Informe Lab #3

LABORATORIO #3 ELECTROFORESIS (SECUENCIA DE DNA)

Maricel Díaz Martínez

Objetivos Generales 1. Realizar correctamente una electroforesis con muestras de DNA 2. Lograr la correcta replicacin de un fragmento de DNA mediante !"R Objetivos #spec$%cos !"R & #ntender el fundamento terico de la !"R para la replicacin arti%cial de un fragmento de DNA & Realizar una adecuada e'traccin de DNA de la sangre de un voluntario para tener tener un DNA de alta pureza pureza & Realizar adecuadamente los pasos de la !"R (Desnaturacin) anillamiento) e'tensin* para obtener una r+plica arti%cial optima de un fragmento de DNA Objetivos #spec$%cos #lectroforesis & #ntender el fundamento terico de la electroforesis en el gel de agarosa para la separacin separacin de de mol+culas) mol+culas) en este caso ,cidos ,cidos nucleicos nucleicos & !or medio de la electroforesis en gel de agarosa lograr una adecuada visualizacin del DNA. Marco Teórico

#lectroforesis en gel de Agarosa Procedimiento -

#uipos / 0uer de !"R13 / Agua ultrapura 4g"l2 5 m4 dN6!s 4ezcla 1m4 / !rimer 7 GA!D8 / !rimer R GA!D8 6a !olimerasa 4olde de DNA Gradilla !untas de 1) 5 - 1ul !ipetas autom,ticas 6ubos de )2ml de !"R est+riles (#ppendorf9* 6ermociclador 4asterc-cler #ppendorf9 Resultados PCR

#lectroforesis en el gel de agarosa Agarosa al 1: ;<0R green 4arcador de peso molecular 0uer 60# 4uestra de DNA


0uer de corrida - de carga Gradillas "ubeta de electroforesis !ipetas autom,ticas 6ransiluminador de luz ultravioleta 7uente de poder !eines #'traccin del DNA Luego de realizar el procedimiento de puri%cacin del DNA a partir de la muestra de sangre) la asistente de laboratorio realiz una electroforesis con las muestras de ambos grupos con el %n de con%rmar la presencia de DNA. #ste es el resultado de la muestra del grupo => !"R Electroforesis

An,lisis de Resultados PCR

#'traccin de DNA La presencia de una banda ?uorescente en el carril del gel correspondiente a la muestra @=a nos permite veri%car la presencia de material gen+tico en la muestra del grupo) adem,s se obtuvo una concentracin de B)2 ngCl de DNA en cuestin lo ue re?eja ue Eubo una buena e'traccin del DNA. Aunue Eubo una buena e'traccin del DNA) el cociente 2C2F (A2* dio como resultado 1.5F. ;iendo el umbral de pureza 1)F) se puede decir ue la muestra no era DNA puro - por consiguiente una buena parte de la concentracin mencionada anteriormente esta determinada por prote$nas e'ternas al DNA #lectroforesis La presencia de una banda ?uorescente en el carril del gel correspondiente a la muestra @=a nos permite veri%car la presencia de material gen+tico en la muestra del grupo. Conclusiones PCR Conclusiones Electroforesis

& #n la pr,ctica de laboratorio se pudo efectuar correctamente la electroforesis en el de agarosa para la visualizacin del DNA) -a ue al observar la electroforesis bajo luz ?uorescente su puede ver una banda ?uorescente en el carril @= lo cual es debido a la presencia de material gen+tica en la muestra del grupo. & #l entendimiento del fundamento terico de la electroforesis - su adecuado procedimiento son claves para desarrollar de manera correcta la t+cnica de separacin molecular de ,cidos nucleicos (#lectroforesis en gel de Agarosa*) -a ue un mal manejo de los insumos o de los euipos pueden generar un error ue afecte el resultado %nal.


& La electroforesis en gel de agarosa es una de las t+cnicas m,s adecuadas para la visualizacin del DNA) -a ue adem,s de ser f,cil su preparacin) es f,cil de visualizar el DNA -a ue solo es necesario colorearlo con un colorante ?uorescente como el bromuro de etidio - el ;-bergreen) para posteriormente someterlo a una luz ?uorescente - de esta manera visualizar el DNA. & #l entendimiento del fundamento terico de la !"R - su adecuado procedimiento son claves para desarrollar de manera correcta la t+cnica de replicacin de un fragmento de DNA) en este caso del gen ;R<) -a ue un mal manejo de los insumos o un error en el procedimiento puede alterar el resultado %nal de la !"R generando una errnea o nula replicacin del fragmento de DNA. & La e'traccin del DNA a partir de la sangre de un voluntario) es de suma importancia para efectuar la !"R) -a ue entre mejor sea e'tra$do el DNA de la muestra de sangre - este contenga ma-or pureza (entre 1.F H 2*) se realizara una mejor replicacin - visualizacin de este posteriormente. & La realizacin de los pasos tanto de manera correcta como en el orden adecuado es esencial para la correcta replicacin de DNA) -a ue la alteracin de los pasos puede provocar un inadecuado proceso de replicacin del fragmento de DNA con el cual no se podr$a trabajar) ni utilizar para procesos de investigacin m+dica - biolgica - de tipo forense. PCR

#lectroforesis en gel de agarosa 1. #l primer paso ue vamos a seguir es una vez tenemos el tubo eppendorf con el material gen+tico necesitamos llegar a un volumen de 5 microlitros lo primero ue adicionaremos es cloruro de magnesio (4g"l2* en una solucin de 1)5milimoralCI microlitros (1)5m4CI microlitros* 2. Despu+s de este paso agregamos al tubo una solucin de 0uer para !"R de 1 microlitros. I. ;eguidamente a este paso se adiciona un 1 microlitro de !rimer 7 para GA!D8 (el conjunto de primers GA!D8 se usa con el %n de abarcar el l$mite entre el e'n 1He'n 2 ue limita la ampli%cacin por !"R*. =. A continuacin se adiciona el segundo primer ue es primer R con un volumen de 1 microlitro. 5. AEora adicionaremos a esto una solucin de dN6!s (deso'inucletidos trifosfato* de 1m4C1 microlitro. . ;e debe agregar a esto agua ultrapura en una cantidad tal ue nos permita completar los 5 microlitros de muestra ue necesitamos en este caso fueron I2)B5 microlitros. B. #l penJltimo paso es el cDNA ue se agregan de 1HI microlitros de este en este caso fue 1 microlitro. F. !or Jltimo se agrega el 6a polimerasa (la polimerasa ue copia las


secuencias de nucletidos m,s usada -a ue funciona mu- bien a altas temperaturas* de esta se adicion un volumen de )25 microlitros. K. Despu+s de tener todo esto en el tubo de !"R se lleva a la centrifugadora por 2 segundos. 1. #l siguiente paso es ir al 6#R4O""LADOR este aparato nos permite Eacer ciclos a diferentes temperaturas para realizar las reacciones de ampli%cacin de la !"R) por lo general usa temperaturas de = a K grados cent$grados las cuales se manejan por diferentes programas ue tiene el termociclador) en este proceso ocurre la desnaturalizacin) Eibridacin e'tensin del DNA. #n el caso de nuestra practica M / ;e utiliz el programada del termociclador ;5AB. / Lo primero ue debemos tener en cuenta es ue el termociclador tiene una tapa ue en la pr,ctica se encontr a 15 grados cent$grados) la funcin de esta es evitar la condensacin del agua en la tapa de los tubos de !"R para evitar ue los solutos se concentren lo ue podr$a generar una modi%cacin de los resultados. 1. Lo primero ue Eizo el programa fue un ciclo de = minutos a K= grados con el %n de realizar la denaturalizacin inicial. 2. Despu+s a los mismos K= grados pero por = segundos se realiz otra denaturalizacin. I. A continuacin) a 5B grados por = segundos se realiz el proceso de Eibridacin del DNA. =. #l siguiente paso fue a B2 grados por B minutos el proceso de ampli%cacin o e'tensin del DNA. 5. A partir de au$ se realizan otros I5 ciclos iguales desde el paso 2 al paso = para un total de I ciclos de termociclado. Despu+s de obtener el resultado del termociclador se va a conservar a = grados cent$grados la muestra. 1. Despu+s de saber todos los materiales - euipos ue vamos a utilizar) el primer paso ue Eicimos fue Eacer el gel de Agarosa ue en nuestro caso fue al 1: . & #mpezamos utilizando = microlitros de ;<0R Green (compuesto utilizado para la tincin del DNA* antes de aadir a la cubeta de electroforesis. &;eguido de esto agregamos =mL un tampn 6A# (ue se encarga de separar ,cidos nucleicos* ue se pondr, en el microondas para ue est+ listo m,s r,pido. &;e agregan )= g de Agarosa ue se va a disolver en el 6A#. &na vez todos estos est,n en la bandeja se procede a poner el peine para poder separar los pozos de la electroforesis. &La bandeja se cubre con un papel aluminio) -a ue) el ;<0R Green es sensible a la luz - se puede daar. &na vez EecEo esto retiramos el peine con el %n de evitar ue en el gel ueden burbujas - se pone %nalmente en la cubeta de electroforesis. 2. na vez tenemos el gel preparado) procedemos a colocar las muestras


ue tenemos de DNA en los pozos para esto es importante realizar los siguientes procedimientosM &#n el primer pozo se pone una especie de buer inicial - a partir del segundo pozo se pusieron las muestras. &#n nuestro caso nos correspondi el pozo @5 -a ue somos el grupo =. &Lo ue Eicimos b,sicamente fue tomar I microlitros de 0uer de carga ue es color naranja. &Despu+s tomamos B microlitros de la muestra de DNA - se mezclan con el 0uer de carga) esta mezcla al %nal ueda de un color violeta. &na vez bien mezclados dan como resultado 1 microlitros ue se llevan a la cubeta de electroforesis - se ponen en el pozo ue nos correspondi) este paso reuiere pulso con el %n de no romper el gel - no daar las dem,s muestras. I. Despu+s de poner todas las muestras en el gel se procedi a conectar la fuente de poder durante = minutos a FP (Poltios* ue correr, del c,todo (polo negativo* al ,nodo (polo positivo*. =. na vez se acaba el proceso de electroforesis se analizan los fragmentos de DNA por luz P. !"R !"R #lectroforesis en gel de Agarosa La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodolog$as m,s utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ,cidos nucleicos. 4ediante la electroforesis podemosM & ;eparar fragmentos de ADN - ARN en funcin de su tamao. & Pisualizar dicEos fragmentos mediante una sencilla tincin - de esta forma determinar el contenido de ,cidos nucleicos de una muestra) teniendo una estimacin de su concentracin - grado de entereza. & #'traer del gel los fragmentos de ADN ue sean de inter+s) para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. #s por esto ue para la presente pr,ctica) se utiliz la electroforesis para el an,lisis de fragmentos de ampli%cacin obtenidos mediante !"R del gen ue codi%ca la gliceraldeE$do IH fosfato desEidrogenasa. sualmente al %nal de la !"R) para saber si la reaccin transcurri e%cientemente) es decir) se gener la ampli%cacin espec$%ca de determinada secuencia o lo ue es lo mismo los fragmentos obtenidos son o no puros) estos son visualizados a trav+s de una electroforesis en geles de agarosa. "uando los fragmentos de ampli%cacin son corridos en el gel) +stos deben


ser cargados junto con un marcador molecular ue contenga un nJmero determinado de segmentos de ADN conocidos) lo ue facilita la identi%cacin de los fragmentos de ampli%cacin - si su tamao corresponde con el esperado. 7inalmente) la visualizacin de los fragmentos de ampli%cacin se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa e'puesto a luz P) adicionalmente un procesador de im,genes se encarga de analizar las bandas observadas. La reaccin en cadena de la polimerasa (!"R) por sus siglas en ingl+s* es una de las Eerramientas tecnolgicas m,s innovadoras para el estudio de los ,cidos nucleicos. ;e caracteriza por ser una t+cnica de alta sensibilidad) reproducibilidad - e%ciencia) ue genera resultados con%ables en poco tiempo - f,ciles de analizar. !or ello) se Ea convertido en el m+todo de eleccin de mucEos investigadores para los estudios gen+ticos - de biolog$a molecular. La misin de la !"R es copiar millones de veces una secuencia espec$%ca de ADN blanco mediante una poderosa cat,lisis llevada a cabo por una enzima conocida como ADN polimerasa) de tal manera ue cantidades peueas de ADN pueden ser sintetizadas - copiadas %elmente para analizarse con diferentes %nes. Los elementos importantes en la reaccin son el templado o molde (ADN o ADNc*) la enzima) los oligonucletidos o primers) los deso'irribonucletidos trifosfatados (dN6!sM adenina) timina) citosina - guanina* el in magnesio (4g Q*) una solucin amortiguadora o buer - 82O. 6odos estos elementos interactJan en tres etapas principales de las ue se compone la !"RM desnaturalizacin) Eibridacin - e'tensin. #n el gel de !"R no se evidencia ninguna banda) con lo cual se puede decir ue no Eubo una adecuada replicacin del fragmento de DNA deseado. #sto se puede deber a diferentes factores comoM al inadecuado uso de los insumos -a ue al ser nuevos - no Eaberse utilizado antes) no se conoc$a adecuadamente el procedimiento - esto pudo generar el error ue llevo a una replicacin nula del fragmento del DNA.

Informe Lab #3

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