INTRODUCCIÓN Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante más de 15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación más prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de más tiempo de incubación). Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es característico del virus. El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos más utilizados para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inoculación intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia, el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2).
OBJETIVOS -
Conocer y describir los métodos de cultivo para diagnostico viral. Realizar el método de cultivo, en huevos embrionados, como el diagnostico viral.
MARCO TEÓRICO: DIAGNOSTICO VIRAL: - Cultivos celulares (tejidos). - Inoculación en huevos embrionados. - Inoculación en animales de laboratorio.
a. b. c. d. e.
Membrana Carioalantoidea. Cavidad alantoidea. Saco vitelino. Cavidad Amniotica. Via endovenosa.
Nombre de la via a. Membrana Coriolantoidea. b. Cavidad Alantoidea. c. Saco Vitelino. d. Cavidad Amniótica. e. Endovenosa
Sigla
Aguja
Dosis
Edad del embrión
CA
23 G x ½¨
0.1 – 0.2 ml
10 – 14 días
CAL
23 G x ½¨
0.1 – 0.2 ml
10 – 14 días
SV
21 G x ½¨
0.1 – 0.2 ml
6 – 9 días
CAM
21 G x ½¨
0.1 – 0.2 ml
10 – 14 días
EV
25 G x ½¨
0.05 ml
6 – 10 días
REVISION BIBLIOGRFICA -
Cultivos celulares
El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos. El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.
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Inoculación en huevos embrionados
Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observándolos en un ovoscopio o con iluminación adecuada. De acuerdo al agente viral que se sospecha, será la vía de inoculación y, por ende, la edad del embrión a utilizar. -
Vías de Inoculación:
a. Cavidad Amniótica: El material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de 10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material. Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpéticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de inoculación. Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina. Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no tó xico.
c. Cavidad alantoidea: El virus se difundirá en el fluido e infectará las células ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad, Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de inoculación que debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,10,2 ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
d. Saco vitelino: Se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en línea recta (0,1 - 0,2 ml.). Se sella con parafina líquida u otro sellador no tóxico.
f. Endovenosa: Se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose al ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un rectángulo, enmarcando la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe
observarse cómo el inóculo al diluir la sangre circula por la vena). Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico. -
Inoculación en animales de laboratorio.
Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infección por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el hospedador experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en algunos casos puede causarle la muerte. Es un método sencillo, sensible y rápido, aunque son pocos los virus animales de nuestro interés que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles. No obstante, constituye una importante técnica en la identificación y caracterización de agentes (diagnóstico diferencial). -
Inoculación de Ratón Lactante
a. Vía Intracerebral: El punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.
b. Vía Intramuscular: Se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro posterior, aspirando previamente para asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa similar al anterior.
c. Vía intraperitoneal: Sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cúbito dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina.
MATERIALES -
Material Biológico: huevo embrionado. Lata de atún. Parafina. Alcohol yodado. Aguja.
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Lápiz. Alcohol. Algodón. Pirex.
PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5.
Observar al ovoscopio. Marcar punto de inoculación. Desinfectar con alcohol yodado. Perforar la cámara de aire. Inoculación vía CA (membrana corioalantoidea), 0.1 ml. a. Virus de la viruela aviar. b. Poxvirus. c. Poxviridae. 6. Sellar con parafina. 7. Inocular 37°C x 3 días. - Volteo diario. - Humedad. 8. Refrigerar doce horas antes de la cosecha. 9. Cosecha. Lesiones producidas.
RESULTADOS
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El feto del pato murió, por el proceso de congelación. Se observaron las diferentes partes del huevo, como el saco vitelino, la membrana carioalantoidea, cavidad alantoidea, cavidad amniótica. Se observó edema, áreas de hemorragia y pústulas en la membrana corioalantoidea.
CONCLUSIONES -
Se conocieron los métodos de cultivo para diagnóstico viral. Se realizó el método de cultivo, en huevos embrionados.
BIBLIOGRAFIA -
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75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971 Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Disease". Third Edition. http://www.veterinaria.org/revistas/vetenfinf/vet_enf_inf_tripod/vetenfinftripodcomar/ 2aisvir.htm Romulo Aycachi Inga el Oct 16, 2008. Es.scribd.com https://es.scribd.com/doc/6851738/Virologia-Practica-05-Inoculacion-de-virus-enhuevos-embrionados http://www.ehu.eus/biofisica/pdf/cultivo_celular.pdf
