Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Celular BIO 035
Trabajo práctico N°3: Microscopía
Integrantes: Cid Ankamila Galvez Cesar Lizama Paula Pérez Karen Sección: 13 Profesoras: Cortes Nicole Valenzuela María
26-04-2018
Introducción
Durante muchos años las personas se han percatado de sus necesidades y lo que es indispensable para avanzar en la ciencia, siendo una de estas el microscopio ya que ha servido para observar células y/o microorganismos a lo largo de los años. El microscopio óptico es el elemento o herramienta utilizado principalmente laboratorios de investigación para dar un detalle más específico de lo que observamos a simple vista. El primer microscopio fue inventado por casualidad por la unión de lentes el óptico holandés zacharias janssen 1980 – 1638 fue el primer creador de un microscopio como tal obteniendo como primer resultado imágenes borrosas a causa del lente de mala calidad. (1) Existe una variedad de microscopios con diferentes fines científicos, algunos de estos es el contraste de fases óptico, de barrido, de fluorescencia, electrónico entre otros. (2) Hoy por hoy se le dan diferentes tipos de uso a cada uno de estos microscopios, tan sólo sirve para observar células también se puede observar estructuras no celulares para diferentes finalidades. En este informe se verá cómo fue el trabajo práctico y teórico de utilización del microscopio para la visualización de diferentes compuestos, probando la resolución y los aumentos en distintos tipos de muestras teniendo en cuenta cada una de las estructuras que componen dicho microscopio. Hipótesis: al comprender y evaluar la estructura de un microscopio hay que tener en cuenta su capacidad de observar minuciosamente una gran variedad de estructuras a nivel celular, poniendo en prueba cada uno de sus aumentos y resoluciones para ver los datos más concretos que se podrían obtener.
1. 2. 3. 4.
Objetivos Observación y comprensión de como es el funcionamiento del instrumento óptico en este caso el microscopio y la formación de la imagen en esta. Lograr observar y reconocer diferentes tipos de muestras realizando comparaciones entre ellas. Alcanzar los resultados propuestos en la guía en 6 actividades diferentes. Determinar valores como el cálculo de aumento total, límite de resolución, poder de resolución y la determinación del diámetro en el campo visual de un microscopio.
Materiales y métodos Actividad 1: Se observó con detalle y precisión cada uno de los componentes del microscopio guiándose por el esquema entregado en la guía ,posterior a eso se observó parte de los “objetivos” para determina “el poder de aumento y apertura numérica de los lentes objetivos , luego se observó en la parte superior de los “lentes oculares” el aumento y apertura numérica, además se observó la apertura numérica del condensador, finalmente se anotó cada dato en la tabla 2,3 y 4 correspondiente a la primera actividad, en la tabla 5 se anotó la resolución máxima de su microscopio y la apertura numérica del condensador y para finalizar se determinó el límite de resolución usando los datos de la formula Límite de resolución entregada en la guía y con el valor NA como la apertura numérica de la interfase del aire, luego se determinó el poder de resolución usando los mismo datos pero aplicándolos con la fórmula de poder de resolución entregada en la guía. Actividad 2: Se utilizó el lente objetivo en 10x para observar una letra impresa fijada en porta objetos , se hiso una comparación con la orientación de la letra en su portaobjetos y la orientación en su campo visual , con esto responder una pregunta propuesta en la guía ,luego se observó la imagen en 40x esperando que surgiera producía algún cambio en su orientación. Actividad 3: Con un microscopio con el lente de lupa en 4x se observó una muestra de portaobjetos con papel milimetrado (1cm2) , al cual se debía determinar el diámetro del campo visual ,por tanto cada cuadrado era un metro cuadrado, entonces se escogió 4 cuadrados de la muestra y a ese valor se multiplico por un metro cuadrado , este resultado fue el valor del diámetro de la hoja milimetrada, entonces luego para sacar el diámetro del campo visual se utilizó la formula entregada en la guía y usando el el diámetro de la hoja milimetrada por el aumento del objetivo dividido por el aumento pedido y por el del resto de los lentes objetivos se calcula el dcv. Actividad 4: Las preparaciones histológicas de frotis de sangre humana y corte de intestino delgado de rattus norvegicus se observó en el microscopio, luego se anotaron observaciones y finalmente se hiso el dibujó correspondiente en la guía. Actividad 5: En esta actividad el DCV ya determinado, junto con el número de celular (previamente contadas con un “contador de células”) se utilizó para determinar el tamaño celular. Actividad 6: Usando un porta objetos se puso una muestra de catafilo de cebolla luego un cubre objetos con esto se utilizó el microscopio para hacer observación de la muestra con tinción y sin tinción, porteriormente se dibujó en la guía, también usando el mismo procedimiento se utilizó hojas de Elodea sp, haciendo una observación microscópica, aumentando gradualmente el aumento, se dibujó en la guía y finalmente se utilizó lo mismo para la observación de protozoo Euglena, se hizo observación microscópica y se dibujó en la guía.
Resultados Actividad 1.
Tabla Nº1: Poder de aumento y apertura numérica de los lentes objetivos. Aumento (X) 4 10 40 100
Apertura Numérica(NA) 0,10 0,25 0,65 1,25
Tabla Nº2: Poder de aumento y apertura numérica de los lentes oculares. Aumento (X) 10
Apertura Numérica (NA) 18
Tabla Nº3: Apertura numérica del condensador. Apertura Numérica (NA) 1,25 Tabla Nº4: Apertura máxima. Apertura del lente 100X Apertura numérica del condensador Apertura numérica de la interfase de aire Apertura de la interfase de aceite
1,25 1,25 1,0 1,3 – 1,5
La apertura numérica efectiva máxima es el valor más bajo de los anteriores, siendo así la apertura numérica de la interfase de aire (1,0). Utilizando este valor menor de apertura numérica de trabajo, considerando λ =400 nm para calcular el límite de resolución y poder de resolución.
A) Límite de resolución : 0,61 * 400 = 244 1,0
B) Poder de resolución:
1,0 = 4,098*10-3 0,61 * 400
Actividad 2. Título: Manejo del microscopio y formación de la imagen.
Dibujo N°1 Título: Letra impresa con tinta Tipo: Permanente Tinción: Sin tinción Aumento del Objetivo: 10X Aumento Total: 100X Observaciones: 1) En esta muestra se observa la letra “e”. 2) La imagen se ve rotada en 180°. 3) El papel se ve poroso. Pregunta 1: Compare la orientación de la letra en su portaobjetos (preparación) y en su campo visual (lo que observa a través del ocular del microscopio). ¿A qué se debe la diferencia? -Se debe a que al ser un lente convexo quien refracta la luz, hace que la muestra se vea rotada de esa manera. Pregunta 2 ¿Hay algún cambio en la orientación de la letra al observar la muestra con el objetivo 40X? -No existe un cambio, sigue teniendo su rotación en 180°, al cambiar al aumento no influiría en su orientación. Actividad 3. Título: Determinación del diámetro del campo vidual.
Determine el diámetro del campo visual del lente 4X: Diámetro= 4 * 1mm2= 4 mm2 DCV obj. X = 4mm2 *4X = 4 mm2 4X 2 -3 4mm * 10 = 0,04 um Calcule el diámetro del campo vidual del lente 10X, 40X Y 100X: 1) DCV obj. X = 4 mm2 * 4X = 1,6 mm2 * 10-3 = 0,16 um 10X 2) DCV obj. X = 4 mm2 * 4X = 0,4 mm2 * 10-3 = 4* 10-3 um 40X 3) DCV obj. X = 4 mm2 * 4X = 0,16 mm2 * 10-3 = 1,6* 10-3 um 100X
Actividad 4.
Título: Observación de preparaciones biológicas permanentes: frotis de sangre humana y corte de intestino delgado de Rattus Norvegicus (berkenhout). Dibujo N°2 Nombre: Frotis de sangre humana Tipo de muestra: Permanente Tinción: Con tinción Aumento del Objetivo: 40X Aumento Total: 400X Observaciones: 1) los glóbulos rojos se agrupan y están sobre posicionadas. 2) Hay glóbulos más rojos que otros. 3) A pesar de que existe mucha unión, de puede ver espacios entra ellas.
Dibujo N°3 Nombre: Corte de intestino delgado de berkenhout Tipo de muestra: Permanente Tinción: Con tinción Aumento del Objetivo: 10X Aumento Total: 100X Observaciones: 1) Se puede ver diferentes tonalidades en las estructuras. 2) Existen estructuras delimitadas las cuales a la vez se rodean por una superficie. 3) Se puede ver una especie de membrana delimitada. Actividad N°5. Título: Determinación del tamaño celular (TC).
Tc= (DCV obj. X ) = 4 * 10-3 = 7,17*10-6 N° de células 558
Actividad N°6. Título: Observación de preparaciones frescas con y sin tinción.
Dibujo Nº4 Nombre: Cetafilo de cebolla Tipo de muestra: Fresca Tinción: Azul de metileno Aumento de Objetivo: 10X Aumento Total: 100X Observaciones: 1) El tejido de la tela de cebolla presenta múltiples celdas, todas con diferentes formas y tonalidades. 2) Presente sobre celdas, estructuras delimitadas (como forma de anillo), que permite ver y apreciar las celdas que están bajo de forma desenfocado. 3) En una zona de la tela de cebolla que tiene menos capas, se empieza a notar menos las celdas y se puede observar estructuras que parecen “cristales” y está lleno de líneas porciones no muy claras. En conclusión, las celdas y las capas son transparentes. Título: Observación de preparaciones frescas sin tinción.
Dibujo Nº5 Nombre: Elodea sp Tipo de muestra: Fresca Tinción: Sin tinción Aumento del objetivo: 10 X Aumento total: 100X Observaciones: 4) Se puede apreciar que el objeto observado presenta celdas, en forma de filas, están ordenadas. 5) En su centro se nota una división que atraviesa de extremo a extremo. 6) En su contorno presenta pequeñas estructuras terminadas en punta y tienen un color diferente al resto del objeto o planta que no se ve a simple vista.
Dibujo Nº6 Nombre: protozoos Eugenia sp Tipo de muestra: Fresca Tinción: Sin tinción Aumento del objetivo: 10X Aumento Total: 100X Observaciones: 1) Tiene una vida temporal en el exterior. 2) Se mueven muy rápido. 3) De vez en cuando, se mueven o giran en parejas.
Discusión
Al inicio de este trabajo, nos preguntamos el funcionamiento del microscopio, el cual es capaz de observar detalles que a simple vista el ojo humano no ve, permitiéndonos ver detalles como estructuras, colores, tamaños de diferentes muestras, los cuales nos ayuda para la determinación de este trabajo y la factibilidad de ser esto valido. Esto se debe gracias a su función principal aumentar la resolución y a su vez el aumento de magnificación, la cual tiene la capacidades de permitirnos hacer perceptible objetos de gran tamaño y con nitidez. Al comprender esto realizamos la Actividad 1 que contaba en realizar cálculos para determinar el límite de resolución (la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para poder distinguirlos por separado) y el poder de resolución (capacidad que permite hacer perceptible por separado, dos puntos situados muy próximos entre sí en el objeto). (3) Luego en la actividad 2 comprendimos el manejo del microscopio y el cómo se forma la imagen, al observar la letra “e” invertida en 180° y cuestionarnos si éramos nosotros los que estábamos en posición invertida y la imagen simplemente estaba bien, y el como nosotros visualizamos cada objeto en la vida diaria, hasta darnos cuenta de cómo se forma La imagen en un microscopio se forma por la transmisión de los rayos provenientes de una fuente luminosa a través del objeto. Los rayos luminosos atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el diámetro del haz lumínico que penetra por el condensador. Este último, está formado por un sistema de lentes convergentes que concentra y proyecta el haz lumínico sobre el objeto a examinar, a través de la abertura de la platina. El objetivo recoge la luz que atravesó el objeto examinado y proyecta una imagen real, invertida y aumentada que se forma dentro del tubo y que es recogida por el ocular que es la segunda lente, la cual forma una imagen virtual, invertida y aumentada del objeto examinado. (4) Siguiendo con la actividad 3 observamos un papel milimetrado, del cual cada cuadrado media 1mm2 con el objetivo de determinar el diámetro de campo visual del lente 4X, y además calculando el diámetro visual del lente 10X, 40X y 100X. En la actividad 4 recién comenzamos con las observaciones de muestras permanentes Frotis de sangre humana y corte de intestino delgado de rata, lo cual nos ayudó al poder identificar y comprender que toda muestra permanente lleva consigo un procedimiento largo para obtener su fijación, además de saber que toda muestra permanente debe llevar tinción para poder identificar diferentes estructuras y facilitar una investigación. A su vez ver la imagen con más detalles posibles, determinando de esta manera el aumento total de cada muestra. Al pasar a la actividad 5 tuvimos que retroceder a la actividad 3 para poder calcular la determinación del tamaño de la célula, mostrando nuestras habilidades matemáticas y el contar glóbulos rojos lo cual es un proceso con demasiada determinación, puede ser un cálculo fácil, ya que las formulas están dadas desde un principio pero a la vez se necesitamos mucha concentración para este conteo, que finalmente se pudo lograr.
Finalmente en la actividad 6 se divide en 3 por las diferentes muestras que debemos ver que en este caso son frescas, dependiendo si no tenían tinción o en el caso de tener tinción, esto se realiza debido a que las células además de ser muy pequeñas, son translucidas, lo que hace imposible su observación y poder distinguir sus estructuras lo que conlleva a la realización de métodos químicos y físicos por los cuales se logra la visualización directa de diferentes substancias celulares a través del microscopio, con el fin de teñir y localizar sitios celular en específicos. (5)
Conclusión
En vista de nuestro trabajo, y nuestros avances en clases de laboratorio, nuestro grupo observó distintos tipos de células (y sus diferencias estructurales a través de la citoquímica, por ejemplo, al aplicarles azul de metileno) y puso en práctica los conocimientos previamente estudiados sobre microscopía, por lo tanto, se reconoce la importancia de la teoría celular y su avance en estudios con microscopios, ya que a causa de ello los hemos usado así a nuestro favor y dejando así registro de ello en cálculos previos de sus resoluciones, resoluciones máximas, y sus límites de aumento, los cuales nos fueron de gran utilidad en este práctico.
Bibliografía
(1) https://www.vix.com/es/btg/curiosidades/2010/10/09/quien-invento-el-microscopio (2) Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°3: Microscopía, curso BIO035 Biología general, 2018. (3) Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°3: Microscopía, curso BIO035 Biología general, 2018. (4) http://dea.unsj.edu.ar/biologia1/micro.pdf
(5) Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°3: Microscopía, curso BIO035 Biología general, 2018.
