en"imtica comp!eta debe estar a un p)<, por !o tanto, se debe ser muy ri&uroso con e! p)( 1ener muy presente !a temperatura de &e!atina a! momento de usar debido a que esta tiene que estar a una temperatura de 50.C( Con e! !a-ado de !os materia!es y e! uso de !os reacti-os, *ay que ser muy cuidadosos debido a que, en !os materia!es, pueden quedar residuos que afecten !as reacciones para e! an!isis, y e! ma! uso de !os reacti-os puede pro-ocar !a contaminaci#n de !os mismos(
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La acci#n que tiene !a brome!ina, obser-ndose que esta en"ima proteo!ítica cata!i"a !a *idr#!isis de !as proteínas, actuando sobre !a &e!atina, atacando !as uniones peptídicas de !a &e!atina a !o !ar&o de !a cadena de! co!&eno que !a &e!atina contiene( ! a&re&ar una fruta o e$tracto de fruta a !a &e!atina esta primero debe ser desnatura!i"ada, para que de esa manera se forme una so!uci#n co!oida!(
RE+ERENCIAS ?( H!eef, :(, +e!o*ery, 1( y Boub%er&, +( at*obio!( 4;884, ?( 2( Leipner, J( y Sa!!er, :( +ru&s 5;< 90, 2000( 8( )ernnde", @(, C*-e", @(, Be", :(, Car-a%a!, C(, @rque", @(, @orris, )(, Santos, :(, Gon"!e", J(, Kuesada ( y :odrí&ue" C( Biotecno!( p!icada 20;?90 ?92, 2008( 4( 1ysnes, B(, @aurer, :(, oro!,1(, robst, B(, B%eruin& :( y )oo-er, /( >eop!asia 8 67; 44<, 2002( 5( >itsaan&, S(, )attiHau!, :( y Hanasaud, ( En"yme and @icrobia! 1ec*no!o&y 8; ??08??0<, 200( 5(*ttp;MM(academia(eduM?904?2MInfo rmeNdeNacti-idadNen"imatica
59 CONCLUSIONES
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